CN102277385A - 一种以小麦花药为受体的转基因方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以小麦花药为受体的转基因方法。本发明提供的方法，包括以下步骤：1)以植物花药为受体用基因枪法进行基因转化，得到转化后的花药；2)将步骤1)得到的转化后的花药培养，得到胚状体，然后将所述胚状体培养，得到单倍体再生苗。本发明建立了以花药为受体的小麦转基因技术体系，对花药的离体保湿、基因枪轰击过程中的花药粘附固定、制备子弹的金粉粒度、子弹包被效果、轰击距离以及单倍体染色体加倍等过程进行了系统的研究，可以在当代得到基因型纯合的转基因植株。

Description

一种以小麦花药为受体的转基因方法

技术领域

本发明涉及一种以小麦花药为受体的转基因方法。

背景技术

1991年Vasil等利用基因枪介导法将bar基因导入了小麦，获得了世界上第一例小麦转基因植株。次年，Weeks等利用基因枪介导法将gus基因、bar基因导入了小麦，并通过对基因枪转化过程中不同参数的优化，建立了更为成熟的基因枪转化小麦幼胚的技术体系。之后，小麦基因转化取得了明显的进展，利用不同方法将多种基因导入了小麦幼胚，获得了一批小麦转基因植株，为外源基因的遗传研究提供了资料。但与水稻、玉米等作物相比，小麦属于遗传转化最为困难的粮食作物，而且小麦的转基因研究起步较晚，从目前研究进程看，小麦的基因工程育种进程明显落后于其他主要农作物。

基因枪法、农杆菌法和花粉管通道法是目前应用于小麦基因转化最广泛的方法。在获得小麦转基因植株的报道中，基因枪法占90％左右，其它方法仅占10％。而在其他作物上相当成熟的农杆菌转化技术，在小麦基因转化中遇到了很大的困难，主要问题是侵染后的愈伤组织褐化死亡、再生困难。因此，基因枪法仍然是小麦基因转化的主要方法。基因枪转化小麦的受体有幼胚及胚性愈伤组织、悬浮细胞、盾片组织、成熟胚、幼穗、茎尖组织等，大多采用授粉后13～14d的幼胚及其愈伤组织为受体材料。但是，小麦是染色体组成复杂的异源六倍体，其基因组是水稻和玉米的近40倍，以幼胚、成熟胚和茎尖分生组织等双倍体为受体的转基因后代稳定慢，容易形成嵌合体。以小麦花药作为转基因受体，得到的单倍体通过染色体人工加倍，直接得到基因型纯合的个体，减少了了嵌合体的产生几率，缩短育种年限，因此，以单倍体为受体的小麦转基因技术是一种非常有前途的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以小麦花药为受体的转基因方法。

本发明提供的方法，包括以下步骤：

1)以植物花药为受体用基因枪法进行基因转化，得到转化后的花药；

2)将步骤1)得到的转化后的花药培养，得到胚状体，然后将所述胚状体培养，得到单倍体再生苗。

其中步骤1)中，所述基因转化包括如下步骤：

a)将单核靠边期的植物花药浸入0.2-0.4mol/L的作为粘附剂的甘露醇水溶液中保存，得到基因转化用的受体；所述保存的温度是2-6℃，所述保存的时间是16至24小时；

b)用基因枪将子弹针对步骤a)中得到的受体进行轰击；所述轰击步骤中，所述受体与所述基因枪的距离为6-9cm，所述轰击的压力为900-1300psi。

上述步骤b)中，所述子弹的制备方法包括如下步骤：用粒径为0.6-1.0mm的金粉包被DNA，得到DNA包裹体溶液；将所述DNA包裹体溶液置于冰上1-5分钟，然后离心取沉淀(将该沉淀记为沉淀A)；往所述沉淀A中加无水乙醇振荡，得到悬浮液，将悬浮液置于冰上1-5分钟，然后离心取沉淀(将该沉淀记为沉淀B)；往所述沉淀B中加无水乙醇得到子弹。

进一步，上述金粉的粒径为0.6mm；所述DNA包裹体溶液置于冰上的时间以及所述悬浮液置于冰上的时间均为2分钟。

上述步骤a)中，所述粘附剂是0.3mol/L的甘露醇水溶液；所述保存的温度是4℃，所述保存的时间是16小时。

上述步骤b)中，所述轰击步骤中，所述受体与所述基因枪的距离为6cm，所述轰击的压力为1300psi；所述轰击步骤中每一枪的金粉的量是100ug。

进一步，上述方法中还包括在步骤2)之后的染色体加倍处理，得到双倍体转基因植物；所述染色体加倍处理是将步骤2)中得到的单倍体再生苗的根部浸泡在加倍液中；所述浸泡步骤中，单倍体再生苗根部是通气的。

上述浸泡步骤中气温是恒温18℃。

上述加倍液的配置方法如下：先配制0.4％(质量百分比)的秋水仙素母液，取上述母液40ml，加1ml的二甲基亚砜(DMSO)，加水定容到80ml，得到加倍液。

上述植物是双子叶植物或单子叶植物，优选是小麦，特别适合小麦品系K35。

实验证明：当金粉粒度0.6mm、每枪金粉用量100ug、轰击距离6cm、轰击压力1300psi时转化效率高。将花药为受体转化后得到108个单倍体植株，经过上述加倍处理，有103株正常结实，加倍效率达到95％。

本发明建立了以花药为受体的小麦转基因技术体系，对花药的离体保湿、基因枪轰击过程中的花药粘附固定、制备子弹的金粉粒度、子弹包被效果、轰击距离以及单倍体染色体加倍等过程进行了系统的研究，可以在当代得到基因型纯合的植株，加速了转基因后代的纯合过程，提高资源创新效率，本发明不仅对于小麦基因转化是一个突破，其中有关花药转化的技术细节对于其他植物的单倍体转化技术提供了良好的技术参考。

附图说明

图1：pBx17Gus质粒的物理图谱。

图2：单核靠边期的花药。

图3：花药的预处理。

图4：转化后的花药回转培养。

图5：胚状体的再生。

图6：单倍体的保湿移栽。

图7：加倍后的单倍体植株。

图8：转pCAMBIA1301的小麦籽粒的Gus组织染色，左边的CK对照是未转化的K35花培后代籽粒，右边是转pCAMBIA1301的K35花培后代籽粒。

图9：转pBx17Gus(A)和转pCAMBIA1301(B)的小麦根部Gus组织染色。

图10：转pCAMBIA1301(A)和转pBx17Gus(B)的小麦叶片Gus组织染色

图11：转pBx17Gus质粒的小麦籽粒GUS组织染色，左边的CK对照是未转化的K35花培后代籽粒，右边是转pBx17Gus的K35花培后代籽粒。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

本实验所用的质粒DNA为pCAMBIA1301和pBx17Gus，其中pCAMBIA1301(GenBank AF234297)购自澳大利亚pCAMBIA公司。pBx17Gus是由本实验室构建完成的具有胚乳特异表达活性的载体，其构建过程如下：

利用Bx17启动子的参考序列(Genbank DQ537336)设计PCR引物Bx17F和Bx17R，从含有Bx17亚基的小麦品种烟农19中扩增得到Bx17启动子序列，正向引物Bx17F碱基组成为AAGTCGACGAGCTCTCCCATCCAATTGA；反向引物Bx17R的碱基组成为GCACTAGTTCAGTGAACTGTCAGTTGAAT，Bx17F的5/端添加SalI酶切位点，Bx17R的5/端添加SpeI位点。将扩增产物测序验证后，用SalI和SpeI完全双酶切，电泳回收酶切片段与经过同样酶切的pCAMBIA1381Xb(Genbank AF234304)相连接，构建完成的载体命名为pBx17Gus，具体图谱见图1。

质粒提取试剂盒购自天根生物，培养基配制所需的无机盐购自国药集团，维生素和抗生素以及激素Gus染色所需的药品购自Sigema公司。金粉及基因枪转化过程中所需的耗材均购自伯乐公司。

小麦品系K35是山东省农科院作物所自行选育的具有良好花药培养能力的新种质，该材料曾在2007年第1期的山东农业科学上有过详细的介绍，公众可从山东省农业科学院作物研究所获得。

实验例1、基因枪转化花药

一、花药的分离与预处理

1、0.3M甘露醇预处理液的配制：称取54.65克分析纯甘露醇，溶于1000ml超纯水中，高压灭菌后，每升加入已经抽滤灭菌的头孢霉素200mg。

2、花药愈伤诱导培养基的配制：固体培养基提前三天倒板，每升加入200mg头孢霉素，倒在3.5mm培养皿中，检查培养基平板有无污染，具体配方见表2。

3、小麦花药供体品种为K35，在显微镜下观察花药发育时期，取图2所示单核靠边期的花药(此时手摸穗部顶端离旗叶叶耳约10cm)，放入盛有0.3M甘露醇预处理液的培养皿中，每皿放置花药500粒，4℃保存约16小时。

4.在倒好平板的培养皿下边放上画有基因枪轰击圈的白纸，将浸泡完全的花药从0.3M甘露醇预处理液转移到轰击圈内，见图3，每皿放500粒花药，准备基因枪转化。

二、子弹制备及基因枪转化花药

1.金粉母液的制备：取0.6mm和1.0mm的金粉各10mg，分别用70％的乙醇洗3次，每次10000rpm离心1分钟，加1ml灭菌水振荡2分钟，制成不同粒度、终浓度10ug/ul的金粉贮藏液。

2.不同金粉用量的子弹制备：将金粉贮藏液充分涡旋，从中分别取30ul、60ul和100ul，放入3个硅化的1.5ml离心管中，14000rpm离心30秒，弃上清。分别加入50ul的水将金粉悬浮，在震荡器上边轻微震荡边往里加入1ug/ul的质粒DNA10ul，再加入新配制的20ul的0.1M亚精胺，再加入50ul 2.5M的CaCl2，高速蜗旋3分钟，将离心管放在冰上约2分钟让金粉自动沉淀一会儿，10000rpm离心10秒，去掉上清，加100％酒精750ul，高速蜗旋，然后将离心管放在冰上约2分钟让金粉自动沉淀一会儿，10000rpm离心10秒，去掉上清，分别用100ul无水乙醇悬浮，插到冰上或放入-20℃冰箱暂时保存，准备打枪。每管子弹可打10枪，根据所取的金粉贮藏液30ul、60ul和100ul的不同，每枪金粉用量分别为30ug、60ug和100ug。

3.耗材准备：大载体、阻挡网、可裂片(900psi、1100psi和1300psi)以及实验所用各种枪头镊子在实验的前一天高压灭菌消毒，使其充分干燥。基因枪提前半小时用75％酒精喷洒消毒，并将大超净台上的通风并打开紫外对操作环境消毒。

4.子弹涂布：将预先制备好的子弹，在高速涡旋器上充分混匀后，取10ul均匀涂布到大载体上，让其自然干燥5分钟左右，使酒精完全挥发。

5.基因枪轰击：将氦气压力罐打开，根据表1中的实验设计，调节轰击压力至所需要的值，将摆放好的花药放到所需的位置，使花药正好位于轰击圈的正下方。放入可裂片、阻挡网以及涂布子弹后的大载体。关闭舱门，打开真空机抽真空，按下基因枪上的vaccum按钮，使枪膛里的压力达到28，按下shot按钮，待可裂膜爆裂后，按下Vent按钮至枪膛里的压力为零时，打开舱门，盖上培养皿的盖子，将轰击后的花药取出。

(1)金粉用量和轰击压力的确定：本实验首先设计3个轰击压力和3个不同金粉浓度，进行九个处理的实验，每个处理转化花药2000个，具体转化结果见表1。

从表1的数据可以看出，900psi的轰击压力下，每枪金粉用量30ug、60ug和100ug都没有得到阳性植株；在轰击花药数目相同的情况下，使用1100psi的轰击压力，每枪金粉用量为60ug时得到3个阳性植株；每枪金粉用量为100ug时，得到5个阳性植株，其转化效率分别为0.15％和0.25％；而在1300psi的轰击压力下，3个梯度的金粉用量都得到阳性植株，其中每枪用100ug时转化效率最高，达到0.6％。

表1：不同每枪金粉用量和轰击压力下的花药转化效率

(2)金粉粒度的确定：依据上述实验数据，本发明确定1300psi轰击压力和100ug每枪的金粉用量为适宜参数，在培养条件和上述轰击压力及金粉用量等轰击参数不变的情况下，我们对0.6mm和1.0mm两种不同粒度的金粉进行了转化效率实验，每个处理转化花药2000个，结果0.6mm金粉轰击的花药获得胚状体652个，阳性植株9个，转化效率为0.45％，而以0.1mm金粉轰击的花药获得胚状体703个，阳性植株5个，转化效率为0.25％。

(3)轰击参数的确定：在上述参数不变的情况下，设定6cm和9cm两个轰击距离，每个处理轰击花药2000个，其中轰击距离6cm的获得胚状体663个，阳性植株10个，转化效率0.5％，而轰击距离9cm的获得胚状体861个，没有阳性植株。

因此，根据上述3个不同实验获得的数据，本发明确定金粉粒度0.6mm、每枪金粉用量100ug、轰击距离6cm、轰击压力1300psi为花药转化的最佳参数。

实验例2、花药恢复培养与再生苗的筛选及染色体加倍

一、花药恢复培养与再生苗的筛选

1.于无菌操作台中将轰击结束的花药，按图4所示的方法转移到愈伤诱导培养基上，32℃暗培养3天后，改用28℃暗培养，约4周，获得胚状体。

2.转移1～2mm左右的胚状体到加有G418的再生培养基(表2所示的再生培养基中的G418要抽滤灭菌后加入到高压灭菌后的再生培养基)，光照强度5000lux，25℃每天光照16小时进行再生培养，见图5。

3.将再生绿苗转移到加有25mg/L G418的1/2MS培养基上，继续筛选2周。

二、再生苗壮苗培养与染色体加倍

1.准备栽培基质：将Klasmann泥炭与奥绿1号标准基础缓释肥，按一定比列混匀，装入10*10cm的花盆中，浇透水备用。

2.苗子修剪：将苗高5cm左右的再生苗移栽到花盆中，如图6所示，用打孔的废弃矿泉水瓶子罩住小苗，昼夜温度保持14℃，14小时的光照时间，待苗子有2～3个分蘖时，将苗子从花盆中取出，流水洗净其根部，用剪刀从根部3cm处剪掉过长的根系，并修剪叶子使叶长3cm左右。

3.染色体加倍溶液的配制

(1)新鲜加倍液的配制：先配制0.4％(质量百分比)的秋水仙素母液，取上述母液40ml，加1ml的二甲基亚砜(DMSO)，加水定容到80ml，此时秋水仙碱的浓度为0.2％(质量百分比)，备用。

(2)加倍液的再次利用：取上述已经用过的加倍液60ml，加入10ml新鲜的加倍液，加水定容到80ml，此时秋水仙碱的浓度为0.03％(质量百分比)。

4.加倍处理：第一次使用新鲜的加倍液，将修剪好的苗子根部完全浸入加倍液中，在低温冷室中保持气温18℃恒温的条件下，利用普通鱼缸通氧机给浸入加倍液中的小麦根部持续通气，加倍处理5小时；若使用二次利用的加倍液，则在上述环境中加倍处理16小时，加倍液可以重复利用4次。

5.将加倍处理完毕的幼苗，用流水冲洗根部3小时，移栽到花盆中，用打孔的废弃矿泉水瓶子罩住小苗，昼夜温度保持14℃，14小时的光照时间，还苗后待新蘖产生时，转移到17℃～25℃的环境，直至成熟收获。

108个单倍体植株，经过上述加倍处理，有103株正常结实(图7)，加倍效率达到95％。其余5株不能正常结实，说明其染色体加倍失败。

实验例3、转基因后代Gus基因表达分析

1.Gus组织染色液母液的配制：0.2M磷酸钠缓冲液；200mg X-gluc溶于400ul的DMSO中；0.1M的亚铁氰化钾；0.1M的铁氰化钾；0.5M的Na2-EDTA

2.Gus组织染色液使用液的配制：0.2M磷酸钠缓冲液1000ml；0.1M的亚铁氰化钾和0.1M的鉄氰化钾各1ml；0.5M的Na2-EDTA 8ml；已溶于DMSO中的200mg X-gluc；水90ml，定容至200ml。

3.Gus组织染色：取要检测的组织，剪断或切开后分别装入5ml离心管中，用Gus染色液完全浸没，37℃震荡过夜，次日用70％的乙醇冲洗2~3次，观察gus基因表达强度。

如图8、图9B和图10A所示，转化pCAMBIA1301的阳性植株，其籽粒(图8)、根尖(图9B)和叶片(图10A)的GUS染色结果显示，GUS基因的表达产物在这些组织中有较强的积累，在根尖的最下端细胞分裂旺盛的部位，染色较深，这一结果与pCAMBIA1301中驱动GUS基因表达的组成型启动子相吻合。但利用具有胚乳特异性启动子的pBx17GUS载体转化而来的阳性植株，只在胚乳中检测到蓝色信号(图11)，而在根尖(图9A)、叶片(图10B)中几乎看不到蓝色信号，而且胚乳中的蓝色信号比组成型启动子的要强，说明GUS基因的表达水平较高。

表2：每升花药诱导与再生培养基各组分含量(pH 5.8)

Claims (10)

1.一种培育转基因植物的方法，包括以下步骤：

1)以植物花药为受体用基因枪法进行基因转化，得到转化后的花药；

2)将步骤1)得到的转化后的花药培养，得到胚状体，然后将所述胚状体培养，得到单倍体再生苗。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述基因转化包括如下步骤：

a)将单核靠边期的植物花药浸入0.2-0.4mol/L的作为粘附剂的甘露醇水溶液中保存，得到基因转化用的受体；所述保存的温度是2-6℃，所述保存的时间是16至24小时；

b)用基因枪将子弹针对步骤a)中得到的受体进行轰击；所述轰击步骤中，所述受体与所述基因枪的距离为6-9cm，所述轰击的压力为900-1300psi。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤b)中，所述子弹的制备方法包括如下步骤：用粒径为0.6-1.0mm的金粉包被DNA，得到DNA包裹体溶液；将所述DNA包裹体溶液置于冰上1-5分钟，然后离心取沉淀A；往所述沉淀A中加无水乙醇振荡，得到悬浮液，将悬浮液置于冰上1-5分钟，然后离心取沉淀B；往所述沉淀B中加无水乙醇得到子弹。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述金粉的粒径为0.6mm；所述DNA包裹体溶液置于冰上的时间以及所述悬浮液置于冰上的时间均为2分钟。

5.如权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤a)中，所述粘附剂是0.3mol/L的甘露醇水溶液；所述保存的温度是4℃，所述保存的时间是16小时。

6.如权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤b)中，所述轰击步骤中，所述受体与所述基因枪的距离为6cm，所述轰击的压力为1300psi；所述轰击步骤中每一枪的金粉的量是100ug。

7.如权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括在步骤2)之后的染色体加倍处理，得到双倍体转基因植物；所述染色体加倍处理是将步骤2)中得到的单倍体再生苗的根部浸泡在加倍液中；所述浸泡步骤中，单倍体再生苗根部是通气的。

8.如权利要求7中所述的方法，其特征在于：所述浸泡步骤中气温是恒温18℃。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述加倍液的配置方法如下：先配制0.4％(质量百分比)的秋水仙素母液，取上述母液40ml，加1ml的二甲基亚砜(DMSO)，加水定容到80ml，得到加倍液。

10.如权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于：所述植物是双子叶植物或单子叶植物，优选是小麦。

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