CN103194485A

CN103194485A - 利用玉米胚芽鞘节诱导的愈伤组织转化外源基因的方法

Info

Publication number: CN103194485A
Application number: CN2013101329030A
Authority: CN
Inventors: 万向元; 吴锁伟; 赵虎基; 方才臣; 张丹凤; 肖中华; 刘艳艳; 徐媛媛; 王燕; 安学丽; 王超
Original assignee: BEIJING GOLDEN GUANFENG BIO-TECH Co Ltd
Current assignee: BEIJING GOLDEN GUANFENG BIO-TECH Co Ltd
Priority date: 2013-04-17
Filing date: 2013-04-17
Publication date: 2013-07-10

Abstract

本发明涉及一种利用玉米胚芽鞘节诱导的愈伤组织转化外源基因的方法，属于农业生物技术和作物育种领域。主要包括以下步骤：（1）将灭菌的玉米种子置于发芽培养基中培养，萌发获得幼苗；（2）从幼苗上切取胚芽鞘节诱导愈伤组织；（3）对愈伤组织进行继代扩繁，采用根癌农杆菌介导法将外源基因转入；（4）经过3-4轮筛选获得抗性愈伤组织；（5）分别进行胚状体诱导和分化获得转基因再生苗；（6）对再生苗进行PCR检测验证外源基因是否转入。本方法受体材料不受季节限制、取材方便，再生能力强，较容易地实现玉米大规模的遗传转化。

Description

利用玉米胚芽鞘节诱导的愈伤组织转化外源基因的方法

技术领域

本发明所属的技术领域是农业生物技术领域和作物育种领域。

背景技术

玉米是世界五大作物之一，在我国乃至全世界的粮食生产中都占有举足轻重的地位。在提高玉米单产的诸多因素中，新品种选育的作用约占40%。随着分子生物学技术的长足发展，转基因技术、分子标记辅助育种技术等生物高新技术开始在玉米新品种选育中发挥重要的作用，它们具有许多不同于传统育种技术的独特优势，因此受到了国内外育种工作者的高度重视。

转基因技术是根据育种目标，利用现代生物技术手段从供体生物中分离目的基因，经DNA重组与遗传转化导入受体作物，经过筛选获得稳定表达的转基因株系，结合田间试验与大田选择育成转基因新品种或新种质。转基因育种最大的优点是针对性很强，可以根据目标性状定向选择合适的基因导入需要改良的作物中，以达到预期的目的。通过转基因技术的应用，不仅可以提升传统育种的研发效率，而且提升了育种研发的准确率、减少盲目性和重复浪费，丰富了传统的育种手段，使作物育种的产业发展水平迈向新的台阶。目前，转基因育种在大豆、玉米、棉花和油菜等作物中已经取得了巨大的成功，其中，转基因玉米已经成为仅次于转基因大豆的全球种植面积第二大的转基因作物。

在研发转基因作物新品种时，最重要的技术环节之一就是作物遗传转化技术。目前玉米最常用的遗传转化方法主要是农杆菌介导法，所用的材料可分为幼胚和非幼胚类型，其中前者还包括直接用幼胚或幼胚诱导的胚性愈伤组织进行遗传转化，而后者包括直接用茎尖分生组织和利用成熟胚、叶片、茎尖等诱导的胚性愈伤组织等作为材料进行再生。幼胚和幼胚诱导的胚性愈伤组织操作相对简单，植株再生比较容易，转化率也较高，是玉米转基因中最常用的受体材料。但是幼胚转化所用的受体材料基因型限制严重、材料易受季节和温室条件限制，不能够持续不断的高通量的进行玉米转化，在产业化应用上具有很大的局限性。非幼胚类型的材料中，直接用茎尖分生组织虽然转化和再生容易，且不受基因型限制，但转化率低，获得的再生植株大多是嵌合体，后代需要做大量的筛选工作。而采用成熟胚、叶片、茎尖等材料较难诱导出胚性愈伤组织，再生较困难。我们基于玉米胚芽鞘节作为材料进行转化相对于玉米幼胚的转化而言，转化效率略低，但是由于其不受温室条件和生长季节的限制，操作简便，可以实现高通量、持续不断的遗传转化，因而在玉米的商业化转基因研发中，具有相当大的应用潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的玉米转基因方法，是利用玉米萌发种子的胚芽鞘节诱导出Ⅰ型愈伤组织，并对愈伤组织进行扩繁。采用根癌农杆菌介导的方法将外源基因转入愈伤组织中，获得转基因玉米。从而建立一种取材方便、规模大、转化效率高的玉米转基因方法。

本发明的转化方法包括以下步骤：

1）将灭菌的种子置于发芽培养基中培养，萌发获得幼苗；

2）从上述步骤1）中得到的幼苗上切取胚芽鞘节，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；

3）将上述步骤2）中得到的愈伤组织进一步继代；

4）用农杆菌介导法侵染和共培养转化上述步骤3）中得到的愈伤组织；

5）将上述步骤4）中的愈伤组织在含有除草剂的筛选培养基上筛选2-3轮，获得抗除草剂愈伤组织；

6）将上述步骤5）中得到的抗性愈伤组织置于胚状体诱导培养基中，得到玉米愈伤组织胚状体；

7）将上述步骤6）中得到的愈伤组织胚状体置于再生培养基中，得到再生苗；

8）将上述步骤7）中得到的再生苗置于生根培养基中，获得具有3-4条根的玉米再生植株；

发芽培养基是MS＋麦芽糖40g/L＋酶水解酪蛋白0.1g/L＋谷氨酰胺0.5g/L＋2-吗啉乙磺酸 2g/L＋MgCl₂·6H2O 1.6g/L＋抗坏血酸 0.1g/L＋6-BA 3mg/L＋毒莠定0.01g/L；

愈伤组织诱导培养基是MS＋蔗糖 30g/L＋维生素B₁0.5mg/L＋酶水解酪蛋白 0.5g/L＋脯氨酸 1.5g/L＋硝酸银 5mg/L＋2,4-D 1.5-5mg/L＋毒莠定 0-0.001mg/L；

侵染培养基是MS＋蔗糖68.5g/L＋葡萄糖 36g/L＋脯氨酸 0.2g/L＋200μM 乙酰丁香酮；

共培养培养基是MS＋蔗糖 30g/L＋脯氨酸 0.7g/L＋2,4-D 1.5mg/L＋硝酸银 5mg/L＋L-半胱氨酸 300mg/L＋二硫代苏糖醇150mg/L＋酶水解酪蛋白0.5g/L＋200μM乙酰丁香酮；

筛选培养基是MS＋蔗糖 30g/L＋脯氨酸 0.7g/L＋2,4-D 1.5mg/L＋硝酸银 5mg/L＋羧苄霉素 500mg/L；

胚状体诱导培养基是MS＋蔗糖 30g/L＋脯氨酸 0.7g/L＋6-BA 2mg/L＋羧苄霉素 250mg/L；

再生培养基是MS＋蔗糖 20g/L＋肌醇 0.1g/L＋羧苄霉素 100mg/L；

步骤2）所述的胚芽鞘节是指幼苗凸起的顶端分生组织；

步骤3）所述的继代是将步骤2）所获得的愈伤组织在愈伤组织诱导培养基上培养增殖，得到增殖的愈伤组织；

步骤4）所述的农杆菌介导法包括固体法或液体法处理农杆菌步骤；

步骤8）获得的再生植株需进行炼苗后再移栽到土壤中。

本发明的主要技术效果在于：

1）本发明采用的胚芽鞘节可随时由成熟种子发芽获取，不受季节限制，在冬季也无需像幼胚一样在温室或南繁获取，因此取材方便、费用低廉；

2）发明采用的胚芽鞘节诱导愈伤组织效率比成熟胚、叶片高，且单个胚芽鞘节可获取2-3次愈伤组织，因此容易实现大规模的遗传转化；

3）发明采用胚芽鞘节诱导的I型愈伤组织状态要明显好于由成熟胚、叶片获得的愈伤组织，容易转化成Ⅱ型愈伤组织，从而分化成苗；

4）发明采用遗传转化机理最清楚、转化能力最强的的根癌农杆菌介导法，能有效地提高转化效率；

5）禾本科的种子在胚芽外具有胚芽鞘的特殊结构，种子萌发时其生长迅速对胚芽起先导和保护作用。因此，本发明不仅应用于玉米遗传转化，也可应用于具有胚芽鞘特殊结构的禾本科植物的遗传转化，如小麦、水稻等。

附图说明

图1 为玉米萌芽的种子。

图2 为切取的玉米胚芽鞘节。

图3 为胚芽鞘节诱导出愈伤组织。

图4 为愈伤组织的扩繁。

图5 为愈伤组织共培养。

图6 GUS染色。

图7 愈伤组织第一轮筛选。

图8 愈伤组织第二轮筛选。

图9 抗性愈伤组织的获得。

图10 抗性胚状体。

图11 分化成苗。

图12 生根炼苗。

图13 PCR检测。

具体实施方式

下面结合具体实施对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例一玉米种子胚芽鞘节愈伤组织的诱导

1.种子灭菌处理

首先将玉米种子中的杂物清理干净、选取饱满完整的种子，然后将其放于容器中用蒸馏水清洗3遍，期间剧烈震荡以清理附着表面的残余物。于超净台上用75%的酒精浸泡3分钟，然后用质量浓度5.25%的次氯酸钠浸泡20分钟，最后用灭菌水冲洗5-6次。

2.发芽培养

将灭菌后的种子置于发芽培养基中，注意要将种子的胚朝上水平接种于发芽培养基中。于培养室（16h/d光照，光强80-100μE/m²/s，温度26-28℃）培养7-10天。

上述发芽培养基是MS＋麦芽糖40g/L＋酶水解酪蛋白0.1g/L＋谷氨酰胺0.5g/L＋MES（2-吗啉乙磺酸）2g/L＋MgCl₂·6H2O 1.6g/L＋抗坏血酸 0.1g/L＋6-BA 3mg/L＋毒莠定0.01g/L。

3. 胚芽鞘节的切取

将已长出的幼苗切下来，放入一个灭菌的空皿中，用解剖刀切下幼苗胚芽鞘节区域上下各0.5cm。将茎段纵向一分为二。

4. 愈伤组织的诱导

将胚芽鞘节创伤面接触培养基，放于愈伤诱导培养基中，10-16个材料/皿，光照培养室中培养（16h/d光照，光强80-100μE/m2/s, 温度28℃）。愈伤诱导期间不定期进行胚芽鞘节大芽子的切除，2-4周后，将胚性愈伤组织转至新的愈伤诱导培养基中。28℃暗培养2-4周，即可诱导出愈伤组织。

上述愈伤诱导培养基是MS＋蔗糖 30g/L＋VB₁ （维生素B₁）0.5mg/L＋酶水解酪蛋白 0.5g/L＋脯氨酸 1.5g/L＋硝酸银 5mg/L＋2,4-D 1.5-5mg/L＋毒莠定 0-0.001mg/L。

5．观察统计

表1为三个玉米基因型胚芽鞘节的发芽率和愈伤组织诱导率。这三个玉米基因型为普通玉米品种，可商购获取。

表1 玉米胚芽鞘节发芽率和愈伤组织诱导率

实施例二胚芽鞘节愈伤组织的转化与再生

1.农杆菌制备

（1）液体农杆菌制备法

在LB固体培养基中划线活化菌株。培养皿用Parafilm封口，倒置放置于28度培养箱中培养2天；将长有农杆菌的培养皿放置于冰箱中；在侵染外植体前两天的下午，挑取农杆菌单菌落，接种在含有25ml LB液体培养基的250ml烧瓶中（LB液体培养基中要加入质粒/菌株相应的抗生素）。将烧瓶放置于150rpm的摇床中摇培，26度暗培养过夜；第二天早晨以1:5的浓度稀释农杆菌（即10ml的菌液加入40ml新鲜的加有抗生素的LB液体培养基）；摇菌至当天下午，将50ml菌液分装在2个50ml离心管中，3500rpm离心15min。去除上清液，用10ml加有200μM AS（乙酰丁香酮）和相应抗生素的农杆菌诱导培养基重悬菌体，将重悬液稀释到OD660=0.2 ，使最终菌液体积为50ml（放置在250ml的烧瓶中）。将烧瓶放置于150rpm摇床上摇培，26度暗培养过夜；第二天早晨，离心菌液并用6-10ml加有200μM AS的农杆菌诱导培养基重悬菌体，菌液浓度OD660=0.5，备用。

上述农杆菌诱导培养基由如下物质组成：葡萄糖 20g/L、NH₄Cl 1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3g/L、KCl 0.15g/L、CaCl₂·2H₂O 11.5mg/L、FeSO₄·7H₂O 2.5mg/L、NaH₂PO₄ 60mg/L、MES 2g/L，用无菌水定容。为更有效地诱导农杆菌，加入了终浓度200μM 的AS。

（2）固体农杆菌制备法

每个月从-80℃冰箱中挑取含有目的载体的农杆菌单菌落，用枪头在加有相应抗生素的固体AB培养板上划线，在28℃黑暗条件下培养2-3天；长出菌落的AB平板保存在4℃冰箱中用于遗传转化。从AB平板上挑取单斑在含有相应抗生素的YEP平板上划线，在20℃黑暗条件下培养3天；用细菌接种环（5毫米）刮取培养三天的菌落，悬浮在5ml的侵染培养基中，静置2分钟，然后将菌液混匀，将其浓度调整为OD₅₅₀=0.35。23℃ 100rpm摇动4-5小时后进行转化。

上述侵染培养基是在MS基本培养基中添加如下物质：蔗糖68.5g/L、葡萄糖 36g/L、脯氨酸 0.2g/L。为更有效地诱导农杆菌，还加入了终浓度200μM 的AS。

2.侵染和共培养

将继代培养1周左右的愈伤，放于50mL离心管中，每管收集10mL左右的愈伤。加入适量的菌液（浸没过愈伤为宜），静置10分钟。迅速将菌液倒去，然后将愈伤块分散放在共培养培养基上，将菌液吸干，置于生长室（23℃，暗条件）中培养3天。

上述共培养培养基是在MS基本培养基中添加如下物质：蔗糖 30g/L、脯氨酸 0.7g/L、2,4-D 1.5mg/L、硝酸银 5mg/L、L-cys（L-半胱氨酸）300mg/L、DTT（二硫代苏糖醇）150mg/L、酶水解酪蛋白0.5g/L。为更有效地诱导农杆菌，还加入了终浓度200μM 的AS。

3.筛选和再生

（1）抗性愈伤组织的筛选

共培养3天后，将愈伤转入第一轮筛选培养基中，15-25个愈伤/皿，28℃暗培养3周。将愈伤块分为2-6块，放于第二轮筛选培养基中，28℃暗培养3周。此培养阶段末期，抗性愈伤开始生长，如果愈伤不够大用于再生，继代后继续生长2周。

上述第一轮筛选培养基是在MS基本培养基中添加如下物质和终浓度：蔗糖 30g/L、脯氨酸 0.7g/L、2,4-D 1.5mg/L、硝酸银 5mg/L、羧苄霉素 500mg/L，同时加入一定量的除草剂（如毒莠定0.02mg/L）作为筛选剂、第二轮筛选培养基成分与第一轮的相同，唯一不同的是将除草剂的筛选浓度提高一倍。

（2）植株再生

将抗性愈伤转至胚状体诱导培养基中，28℃暗培养7天；将组织块转至再生培养基中，1-6个愈伤/皿，16h/d光照，光强80-100μE/m²/s,28℃培养4-6周。再生出的丛生苗分成小块放在培养皿（90*25mm）中进行继代培养。再生出的丛生苗分成小块放在生根培养基中进行生根培养，16h/d光照，光强80-100μE/m2/s, 28℃培养10天左右，将长出3-4条根的幼苗进行炼苗。

上述胚状体诱导培养基是在MS基本培养基中添加如下物质和终浓度：蔗糖 30g/L、脯氨酸 0.7g/L、6-BA 2mg/L、羧苄霉素 250mg/L，同时加入一定量的除草剂作为筛选剂。

上述再生培养基是在MS基本培养基中添加如下物质：蔗糖 20g/L、肌醇 0.1g/L、羧苄霉素 100mg/L。

生根培养基采用常规的玉米丛生苗生根培养基。

4.数据统计

我们得到的抗性愈伤组织和再生植株见表2。

表2 胚芽鞘节抗性愈伤和再生植株

实施例三转基因玉米的PCR检测

1.玉米叶片DNA的提取（CTAB法）

剪取2-3cm长的转基因玉米植株叶片并剪碎，放入2.0ml离心管中，加入一颗钢珠；按顺序将已放入叶片和钢珠的离心管摆放在打样仪专用的离心管架（8×5）上，整体浸泡在盛有液氮的保鲜盒中1-2min；将冷冻好的离心管架放入打样仪中，1200转/min的速度打样20s；加入600μL CTAB提取液（65℃预热），65℃水浴30min,中间取出颠倒1-2次；加入等体积（600uL）的氯仿：异戊醇（24:1）萃取液，盖紧盖子，上下颠倒混匀，静置10-15min。11000 rpm离心5min至清晰分相；吸取上清液500μL，转入新的1.5mL灭过菌的离心管中，并加入2/3体积的异丙醇，上下颠倒混匀；-20℃冰箱中放置30min；12000 rpm，4℃离心10min至沉淀附于离心管底部，弃上清液；500uL 70％乙醇洗涤沉淀1遍，离心，弃上清液，置超净台10min干燥；待DNA干燥后，加入250μL的1×TE缓冲液或ddH2O溶解沉淀；样品置于-20℃冰箱中保存备用。

2.转基因玉米PCR检测

（1）PCR反应体系及反应程序

将下列试剂从-20℃冰箱中取出解冻：PCR缓冲液、dNTP溶液、正反向引物溶液以及叶片DNA模板；所有试剂解冻完毕后，8000 rpm离心数秒，放回冰上待用；配制PCR反应体系的混合液，混匀，8000 rpm离心数秒；将混合液分装至200μL PCR反应管中，再加入1μL模板DNA，做好标记；将PCR反应板（管）插入PCR扩增仪，盖好PCR扩增仪盖子；打开PCR扩增仪电源开关，选择预设的PCR反应程序，开始扩增；PCR反应产物用于琼脂糖凝胶电泳检测。

上述配制PCR反应体系的混合液时，一个反应体系按照下表依次加入各试剂（反应体系为25μL）：10×PCR缓冲液2.5μL，灭菌ddH₂O 17μL，dNTP(2.5mM) 2μL，引物1（LTP2-F, 10μM）1μL，引物2（dsRed2-R, 10μM）1μL，Taq酶0.5μL，叶片DNA模板1μL。

上述PCR反应程序为：94℃预变性 3分钟，94℃变性 30秒，60℃退火 30秒，72℃延伸 1分钟，35个循环，最后72℃延伸 10分钟。检测结果见图13。

Claims

1.一种外源基因转化方法，包括以下步骤：

1）将灭菌的种子置于发芽培养基中培养，萌发获得幼苗；

3）将上述步骤2）中得到的愈伤组织进一步继代；

上述发芽培养基是MS＋麦芽糖40g/L＋酶水解酪蛋白0.1g/L＋谷氨酰胺0.5g/L＋2-吗啉乙磺酸 2g/L＋MgCl₂·6H2O 1.6g/L＋抗坏血酸 0.1g/L＋6-BA 3mg/L＋毒莠定0.01g/L；

再生培养基是MS＋蔗糖 20g/L＋肌醇 0.1g/L＋羧苄霉素 100mg/L。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）所述的胚芽鞘节是指幼苗凸起的顶端分生组织。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤3）所述的继代是将步骤2）所获得的愈伤组织在愈伤组织诱导培养基上培养增殖，得到增殖的愈伤组织。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤4）所述的农杆菌介导法包括固体法或液体法处理农杆菌步骤。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤8）获得的再生植株需进行炼苗后再移栽到土壤中。

6.如权利要求1－5任一所述的方法，其特征在于：所述方法用于禾本科植物的外源基因转化。

7.如权利要求1－5任一所述的方法，其特征在于：所述方法用于玉米植物的外源基因转化。