CN101011027B - 超声波辅助农杆菌转化棉花胚芽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于棉花转基因技术领域，公开了超声波辅助农杆菌转化棉花胚芽的培育转基因棉花的新方法。包括：将剥掉种皮消毒后棉种接种到无菌苗萌发培养基上，将刚萌发两片子叶剥离，置润湿的无菌滤纸上，将10ml 0.5 OD600nm的农杆菌菌液加入到塑料离心管或玻璃小三角瓶中并将剥好的胚芽加到农杆菌液中，将离心管或者小三角瓶放在超声波清洗器中的中央，用100-150W的超声波处理1-5min，将处理过的胚芽转移至共培养培养基培养，再用含头孢霉素的无菌水冲洗，吸干胚芽表面水分，转移至恢复培养基上，在光照下恢复培养得到幼芽，将其转到选择培养基继代，得到抗性芽，将其切下转移至生根培养基上诱导生根或嫁接在棉花砧木上，得到再生转基因植株。本发明将GFP(绿色荧光蛋白)基因在胚芽的瞬时表达率提高100多倍；首次实现了海岛棉(长绒棉)的转基因植株；获得了一批转抗虫基因的棉花植株。分子及田间实验检测表明，外源基因已经稳定转入到受体棉花基因组中并能稳定表达和遗传。

Description

超声波辅助农杆菌转化棉花胚芽的方法

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域中的棉花转基因技术领域。具体涉及一种利用超声波辅助农杆菌转化棉花胚芽获得转基因棉花植株的新的转基因方法，该方法显著地缩短了棉花转基因的周期，拓展了棉花转化的范围。与新植物技术领域有关。

背景技术

目前植物的遗传转化主要有以下3种方式：即农杆菌介导的基因转移；以原生质体、细胞或组织为受体的直接基因转移(如电激、微注射、PEG介导转化原生质体等，基因枪和超声波法可把外源DNA直接导入带壁的植物细胞，从而避免原生质体再生植株的漫长过程，使转基因更为快速简易)；种质系统的基因转移(germ line transformation)，如利用注射子房、种胚、体细胞胚及花粉等途径导入外源基因。其中农杆菌介导的遗传转化是目前使用的最广泛，转化机制研究得最清楚的转化方法，这种转化方法具有转化效率高、外源基因以低拷贝插入为主、遗传稳定等特点，但也存在对外植体有较严格的基因型限制、转化周期长、体细胞变异大等不足。直接转移和种质系统的基因转移方法基本上不受基因型的限制，但转化效率低，转化机制不明确(王关林，2002)。

目前，越来越多的植物遗传转化的报道有两个比较明显的倾向：第1个就是将多种转化方法结合起来，例如SAAT法，也即超声波辅助的农杆菌介导转化法，此法先用超声波处理植物细胞、组织，再用农杆菌浸染，这样能显著地提高农杆菌的浸染率。Agrolistic法是将农杆菌转化与基因枪法结合起来的一种新方法，它利用Ti质粒上的VirD1与VirD2的协同作用，将T-DNA从Ti质粒上切除下来，将外源基因的两端接上左右两个边界，同时构建VirD1和VirD2两个能在植物中表达的载体，将以上3种载体通过基因枪打入植物细胞内，获得转化植株等等。第2个就是避免在转化中使用复杂的植株再生方式，而直接采用茎尖分生区、胚芽分生区为转化受体，摆脱基因型的依赖，同时缩短转化周期，减少体细胞变异(Gould et al，2002；Satyavathi et al，2002；Barik et al，2005；Araga et al，2005)。

具体到棉花的转基因技术而言，目前国际上广泛采用的是农杆菌介导的转化法，但这种方法需要有棉花组织培养技术作为基础平台，众所周知，棉花是一种公认比较难以进行离体培养的物种，主要表现在组织培养的条件苛刻、周期长、体细胞无性系变异严重、再生效率低、而这种转化方法的最大的不足就是对基因型的依赖很严重。尽管棉花的转基因技术已经发展了二十年，但目前只有少数几个陆地棉品种能够通过体细胞培养发生而获得转基因再生植株，如珂字棉系列品种、冀合321、晋棉7号等(张献龙等，1993)而这些品种在生产上属于淘汰的老品种，农艺性状不能满足当前生产的需要，直接利用的价值不大，获得的转基因材料要通过杂交和多代回交，才能够在生产上利用，大大降低了棉花转基因育种的利用价值，正是由于以上限制因素的存在，影响了棉花的遗传转化的广泛应用。同时棉花的另一个栽培种海岛棉(长绒棉)至今都没有获得转基因植株，主要原因在于海岛棉很难通过组织培养的方式获得再生植株，因而无法通过常规的农杆菌侵染结合组织培养技术获得转基因植株(张献龙等，1991；迟吉娜等，2005，Sakhanokho et al，2001；Wu et al，2004；Jin et al，2005)。国内科研工作者创造的棉花转基因技术—花粉管通道法目前在省市一级棉花育种单位广泛运用(Zhou et al，1983；Liu et al，2002；Zhang et al，2000)但这种方法存在转化效率极低(千分之一以下)、外源基因拷贝数多、转化材料稳定性很差等严重不足，逐渐被很多研究单位放弃了。因此开发高效的、非基因型依赖的棉花转基因技术对促进棉花分子育种有重要的意义。

发明内容

本发明的需要解决的问题是提供一种超声波辅助农杆菌转化棉花胚芽未再生植株的方法，以提高棉花转基因的效率，克服棉花转化过程中的基因型限制的不足，尤其是实现了海岛棉的遗传转化，同时缩短棉花转基因的周期。

本发明通过以下技术方案实现：

将硫酸脱绒后的棉花种子剥掉种皮后浸泡于0.1％的升汞溶液10min，再用无菌水冲洗4次以上，接种到无菌苗萌发培养基上，培养24h，在超净工作台上，小心地将刚萌发种子的两片子叶剥离，暴露出胚芽，放在润湿的无菌滤纸上，保湿备用。将10ml农杆菌(OD₆₀₀＝0.5)菌液加入到50ml玻璃三角瓶或者10ml的聚乙烯塑料离心管中，然后将剥好的胚芽转到农杆菌菌液中，将小三角瓶玻璃或塑料离心管置于超声波清洗仪中，在100-150W的功率下处理1-5min，然后在共培培养基上共培养72小时，再转移到恢复培养基上恢复生长7天，最后转到含有抗生素的选择培养基上，筛选3次，每一个月更换一次新鲜的筛选培养基，直到抗性芽长出。利用上述转基因方法能够将GFP(绿色荧光蛋白)基因在胚芽的瞬时表达率(转化效率)提高100多倍，在国际上首次实现了海岛棉(长绒棉)的转基因植株。

培养基的组分及配比如下：

无菌苗培养基：1/2MS大量元素+葡萄糖15g/L，补充水分至1L，pH5.95；

共培养培养基：MSB+激动素0.1mg/l+葡萄糖3％+植物凝胶Phytagel 0.25％，补充水分至1L，pH5.8；

恢复培养基：MSB+激动素0.1mg/l+葡萄糖3％+头孢霉素400mg/l+植物凝胶Phytagel0.25％，补充水分至1L，pH 5.8；

选择培养基：MSB+激动素0.15mg/l+葡萄糖3％+植物凝胶Phytagel 0.3％+卡那霉素100mg/l，补充水分至1L，pH5.95；

生根培养基：1/2MS无机盐+B5有机物+葡萄糖1.5％+植物凝胶Phytagel 0.25％，补充水分至1L，pH 5.9。

同时利用该方法获得了一批有价值的转抗虫基因(Bt)的棉花植株，分子及田间实验检测结果表明，外源基因已经稳定转入到受体棉花基因组中并能够稳定表达和遗传。

更详细的技术方案见实施例。

本发明的效果是：

本发明的有益效果之一是克服棉花转化中基因型的限制。通过这种转化技术，我们将外源目的基因能够直接导入到当前推广的陆地棉棉花品种中去，大大提高了转基因材料的利用价值，同时在国际上首次实现了海岛棉的遗传转化。

本发明的有益效果之二是节省了棉花转基因时间，避免体细胞无性系变异。在本技术流程中从无菌苗制备到转基因再生苗移栽到大田，只要3个月左右，大大节省了转基因植株的获得时间，而通过愈伤组织诱导，获得体细胞胚胎，再获得转基因再生植株至少需要5-8个月时间，同时，在选择培养过程中需要大量的抗生素用于转化细胞的筛选，因此，由于本方法节省了转化时间，而相应地节省了用于转化体筛选的价格昂贵的抗生素，同时避免了因为长期离体培养和抗性筛选带来的体细胞无性系变异，有效地保证了转基因植株的遗传稳定性。

本发明的有益效果之三是在于将超声波技术引入到棉花遗传转化体系中，该技术能够用于农杆菌介导的其他遗传转化体系中，具有很好的应用前景。

附图说明

图1.超声波辅助的棉花胚芽的遗传转化的流程

图中A：无菌条件下萌发24h的棉花种子用作外植体；B：去掉子叶后暴露的胚芽；C：对胚芽进行超声波处理；D：胚芽和农杆菌共培养；E：对胚芽进行恢复培养；F：对萌发的胚芽进行抗性筛选；G：抗性芽存活，非抗性芽死亡。

图2是GFP基因在胚芽的瞬时高频率表达

图中A：没有进行超声波处理的幼胚的GFP表达；B-C：超声波处理过的幼胚的GFP表达；D-E：超声波处理胚芽后的GFP瞬时表达

图3是本发明获得转基因(Bt)抗虫棉材料

图中A-B：移栽到田间转基因抗虫棉材料；B：对转基因材料进行抗虫性鉴定，左边为转基因棉株的叶片，右边为常规品种(未转基因)的叶片，大部分已被棉铃虫取食。

图4GFP报告基因T-DNA区段的结构图(LB：T-DNA左边界，T-DNA右边界)

图5是本发明中使用的第一种抗虫基因CryIIA表达载体pCAMBIA1300的物理图谱

图6是本发明中使用的第二种抗虫基因表达载体pB29K-B的结构图

图7转bt基因再生植株的PCR检测图

M：1Kb的分子量标准；P：质粒；C：非转基因对照；1-23：转化再生植株

图8转bt基因再生植株的Southern分子杂交图

1-18：PCR检测阳性的转化再生植株的杂交图谱。

图9是本发明中使用的卡拉霉素检测转转bt基因再生株和对照品种反应的照片

A，转bt基因棉株叶片；B，未转基因棉株对照

具体实施方式

实施例1超声波辅助农杆菌转化绿色荧光蛋白基因(GFP)

实验材料

本实施例中的2个陆地棉品种B11、鄂棉23(购自湖北省种子公司)；两个海岛棉材料85H、H8645(由新疆农科院经济作物研究所提供)。

根癌农杆菌和转化载体

农杆菌菌株EHA105及质粒载体pBIN m-gfp5-ER，该载体含卡拉霉素抗性基因npt Ⅱ，以及报告基因GFP，均由华中农业大学郭文武教授惠赠，其T-DNA结构图4如下：

转化方法

(1)将硫酸脱绒后的棉花种子剥掉种皮后浸泡于0.1％的升汞溶液10min，再用无菌水冲洗4次以上，接种到无菌苗萌发培养基上，培养24h；

(2)在超净工作台上，小心地将刚萌发种子的两片子叶剥离，放在润湿的无菌滤纸上，保湿备用；

(3)将10ml(OD_600nm＝0.5)的农杆菌菌液，加入到塑料离心管或者25ml的玻璃小三角瓶中，然后将剥好的胚芽加到菌液中，封好口；

(4)将小三角玻璃瓶(玻璃介质)放在超声波清洗器中(KQ3200DE，江苏昆山市超声仪器有限公司)，在超声波功率150W，处理时间为1min；

(5)转化及植株再生过程：将经过步骤(4)处理过的胚芽，放到共培培养基中培养72h，然后用含有500mg/L头孢霉素的无菌水将冲洗3遍，；

(6)将步骤(5)得到的经过超声波处理的胚芽的表面的水分用无菌滤纸吸干后，放在恢复培养基上，在光下生长7天左右，得到萌发幼芽；

(7)将步骤(6)得到的幼芽转到选择培养基上，筛选3次，每月更换一次新鲜的选择培养基，得到抗性芽；

(8)将抗性芽切下放到生根培养基中生根或者嫁接在试管或田间培育的棉花的砧木上(参照：金双侠(Jin)等，2006描述的方法进行)移栽小植株(整个转基因的流程见图1)。

本实施例及实施例2中使用的培养基配方如表1所示。

表1.超声波辅助农杆菌转化过程中使用的各种培养基的配方

说明：(1)表1中编号为MSB的培养基为常用的MS培养基的大量元素和微量元素(无机盐)，参见张献龙主编，《植物生物技术》，科学出版社，2004年版。(2)表1中的培养基按照1升培养基配制，除添加成分外，其余用水补充至1升(L)。

为了比较不同超声波处理对GFP基因瞬时表达频率的影响以及外植体的伤害程度，进行了超声波功率、处理时间、不同的介质等因素的试验。建立了优化的转化体系，用于棉花抗虫(Bt)基因的转化。

影响外植体存活率和转化效率的各项技术参数研究：

(1)不同超声波功率、处理时间对外植体存活率和转化效率的影响

本试验数据(见表2)表明超声波的功率以及处理时间是影响GFP瞬时表达效率和外植体存活率的重要参数，低强度的超声波以及较短的处理时间，虽然不容易导致外植体的死亡，但GFP瞬时表达效率很低。然而超声波的强度和处理时间应该适中，否则会导致外植体的大量死亡，高强度的，长时间的超声波处理会导致植物细胞壁和质膜的不可逆击穿而死亡，同时超声波产生的热效应会导致介质中的水分温度升高而伤害细胞。本试验结果显示在150W功率下，处理1min后能够获得GFP基因在胚芽的高频率的瞬时表达，比对照瞬时表达率提高了100多倍(图2D-E)。同时，观察到超声波能够在外植体表面均匀地创造伤口，极大地提高了农杆菌转化效率(图2B-C)，而对照只在切口附近有少量GFP表达(图2A)。

表2  超声波功率和作用时间对棉花外植体存活率和GFP转化效率的影响

(2)不同的介质对对棉花外植体存活率和转化效率的影响

将等量农杆菌菌液分别注入到10ml的无菌聚乙烯离心管和25ml的玻璃小三角瓶中，然后把剥好的幼胚投入到农杆菌菌液中，进行超声波处理，功率为150W，处理不同的时间，结果如表3所示。在相同功率，在处理相同时间条件下，不同介质中的棉花外植体的瞬时表达效率以及受到的伤害有较大差异，在聚乙烯离心管中的外植体受到的伤害要小，转化效率也相应地要低。这可能是因为超声波在不同的介质中传递时，其能量的损耗是不一致的。因此，每次处理时应该把装有外植体容器放在同一水层上才能够获得相同强度的超声波。

表3不同的介质对棉花外植体存活率和GFP基因转化效率的影响

(3)不同的基因型对对外植体存活率和转化效率的影响

利用两个海岛棉材料85H、H8645和两个陆地棉品种B11、4007进行超声波处理，研究不同的基因型对超声波的耐受能力及转化效率。

研究发现陆地棉材料对超声波的耐受能力明显低于海岛棉材料，在150W的处理条件下，处理1min分钟时，两个陆地棉品种就有20％左右的死亡率，而海岛棉没有发现外植体死亡。不同的陆地棉品种之间对超声波的耐受也有差异。不同基因型材料在适当的超声波处理条件下，均能达到20％以上的瞬时表达率，说明超声波处理可以有效地克服基因型对转化的限制。

通过对以上因素的分析我们确定了最佳的嫁接方案：用萌发24小时的棉花种子(去掉种皮)为转化受体，剥掉两片子叶，暴露出胚芽，10ml农杆菌菌液加入到50ml玻璃三角瓶或者10聚乙烯塑料离心管中，置于超声波清洗仪中，在150W的功率下分别处理1分钟和5分钟，然后在共培培养基上共培养72小时，再转移到含有抗生素的筛选培养基(见表1)上，筛选2-3次，每一个月更换一次新鲜的继代培养基，直到抗性芽长出。

表4 不同的棉花基因型对外植体存活率和GFP基因转化效率的影响

实施例2 超声波辅助农杆菌转化绿色荧光蛋白基因(GFP)

参照实施例1的材料和方法，在本实施例中，对实施例1的步骤(4)的超声波处理功率和处理时间以及处理的介质作如下调整，即使用介质为小三角玻璃瓶，超声波处理功率为100W，处理时间为2min。

实施例3 超声波辅助农杆菌转化绿色荧光蛋白基因(GFP)

参照实施例1的材料和方法，在本实施例中，对实施例1的步骤(4)的使用介质、超声波处理功率和处理时间作如下调整，即，使用介质为塑料离心管，超声波处理功率为100W，处理时间为3min。

实施例4 超声波辅助农杆菌转化绿色荧光蛋白基因(GFP)

参照实施例1的材料和方法，在本实施例中，对实施例1的步骤(4)的使用介质，超声波处理功率和处理时间作如下调整，即，使用介质为塑料离心管，超声波处理功率为100W，处理时间为5min。

实施例5 超声波辅助农杆菌转化绿色荧光蛋白基因(GFP)

参照实施例1的材料和方法，在本实施例中，对实施例1的步骤(4)的使用介质，超声波处理功率和处理时间作如下调整，即，使用介质为塑料离心管，超声波处理功率为150W，处理时间为3min。

实施例6 抗虫(bt)基因的转化和及分子检测

实验材料

本实施例中的2个陆地棉品种豫棉9号和豫棉12号由河南省农科院棉花油料作物研究所提供提供。

根癌农杆菌和转化载体

2个抗虫基因分别为抗虫基因Cry2A，由华中农业大学林拥军教授惠赠，农杆菌菌株为EHA105。质粒结构如图4所示。

另一个为双价虫抗基因，试验菌株编号为LBA4404，其中Bt和API-B均有双增强子的CaMV35S启动子启动和Nos终止子终止，选择基因为NPTⅡ；该双元载体的pB29K-B质粒结构见图5。由中国科学院微生物研究所田颖川研究员惠赠。

转化及植株再生的方法

参照实施例1的方法，在本实施例中，对实施例1的步骤(4)的使用介质，超声波处理功率和处理时间作如下调整，即，使用介质为小三角玻璃瓶，超声波处理功率为100W，处理时间为1min，将外源抗虫(bt)基因导入到2个陆地棉品种豫棉9号和豫棉12号中。

转化植株的分子生物学检测

以质粒DNA为阳性对照，未转化的植株叶片DNA为阴性对照，在bt基因区段设计引物对抗性植株DNA样品进行PCR扩增。检测结果表明，阳性对照和绝大多数转化植株能够扩增出预期大小的690bp电泳带，而阴性对照没有扩增带(图6)。PCR检测结果初步表明，外源bt基因T-DNA片段可能已经整合到棉花基因组中。

在bt基因内设计引物，PCR扩增质粒DNA产物作为探针，对18株PCR为阳性的植株进行Southern杂交分析。转基因植株采用HindⅢ酶切，限制性内切酶HindⅢ在T-DNA区段只有1个切点，Southern杂交探针位于T-DNA右侧，这样的酶和探针组合能够检测T-DNA在转基因植物基因组中的拷贝数。

Southern杂交结果表明，18株PCR阳性植株，Southern杂交也为阳性，说明PCR检测可用于转化体的初步检测。Southern杂交结果如图7所示。检测的18份样品中，单拷贝的有13份；两个拷贝的有4份；3个拷贝有1份，

转化植株的卡拉霉素抗性及抗虫性检测

卡那霉素抗性的检测

在转bt基因植株的顶端刚展开的幼嫩的叶片上涂抹1％(w/v)的卡那霉素水溶液，7天后，观察叶片涂抹部位的颜色反应来判断结果(黄色为敏感、绿色为抗性)。

利用1％(w/v)的卡那霉素水溶液涂抹转基因株的新展开叶，7天后观测叶片所涂抹部位的颜色变化，未转化的对照品种叶色变黄，而转基因株的颜色不变(图8)。在试验中发现18株转基因再生株都没有变黄，正是外源两个目的基因均为PCR阳性的植株；这说明卡那霉素涂抹是一种快速检测以NPTⅡ为选择基因的转基因棉花的方法。

转bt基因植株抗虫性的检测

取盛花期以前的转基因棉株顶部幼嫩展开叶片，放入有湿润滤纸的试管内，接5～8头一龄棉铃虫，三天以后检测叶片的取食情况和虫的死亡情况及大小，叶片有少量取食的痕迹且虫全部死亡的为高抗棉，记作“+”；有明显少量取食的痕迹且虫有大部分死亡的记作“++”；叶片有一半以上取食痕迹且虫大部分存活记作“+++”；叶片取食仅剩叶脉且虫全部存活的记作“++++”。植株的抗虫性按抗虫指数或试虫死亡率表示。抗虫级数的确定：“+”：100；“++”：70±10(小虫70+10，大虫70-10)；“+++”：30±10(小虫30+10，大虫30-10)；“++++”：0。抗虫指数＝(∑100i+∑(70±10)j+∑(30±10)k+∑0l)/∑。(i：抗性为“+”的株数；j：抗性为“++”的株数；k：抗性为“+++”的株数；l：抗性为“++++”的株数；∑＝i+j+k+l)。死亡率＝每个材料棉铃虫的死亡总数/每个材料的接虫总数×100％。

实验结果转基因株的叶片基本不受危害，棉铃虫在转bt基因棉花叶片上不能存活(图3)。转抗虫基因植株的抗虫指数(RI)为87.8％-99.0％，抗性水平显著高于非转基因材料(表5)，表5中抗虫指数和棉铃虫致死率两个指标反应的趋势是一致的，反应了本实验中抗虫指数界定的合理性。

表5本实施例中部分转Bt基因植株的抗虫(棉铃虫)性检测

^bRI：抗虫指数，显著性测验F test(P＜0.05)

参考文献

1 王关林等主编，植物基因工程原理与技术，北京，科学出版社，2002

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Claims (1)

1.一种超声波辅助农杆菌转化棉花胚芽的方法，其步骤包括：

(1)将棉花种子剥掉种皮后消毒，接种到无菌苗培养基上，培养24h，使其萌发；

(2)在无菌条件下将刚萌发种子的两片子叶剥离，置润湿的无菌滤纸上，保湿备用；

(3)将10ml的OD_600nm＝0.5的农杆菌菌液加入到塑料离心管或玻璃小三角瓶中，然后将剥好的胚芽加到所述的农杆菌液中，封好口；

(4)将塑料离心管或小三角玻璃瓶放在超声波清洗器中的中央，用100-150W的超声波处理1-5min；

(5)将步骤(4)处理过的胚芽转移至共培养培养基中培养72h，再用含有头孢霉素的无菌水冲洗3遍；

(6)用无菌滤纸将步骤(5)的胚芽表面水分吸干，转移至恢复培养基上，在光照条件下恢复培养7天，得到萌发的幼芽；

(7)将步骤(6)得到的幼芽转到选择培养基上，筛选3次，每月更换一次新鲜的选择培养基，得到抗性芽；

(8)将步骤(7)获得的抗性芽切下转移至生根培养基上使其生根或者将所述的抗性芽嫁接在棉花砧木上，得到再生植株，

培养基的组分及配比如下：

无菌苗培养基：1/2MS大量元素+葡萄糖15g/L，补充水分至1L，pH5.95；

共培养培养基：MSB+激动素0.1mg/l+葡萄糖3％+植物凝胶Phytagel 0.25％，补充水分至1L，pH5.8；

恢复培养基：MSB+激动素0.1mg/l+葡萄糖3％+头孢霉素400mg/l+植物凝胶Phytagel0.25％，补充水分至1L，pH 5.8；

选择培养基：MSB+激动素0.15mg/l+葡萄糖3％+植物凝胶Phytagel 0.3％+卡那霉素100mg/l，补充水分至1L，pH5.95；

生根培养基：1/2MS无机盐+B5有机物+葡萄糖1.5％+植物凝胶Phytagel 0.25％，补充水分至1L，pH 5.9。

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