CN109371061A - 一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法 - Google Patents

一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种植物转基因技术领域，特别涉及一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法。通过超声波处理种子获得萌动种子、含目的基因农杆菌的培养、侵染种子与共培养、脱菌与选择培养和转基因植株分子检测的步骤，获得转基因植株。使用本发明方法可有效缩短转基因转化的时间，同时提高农杆菌介导的玉米遗传转化的效率。

Description

一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法
【技术领域】
本发明涉及植物转基因技术领域，具体涉及一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法。
【背景技术】
玉米是禾本科玉蜀黍属一年生单子叶草本植物，是世界上重要的粮食作物之一。随着世界人口的增长和人们生活水平的不断提高，对玉米品种和质量提出了更高的要求。同时，随着国外种业不断涌入市场，国家对种植业结构的调整，各种生物因素和非生物因素的影响，导致玉米面积大减产。为改善玉米品质以确保国家粮食安全、满足人民更高质量的需求，提高市场竞争力，为新能源发展提供支撑，通过遗传改良来选育高产、高抗、优质玉米新品种，将成为解决这些问题的关键，同时也是未来玉米育种的重点发展方向。
单纯的传统育种手段，已暴露出缺点：育种周期长，育种效率较低，且对杂交后代表现型难以预测，已经很难发展满足需求，通过分子育种技术与传统育种技术相结合，来提高玉米的产量和质量已成为今后主要的发展趋势。转基因技术是通过分子生物学手段将目的基因转到受体材料中，在短时间内获得所需的生物性状。它具有定向选择、改善目标性状高效、精准的特点，可以缩短育种时间，能在一定程度上加快玉米选育。
随着越来越多玉米优良基因的发现，转基因育种技术逐渐在玉米育种中发展起来。目前，玉米上常用遗产转化方法分为DNA直接导入法和和农杆菌介导的转化法。DNA直接导入法主要包括PEG介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。其中PEG法和电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。基因枪法虽然受体广泛，转化率较高，但外源DNA的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大(上限是16-20kb)，转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养，培育周期短，技术较成熟，可以转化较大的外源基因片段，外源基因重排少，且以单拷贝或低拷贝插入受体细胞，稳定性好，可利用不同的启动子控制目的基因在特定的器官进行差异表达，较少出现沉默现象的优点。
农杆菌的侵染具有趋化性，一般只侵染双子叶植物和裸子植物，对单子叶植物没有感染力。近年来，虽然农杆菌的介导转化在一些单子叶植物上成功转化，但转化率仍然不高，此外，由于采用植物外植体(如幼胚、愈伤组织、茎尖等)作为侵染材料，后期需经过组织培养技术才能培育成再生植株，因此整个实验周期较长。目前，也有对此方法进行改进的，如专利20121012184.1《一种玉米遗传转化的方法》，通过对玉米种子整体进行侵染，后期采用农杆菌侵染的种子直接生根发芽成完整植株，从而获得成功转化的植株。虽然该方法在一定程度上，缩短了玉米遗传转化的时间，但由于种子外部拥有坚硬的种皮保护，侵染效率不高，因此获得的遗传转化效率并不高。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要发明一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，在缩短遗传转化时间的同时，提高玉米转基因转化率，将有较大的应用价值。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)种子的处理：玉米种子用体积浓度为45～55％的次氯酸钠溶液浸泡消毒5～15min后，用无菌蒸馏水清洗2～3次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，将种子放入种子培养液中，于40℃～55℃下黑暗中超声波处理后，静置10～20min，捞出种子，放入40℃～55℃热水中浸泡30～50min，得到萌动种子；
(2)农杆菌的培养：将含有目的基因的农杆菌单菌放入农杆菌培养液中，于25℃～28℃、220～280rmp下震荡培养，待OD600至0.6～0.8时，于25℃～28℃、5000～6000rmp下离心，弃上清液，得农杆菌悬浮液，将所述农杆菌悬浮液与等体积的甲液混均，配制成农杆菌侵染液；
(3)侵染与共培养：用步骤(2)的农杆菌侵染液浸泡感染步骤(1)的萌动种子，捞出种子，用无菌滤纸将种子上的菌液吸干后，放在共培养液中，于25℃～28℃下共培养3～4d；
(4)脱菌与选择培养：将步骤(3)共培养后的种子放在沙土上培养，沙土厚度为0.5cm～1.0cm，向沙土中倒入筛选培养液，使沙土含水量在65％～75％，人工气候箱25℃～28℃下培养7～10d，期间用筛选培养液浇湿沙土3～5次，筛选出能正常生根发芽的植株；
(5)转基因植株分子检测：取步骤(4)植株的叶片，用CTAB法提取全基因组DNA，通过PCR扩增和Southern杂交，检测目的基因片段是否成功导入植株。
进一步地，所述步骤(1)的超声波频率为40～50kHz，处理时间为20～30min。
进一步地，所述步骤(1)的种子培养液由以下成分组成：乙酰丁香酮15.7～29.5mg/L、甘露醇91.0～109.3g/L、NaCl 0.59～1.18mg/L、纤维素酶5～25mg/L和果胶酶5～15mg/L。
进一步地，所述步骤(2)的农杆菌培养液由以下成分组成：牛肉浸膏9～10g/L、酵母提取液9～10g/L、NaCl 4～5g/L、卡那霉素45～55mg/L和利福平45～55mg/L。
进一步地，所述步骤(2)中的甲液由以下成分组成：蔗糖20～30g/L、草甘膦3.0～4.5mg/L和乙酰丁香酮29.4～39.3mg/L。
进一步地，所述步骤(3)的农杆菌侵染液侵染萌动种子的方法如下：将双层无菌滤纸放入培养皿中，萌动种子放于双层无菌滤纸上，侵染液轻轻倒入培养皿中，刚好淹没种子，浸泡15～25min，期间震荡2～3次，捞出种子，用无菌水清洗2～3次。
进一步地，所述步骤(3)的共培养液由以下成分组成：大米粉80～150g/L、红糖20～35g/L、乙酰丁香酮29.4～39.3mg/L和NaCl 0.59～1.18mg/L。
进一步地，所述步骤(4)的筛选培养液由以下成分组成：蔗糖20～30g/L、头孢霉素500～600mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸3.5～4.5mg/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明农杆菌介导的玉米遗传转化方法，以玉米萌动种子整体为农杆菌侵染材料，取材不受季节限制，且容易获得；后期采用农杆菌感染的萌动种子直接生根发芽成完整植株的方法，无需经过外植体组织培养技术，省去了外植体愈伤组织培养、分化生芽培养、生根培养和再生植株炼苗的步骤，时间花费少，有效的缩短了获得转基因玉米植物的时间。采用本发明方法，获得玉米遗传转化率高，在39.7％～41.3％之间。
2、本发明步骤(1)采用超声波处理种子至萌动状态，有效的缩短了种子萌动和发芽的时间；超声波处理前，种子先用水浸泡，使种子吸胀种皮软化，再放入含纤维素酶和果胶酶的乙酰丁香酮培养液，能有效酶解植物细胞壁，一方面有利于幼根快速冲破种皮，另一方面没有了细胞壁的阻挡，农杆菌更容易感染植物，侵染成功率更高。
3、植物损伤信号的糖类和酚类化合物可指导农杆菌对植物细胞的趋向性移动，并可诱导农杆菌Vir基因的表达，但单子叶植物一般不能分泌出吸引农杆菌的多酚类物质，对农杆菌病不敏感。本发明步骤(2)与农杆菌悬浮液混合的甲液与步骤(3)的共培养液成分中都含有乙酰丁香酮，乙酰丁香酮是一种多酚类化合物，是农杆菌化学诱导信号中诱导效果最佳的酚类物质，是农杆菌Vir区基因活化的诱导剂，能促进外源基因的整合，步骤(2)中乙酰丁香酮与草甘膦的协同作用下，能提高诱导效果，增强农杆菌对玉米种子的侵染能力。步骤(3)的共培养基中，还含有大米粉、红糖和氯化钠这三种简单、易获得的成分，它们为种子的萌发提供了丰富的营养物质，用于取代成分繁多的MS培养基，大大节省了资源，降低了成本。
4、农杆菌与玉米种子共培养后，农杆菌会大量繁殖破坏种子的健康成长，会大大降低农杆菌介导的遗传转化效率。本发明步骤(4)选择培养液成分中的抗生素头孢霉素，具有杀死或抑制农杆菌生长的作用，与除草剂2,4-二氯苯氧乙酸协同下，脱菌效果好，大大减少了农杆菌复发率，其复发率只有8.3％。
【具体实施方式】
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1：
一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)种子的处理：玉米种子用体积浓度为45％的次氯酸钠溶液浸泡消毒5min后，用无菌蒸馏水清洗2次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，将种子放入种子培养液中，于40℃下黑暗中40kHz超声波处理20min，静置10min，捞出种子，放入40℃热水中浸泡30min，得到萌动种子；
上述种子培养液由以下成分组成：乙酰丁香酮15.7mg/L、甘露醇91.0g/L、NaCl0.59mg/L、纤维素酶5mg/L和果胶酶5mg/L。
(2)农杆菌的培养：将含有目的基因的农杆菌单菌放入农杆菌培养液中，于25℃下220rmp下震荡培养，待OD600至0.6时，于25℃下5000rmp离心，弃上清液，得农杆菌悬浮液，将所述农杆菌悬浮液与等体积的甲液混均，配制成农杆菌侵染液；
上述农杆菌培养液由以下成分组成：牛肉浸膏9g/L、酵母提取液9g/L、NaCl 4g/L、卡那霉素45mg/L和利福平45mg/L；
上述甲液由以下成分组成：蔗糖20g/L、草甘膦3.0mg/L和乙酰丁香酮29.4mg/L。
(3)侵染与共培养：将双层无菌滤纸放入培养皿中，步骤(1)的萌动种子放于双层无菌滤纸上，将步骤(2)的农杆菌侵染液轻轻倒入培养皿中，刚好淹没种子，浸泡15min，期间震荡2次，捞出种子，用无菌水清洗2次，再用无菌滤纸将种子上的菌液吸干，种子放在共培养液中，于25℃下共培养3天；
上述共培养液由以下成分组成：大米粉80g/L、红糖20、乙酰丁香酮29.4mg/L和NaCl0.59mg/L。
(4)脱菌与选择培养：将步骤(3)共培养后的种子放在沙土上培养，沙土厚度为0.5cm，向沙土中倒入筛选培养液，使沙土含水量在65％，人工气候箱25℃下培养7d，期间用筛选培养液浇湿沙土3次，筛选出能正常生根发芽的植株；
上述筛选培养液由以下成分组成：蔗糖20g/L、头孢霉素500mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸3.5mg/L。
(5)转基因植株分子检测：取步骤(4)植株的叶片，用CTAB法提取全基因组DNA，通过PCR扩增和Southern杂交，检测目的基因片段是否成功导入植株。
实施例2：
一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)种子的处理：玉米种子用体积浓度为50％的次氯酸钠溶液浸泡消毒10min后，用无菌蒸馏水清洗3次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，将种子放入种子培养液中，于47.5℃下黑暗中45kHz超声波处理25min，静置15min，捞出种子，放入47.5℃热水中浸泡40min，得到萌动种子；
上述种子培养液由以下成分组成：乙酰丁香酮22.6mg/L、甘露醇100.2g/L、NaCl0.89mg/L、纤维素酶15mg/L和果胶酶10mg/L。
(2)农杆菌的培养：将含有目的基因的农杆菌单菌放入农杆菌培养液中，于26.5℃下250rmp下震荡培养，待OD600至0.7时，于26.5℃下5500rmp离心，弃上清液，得农杆菌悬浮液，将所述农杆菌悬浮液与等体积的甲液混均，配制成农杆菌侵染液；
上述农杆菌培养液由以下成分组成：牛肉浸膏9.5g/L、酵母提取液9.5g/L、NaCl4.5g/L、卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L；
上述甲液由以下成分组成：蔗糖25g/L、草甘膦3.8mg/L和乙酰丁香酮34.4mg/L。
(3)侵染与共培养：将双层无菌滤纸放入培养皿中，步骤(1)的萌动种子放于双层无菌滤纸上，将步骤(2)的农杆菌侵染液轻轻倒入培养皿中，刚好淹没种子，浸泡20min，期间震荡2次，捞出种子，用无菌水清洗2次，再用无菌滤纸将种子上的菌液吸干，种子放在共培养液中，于26.5℃下共培养3.5天；
上述共培养液由以下成分组成：大米粉115g/L、红糖27.5g/L、乙酰丁香酮34.4mg/L和NaCl 0.89mg/L。
(4)脱菌与选择培养：将步骤(3)共培养后的种子放在沙土上培养，沙土厚度为0.75cm，向沙土中倒入筛选培养液，使沙土含水量在70％，人工气候箱26.5℃下培养8.5d，期间用筛选培养液浇湿沙土4次，筛选出能正常生根发芽的植株；
上述筛选培养液由以下成分组成：蔗糖25g/L、头孢霉素550mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸4.0mg/L。
(5)转基因植株分子检测：取步骤(4)植株的叶片，用CTAB法提取全基因组DNA，通过PCR扩增和Southern杂交，检测目的基因片段是否成功导入植株。
实施例3：
一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)种子的处理：玉米种子用体积浓度为55％的次氯酸钠溶液浸泡消毒15min后，用无菌蒸馏水清洗3次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，将种子放入种子培养液中，于55℃下黑暗中50kHz超声波处理30min，静置20min，捞出种子，放入55℃热水中浸泡50min，得到萌动种子；
上述种子培养液由以下成分组成：乙酰丁香酮29.5mg/L、甘露醇109.3g/L、NaCl1.18mg/L、纤维素酶25mg/L和果胶酶15mg/L。
(2)农杆菌的培养：将含有目的基因的农杆菌单菌放入农杆菌培养液中，于28℃下280rmp下震荡培养，待OD600至0.8时，于28℃下6000rmp离心，弃上清液，得农杆菌悬浮液，将所述农杆菌悬浮液与等体积的甲液混均，配制成农杆菌侵染液；
上述农杆菌培养液由以下成分组成：牛肉浸膏10g/L、酵母提取液10g/L、NaCl 5g/L、卡那霉素55mg/L和利福平55mg/L；
上述甲液由以下成分组成：蔗糖30g/L、草甘膦4.5mg/L和乙酰丁香酮39.3mg/L。
(3)侵染与共培养：将双层无菌滤纸放入培养皿中，步骤(1)的萌动种子放于双层无菌滤纸上，将步骤(2)的农杆菌侵染液轻轻倒入培养皿中，刚好淹没种子，浸泡25min，期间震荡3次，捞出种子，用无菌水清洗3次，再用无菌滤纸将种子上的菌液吸干，种子放在共培养液中，于28℃下共培养4天；
上述共培养液由以下成分组成：大米粉150g/L、红糖35g/L、乙酰丁香酮39.3mg/L和NaCl 1.18mg/L。
(4)脱菌与选择培养：将步骤(3)共培养后的种子放在沙土上培养，沙土厚度为1.0cm，向沙土中倒入筛选培养液，使沙土含水量在75％，人工气候箱28℃下培养10d，期间用筛选培养液浇湿沙土5次，筛选出能正常生根发芽的植株；
上述筛选培养液由以下成分组成：蔗糖30g/L、头孢霉素600mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸4.5mg/L。
(5)转基因植株分子检测：取步骤(4)植株的叶片，用CTAB法提取全基因组DNA，通过PCR扩增和Southern杂交，检测目的基因片段是否成功导入植株。
对照组1：
实施例1步骤(1)中的种子培养液的主要成分替换成：乙酰丁香酮15.7mg/L和NaCl0.59g/L。
对照组2：
实施例1步骤(2)甲液的主要成分替换成：蔗糖20g/L和乙酰丁香酮29.5mg/L。
对照组3：
实施例1步骤(2)甲液的主要成分替换成：蔗糖20g/L和草甘膦3.0mg/L。
对照组4：
实施例1步骤(3)共培养液的主要成分替换成：红糖20g/L、乙酰丁香酮29.4mg/L和NaCl 0.59mg/L。
对照组5：
实施例1步骤(3)共培养液的主要成分替换成：大米粉80g/L、乙酰丁香酮29.4mg/L、和NaCl 0.59mg/L。
对照组6：
实施例1步骤(3)共培养液的成分替换成：MS培养基。
上述MS培养基按照专利20121012184.1《一种玉米遗传转化的方法》的方法配制。
对照组7：
实施例1步骤(4)的筛选培养液的主要成分替换成：蔗糖20g/L和头孢霉素500mg/L。
对照组8：
实施例1步骤(4)的筛选培养液的主要成分替换成：蔗糖20g/L和2,4-二氯苯氧乙酸3.5mg/L。
各实施例与对照组处理100粒玉米种子，3次重复，统计最终获得的转基因植株数量。
测试试验：
统计实施例1步骤(4)和对照组7、8筛选植株的农杆菌复发植株数，计算农杆菌复发率，具体见表1。
农杆菌复发率(％)＝农杆菌复发植株数/总植株数×100％
表1
由表1可知，筛选培养液成分中的头孢霉素与2,4-二氯苯氧乙酸相互促进相互协同，能有效降低农杆菌的复发率，采用本发明的筛选培养液，农杆菌复发率仅为8.3％。
测试试验：
转基因植株分子检测，统计各实施例和对照组中内含转基因的玉米植株数量，并计算转基因植株遗传转化率，具体见表2。
转基因植株遗传转化率(％)＝内含转基因植株数/总植株数×100％
表2
由表2可知，采用本发明的共培养液能取代MS培养基；以玉米种子为农杆菌感染材料，配套使用本发明的的培养液成分、侵染和共培养方法，能有效提高农杆菌介导的玉米遗传转化率，转化率在39.7％～41.3％之间。
综上所述，以玉米种子为农杆菌感染材料，采用本发明的农杆菌介导的玉米遗传转化的方法，能有效提高玉米遗传转化效率，缩短遗传转化的时间。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)种子的处理：玉米种子用体积浓度为45～55％的次氯酸钠溶液浸泡消毒5～15min后，用无菌蒸馏水清洗2～3次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，将种子放入种子培养液中，于40℃～55℃下黑暗中超声波处理后，静置10～20min，捞出种子，放入40℃～55℃热水中浸泡30～50min，得到萌动种子；
(2)农杆菌的培养：将含有目的基因的农杆菌单菌放入农杆菌培养液中，于25℃～28℃、220～280rmp下震荡培养，待OD600至0.6～0.8时，于25℃～28℃、5000～6000rmp下离心，弃上清液，得农杆菌悬浮液，将所述农杆菌悬浮液与等体积的甲液混均，配制成农杆菌侵染液；
(3)侵染与共培养：用步骤(2)的农杆菌侵染液浸泡感染步骤(1)的萌动种子，捞出种子，用无菌滤纸将种子上的菌液吸干后，放在共培养液中，于25℃～28℃下共培养3～4d；
(4)脱菌与选择培养：将步骤(3)共培养后的种子放在沙土上培养，沙土厚度为0.5cm～1.0cm，向沙土中倒入筛选培养液，使沙土含水量在65％～75％，人工气候箱25℃～28℃下培养7～10d，期间用筛选培养液浇湿沙土3～5次，筛选出能正常生根发芽的植株；
(5)转基因植株分子检测：取步骤(4)植株的叶片，用CTAB法提取全基因组DNA，通过PCR扩增和Southern杂交，检测目的基因片段是否成功导入植株。
2.根据权利要求1所述的一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述超声波频率为40～50kHz，处理时间为20～30min。
3.根据权利要求1所述的一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述种子培养液由以下成分组成：乙酰丁香酮15.7～29.5mg/L、甘露醇91.0～109.3g/L、NaCl 0.59～1.18mg/L、纤维素酶5～25mg/L和果胶酶5～15mg/L。
4.根据权利要求1所述的一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述农杆菌培养液由以下成分组成：牛肉浸膏9～10g/L、酵母提取液9～10g/L、NaCl 4～5g/L、卡那霉素45～55mg/L和利福平45～55mg/L。
5.根据权利要求1所述的一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述甲液由以下成分组成：蔗糖20～30g/L、草甘膦3.0～4.5mg/L和乙酰丁香酮29.4～39.3mg/L。
6.根据权利要求1所述的一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述农杆菌侵染液侵染萌动种子的方法如下：将双层无菌滤纸放入培养皿中，萌动种子放于双层无菌滤纸上，侵染液轻轻倒入培养皿中，刚好淹没种子，浸泡15～25min，期间震荡2～3次，捞出种子，用无菌水清洗2～3次。
7.根据权利要求1所述的一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述共培养液由以下成分组成：大米粉80～150g/L、红糖20～35g/L、乙酰丁香酮29.4～39.3mg/L和NaCl 0.59～1.18mg/L。
8.根据权利要求1所述的一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述筛选培养液由以下成分组成：蔗糖20～30g/L、头孢霉素500～600mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸3.5～4.5mg/L。
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