CN102433356A - 农杆菌介导的玉米成熟种子胚的转基因方法 - Google Patents

Abstract

一种农杆菌介导的玉米成熟种子胚的基因转化方法，包括如下步骤：(1)构建植物基因表达的质粒载体；(2)构建含有步骤(1)中植物基因表达的质粒载体的根癌农杆菌菌株；(3)玉米成熟种子的裸露的胚的制备和创伤；(4)步骤(2)中的农杆菌介导的裸露并且经创伤的玉米成熟种子胚的基因转化；(5)再生苗的除草剂抗性复筛；(6)除草剂筛选处理后存活的苗移栽；(7)玉米转基因植株的聚合酶链式反应(PCR)鉴定。本发明避免了玉米愈伤组织组织分化和植株再生周期长和再生根难的问题；有效避开了已报道的玉米幼胚为受体的转基因操作的季节的限制、缩短了转化操作时间。

Description

农杆菌介导的玉米成熟种子胚的转基因方法

技术领域

本发明涉及玉米基因转化工程领域，具体是一种农杆菌介导的玉米成熟种子胚的转基因方法。

背景技术

玉米是主要的粮食作物之一，与水稻、小麦、高粱等作物相比，玉米(Zeamays L.)栽培历史短，但生产发展速度最快，全世界对玉米的需求量也在与日俱增。为了满足需求，改良某些性状，实现增产，转基因技术是解决常规育种遗传资源不足、选育速度慢的有效手段。

玉米转基因技术近年来得到了很大的发展，已建立了农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、电击法、碳化硅纤维介导法和花粉管导入法等一系列转化技术见表1，这些方法各有其优缺点。基因枪法设备昂贵，PEG法、电击法、超声波法的受体获得困难，花粉管导入法必须在花期特定时间进行，转化率低并且后期筛选工作量大。相对而言，农杆菌介导法以其效率较高而成为目前应用最为广泛的植物转基因技术，但是该方法一般采取的是：外植体→愈伤组织→农杆菌介导的转化→丛生芽→筛选→生根→转化株的技术操作流程，主要的困难和问题是愈伤组织形成时间往往长达数星期甚至数月，十分耗时，工作量繁重；玉米胚性愈伤组织的诱导分化较水稻等作物困难，丛生芽的分化率十分不稳定；分化植株的生根难；由于转基因受体植物的基因型的差异，不能够适用多样性品种或品系，也就是适合同种的不同品种/品系的，表现出较为明显的玉米基因型转化特异性。

玉米中不管是叶还是根等成熟组织都很难再生成株。张荣等(2001)利用幼胚为直接受体通过农杆菌介导法成功获得转化株，此法虽然避免了繁杂的组培过程，但幼胚的获得受季节的严格限制。

因此，在玉米转基因研究中，有必要继续开发快速、高效的转化方法。

表1已报道的玉米转基因方法

发明内容

本发明的目的是提供一种农杆菌介导的玉米成熟种子胚的基因转化方法，能够在培养基上再生出可以生根的植株，避免玉米愈伤组织组织分化和植株再生周期长和生根难的问题；有效避开了已报道的玉米幼胚为受体的转基因操作的季节的限制、缩短了转化操作时间。

本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种农杆菌介导的玉米成熟种子胚的基因转化方法，包括如下步骤：

(1)构建植物基因表达的质粒载体；

(2)构建含有步骤(1)中植物基因表达的质粒载体的根癌农杆菌菌株；

(3)玉米成熟种子的裸露的胚的制备和创伤；

(4)步骤(2)中的农杆菌介导的裸露并且经创伤的米成熟种子胚的基因转化；

(5)再生苗的除草剂抗性复筛；

(6)除草剂筛选处理后存活的苗移栽；

(7)玉米转基因植株的聚合酶链式反应(PCR)鉴定。

本发明的另一个方面涉及玉米成熟种子的裸露的胚的制备和创伤的应用。

具体实施步骤：将成熟的玉米种子在无菌双蒸水中浸泡过夜16～20h，将浸泡过夜的玉米种子在无菌操作台上用刀片轻轻划开玉米种皮，再用灭菌缝衣针剥去胚乳，留取胚，将胚再用0.1％的氯化汞灭菌处理8min，双蒸水清洗四遍，最后用灭菌的缝衣针轻轻扎刺胚，对胚进行创伤。

本发明的另一个方面涉及创伤后的玉米成熟种子裸露胚与农杆菌介导的转基因的应用。

具体实施步骤：所有涉及的实施过程均在无菌条件下进行。将200粒裸露并且创伤的玉米成熟种子的胚转入含100μM的乙酰丁香酮的OD₆₀₀为0.5的农杆菌转化菌液中，再加20ml的MS液体培养基和6μl的50mg/ml的乙酰丁香酮；在28℃，100rpm的摇床上培养18-20h；接着将创伤的玉米成熟种子的胚转移到含MS、30g/L蔗糖、100μM乙酰丁香酮、7g/L琼脂、pH6.0的共培养基上，在28℃黑暗共培养3天。

共培养后，先用双蒸水将胚冲洗一次，再用含抗生素Cef(农杆菌对其敏感)的双蒸水洗一次，接着在用双蒸水洗一次，最后将其转至含MS、0.1mg/L的IAA、250mg/L的抗生素Cef、20ppm的Basta、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH6.0的抑菌及筛选培养基上培养一周。将培养一周后先打开瓶盖，让抗性苗28℃下，16h光照培养3天后转至经灭菌的土，在28℃，16h光照培养获得除草剂Basta抗性玉米苗。

本发明的突出优点在于：

1、涉及的转化受体玉米成熟种子的胚可以在培养基上再生出植株，避免了玉米愈伤组织组织分化和植株再生周期长和再生根难的问题；有效避开了已报道的玉米幼胚为受体的转基因操作的季节的限制、缩短了转化操作时间。

2、通过剥离掉胚乳使胚芽裸露，再用拨针针刺胚芽生长点，而损伤利于外源基因整合进玉米基因组，从而能显著实现外源基因导入玉米的转基因效率。

3、不受玉米品种的限制，因而适用性广。

附图说明

图1是植物基因表达的质粒载体pGSA1252::RA33G4的构建。

图2是玉米成熟种子的裸露并且经创伤的胚在农杆菌介导下的基因转化。

图3是再生苗的除草剂抗性复筛。

图4是经图3所示的除草剂筛选处理后存活的苗移栽至盆土。

图5是玉米转基因植株的聚合酶链式反应(PCR)鉴定。

具体实施方式

以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。应当理解，下述实施例是为了更好地理解本发明，而不是为限制本发明。

本发明所述的农杆菌介导的玉米成熟种子胚的基因转化方法，包括如下步骤：

(1)构建植物基因表达的质粒载体；

(2)构建含有步骤(1)中植物基因表达的质粒载体的根癌农杆菌菌株；

(3)玉米成熟种子的裸露的胚的制备和创伤；

(4)步骤(2)中的农杆菌介导的裸露并且经创伤的玉米成熟种子胚的基因转化；

(5)再生苗的除草剂抗性复筛；

(6)除草剂筛选处理后存活的苗移栽；

(7)玉米转基因植株的聚合酶链式反应(PCR)鉴定。

如图1所示，步骤(1)构建的植物基因表达的质粒载体pGSA1252::RA33G4；

为了验证本发明方法，我们以实验室常见的植物表达载体质粒pGSA1252和我们自己克隆的RA33G4基因为例用于本发明方法的步骤(1)的克隆构建步骤实例操作过程。RA33G4基因是我们从玉米中克隆获得的一个早期旱诱导的蛋白基因；pGSA1252质粒本身带有一个抗氯霉素的基因和抗除草剂Basta的筛选标记基因Bar。在RA33G4基因克隆位点之前有一个3×CaMV35S启动子控制其表达。

如图2所示，涉及步骤(2)、(3)和(4)的农杆菌介导的裸露并且经创伤的米成熟种子胚的基因转化；

按常规的方法将步骤(1)构建的pGSA1252::RA33G4导入根癌农杆菌菌株LBA4404实施步骤(2)后获得含有pGSA1252::RA33G4的根癌农杆菌菌株LBA4404。将步骤(3)制备的玉米成熟种子的裸露并且创伤的胚与步骤(2)中获得的农杆菌在共培养基上共培养。共培后，将胚转移至抑菌及筛选培养基上培养。

如图3所示，涉及步骤(5)的再生苗的除草剂抗性复筛。

经步骤(4)共培养处理后产生的再生苗，转到土中培养至3叶期后再叶面喷施除草剂Basta进行抗性复筛。

如图4所示，是步骤(5)除草剂筛选处理后存活的苗移栽至盆土。

如图5所示，是将步骤(6)所获得的除草剂抗性植株进行PCR鉴定，即玉米转基因植株的聚合酶链式反应(PCR)鉴定。

1-8为转基因植株；9为未转基因的对照植株。10为质粒阳性对照；M：1kb的marker；

实施例1

植物基因表达的质粒载体pGSA1252::RA33G4的构建

质粒DNA按照实验室常规的方法提取。酶切和DNA连接方法按照所用酶的生产厂商提供的说明书进行。将提取的pGSA1252的DNA进行Ncol和Spel双酶酶切，然后将其与同样经过Ncol和Spel双酶酶切的RA33G4基因DNA片段在T4DNA连接酶的作用下连接成转基因表达质粒载体pGSA1252::RA33G4。

含有植物基因表达质粒载体pGSA1252::RA33G4的根癌农杆菌菌株LBA4404的构建。

所有涉及的实施过程均在无菌条件下进行。

(1)将不含质粒的农杆菌LBA4404单菌落，接种于含有适当浓度的利福平的实验室常见的YEB培养基中，在28℃的200rpm摇床培养至OD₆₀₀为0.4-0.6左右。挑取含有辅助质粒pRK2073的大肠杆菌E.coli的帮助菌株DH5α和含有目的质粒pGSA1252::RA33G4的供体大肠杆DH5α的单菌落分别接种至含有相应抗生素的LB培养基中，在37℃的200rpm摇床过夜培养。

(2)分别取1.5ml上述三种菌(农杆菌，帮助菌DH5α和含有目的质粒的供体菌DH5α)菌液至无菌离心管中，12000rpm离心30sec收集菌体，弃上清，并用无菌生理盐水重悬菌体一次，再用实验室常见的YEB培养基洗一次。

(3)按照农杆菌∶帮助菌株DH5α∶含有目的质粒的供体菌株DH5α＝2∶1∶2的比例混匀菌体；

(4)用微量移液器将混匀的菌体转移到位于未含任何抗生素的YEA平板上的硝酸纤维素膜上，晾置5min后，28℃倒置培养约36h；

(5)将共培养物用500μL的YEB洗脱后，均匀涂布在含有适当浓度的利福平和氯霉素抗生素的YEB琼脂固体培养基上，28℃倒置培养约36h，获得含有植物基因表达的质粒载体pGSA1252::RA33G4的根癌农杆菌菌株LBA4404的构建。

玉米成熟种子的裸露的胚的制备

所有涉及的实施过程均在无菌条件下进行。将浸泡过夜的玉米种子剥去胚乳露出胚芽，剥去胚乳后裸露的成熟胚再用0.1％的氯化汞灭菌处理8min，双蒸水清洗四遍，最后用针扎刺每颗裸露成熟胚的胚芽生长点处刺伤。

玉米成熟种子裸露胚创伤后的转化

具体实施步骤：所有涉及的实施过程均在无菌条件下进行。将200粒裸露并且创伤的玉米成熟种子的胚转入含100μM的乙酰丁香酮的OD₆₀₀为0.5的农杆菌转化菌液中，再加20ml的MS液体培养基和6μl的50mg/ml的乙酰丁香酮；在28℃，100rpm的摇床上培养18-20h；接着将创伤的玉米成熟种子的胚转移到含MS、30g/L蔗糖、100μM乙酰丁香酮、7g/L琼脂、pH6.0的共培养基上，在28℃黑暗共培养3天。

共培养后，先用双蒸水将胚冲洗一次，再用含抗生素Cef(农杆菌对其敏感)的双蒸水洗一次，接着在用双蒸水洗一次，最后将其转至含MS、0.1mg/L的IAA、250mg/L的抗生素Cef、20ppm的Basta、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH6.0的抑菌及筛选培养基上培养一周。将培养一周后先打开瓶盖，让抗性苗28℃下，16h光照培养3天后转至经灭菌的土，在28℃，16h光照培养获得除草剂Basta抗性玉米苗。

再生植株的除草剂Basta再筛选

将获得的Basta抗性的玉米苗移栽到盆土中，在30℃下16h光照培养至3-4叶期，然后叶面喷施20ppm的除草剂Basta，7天后观察并获得存活植株。

除草剂Basta抗性苗的PCR鉴定

1.玉米总DNA的提取

①用液氮研磨约0.1g玉米叶片成粉末；

②加入900μl提取液[100mM Tris-HCl，20mM EDTA，1400mM NaCl，2％CTAB(WN)；pH8.0]，颠倒混匀，65℃温育30min，每隔10min颠倒混匀。

③室温放置5min，加入等体积苯酚/氯仿异戊醇(25∶24∶1)颠倒抽提3min，12000rpm离心8min；

④转移上清至新管，加入等体积氯仿抽提，12000rpm离心10min；

⑤转移上清到新管，加入1/10体积的3M的乙酸钠(pH5.2)和等体积异丙醇，充分混匀，-20℃放置30min以上，沉淀DNA；

⑥12000rpm离心15min，倒掉上清液，用75％乙醇洗沉淀2-3次，自然晾干；

⑦加入40μl无菌水溶解。

⑧0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和浓度。

2.PCR反应

反应体系(25μl)：1ng玉米总DNA，1.0μl的dNTP(每种2.5mM)，2.5μl的10×PCR Buffer，2.5μl MgCl₂，35S-F(5’-CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG-3’)和RA33G4-R(5’-GCGGTACCGTGACAGATGATGCATGGGG-3’)引物各0.5mM，16.5μl无菌水。

PCR反应条件：95℃，1min；95℃，30sec，65℃，30sec，72℃，30min，72℃，5min进行30个循环。

反应产物的检测：1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

玉米基因转化效率

根据上述的实施例过程，对转化后的玉米T₀代的转化效率的鉴定结果，见表2。转化效率因品种略有差异，最高可以达到2.5％。

表2本发明方法的玉米基因转化效率

Claims (3)

1.一种农杆菌介导的玉米成熟种子胚的基因转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建植物基因表达的质粒载体；

(2)构建含有步骤(1)中植物基因表达的质粒载体的根癌农杆菌菌株；

(3)玉米成熟种子的裸露的胚的制备和创伤；

(4)步骤(2)中的农杆菌介导的裸露并且经创伤的玉米成熟种子胚的基因转化；

(5)再生苗的除草剂抗性复筛；

(6)除草剂筛选处理后存活的苗移栽；

(7)玉米转基因植株的聚合酶链式反应(PCR)鉴定。

2.权利要求1的玉米成熟种子的裸露的胚的制备和胚的创伤的应用，其特征在于，具体步骤为：将成熟的玉米种子在无菌双蒸水中浸泡过夜16～20h，将浸泡过夜的玉米种子在无菌操作台上用刀片轻轻划开玉米种皮，再用灭菌缝衣针剥去胚乳，留取胚，将胚再用0.1％的氯化汞灭菌处理8min，双蒸水清洗四遍，最后用灭菌的缝衣针轻轻扎刺胚，对胚进行创伤。

3.权利要求1的农杆菌介导的裸露并且经创伤的米成熟种子胚的基因转化，其特征在于，具体步骤为：将200粒裸露并且创伤的玉米成熟种子的胚转入含100μM的乙酰丁香酮的OD₆₀₀为0.5的农杆菌转化菌液中，再加20ml的MS液体培养基和6μl的50mg/ml的乙酰丁香酮；在28℃，100rpm的摇床上培养18-20h；接着将创伤的玉米成熟种子的胚转移到含MS、30g/L蔗糖、100μM乙酰丁香酮、7g/L琼脂、pH6.0的共培养基上，在28℃黑暗共培养3天，

共培养后，先用双蒸水将胚冲洗一次，再用含抗生素Cef的双蒸水洗一次，接着再用双蒸水洗一次，最后将其转至含MS、0.1mg/L的IAA、250mg/L的抗生素Cef、20ppm的Basta、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH6.0的抑菌及筛选培养基上培养一周，然后先打开瓶盖，让抗性苗28℃下，16h光照培养3天后转至经灭菌的土，在28℃，16h光照培养获得除草剂Basta抗性玉米苗，所有涉及的实施过程均在无菌条件下进行。

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