CN103416301B - 一种小麦遗传转化受体的培养方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养及基因工程技术领域，涉及一种小麦遗传转化受体即分生组织团的培养方法及应用，利用该受体进行遗传转化可快速获得大量转基因植株。对分生组织团进行基因枪轰击，经basta筛选后，对表现抗性的植株进行GUS染色、PCR检测和除草剂抗性检测，确定转基因植株。本发明建立了高效的小麦离体再生及遗传转化体系；解决了目前小麦再生难、遗传转化效率低、稳定性差的问题；与目前常用的小麦幼胚相比，具有取材方便、高频再生的特点，能快速获得大量转基因植株。本发明中的分生组织团也为小麦的生物学研究提供了有效的无性繁殖体系。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养和遗传转化技术领域，具体涉及一种小麦遗传转化受体的培养方法及应用，本发明以小麦成熟胚为外植体，通过组织培养得到分生组织团，并利用获得的分生组织团作受体进行基因枪遗传转化获得转基因植株。
背景技术
小麦隶属于禾本科小麦属，是世界上最重要的粮食作物之一，在国民经济、社会发展及粮食安全等方面占据主要地位。随着世界人口的不断膨胀，对粮食的需求量也在不断增加，粮食的高产优质成为全世界育种家的共同目标。
相对于传统育种技术，新的育种技术不断涌现，其中转基因技术正在育种界中发挥主要作用。与重要粮食作物水稻、玉米相比，小麦因其基因组大、重复序列多、调控体系异常复杂等因素，遗传转化工作相对滞后。1992年，Vasil等人以长期培养的胚性愈伤组织为外植体，通过基因枪轰击将编码β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase）的gus基因及抗除草剂基因bar导入小麦品种“Pavon”，获得了世界上第一例转基因小麦植株。之后通过各国学者的不断努力，利用基因枪技术获得了不同品系的转基因小麦植株，基因枪技术也得到不断完善，但依然存在费用高、易出现嵌合体、外源片段一般为多拷贝整合、转基因后代易出现基因沉默等问题。农杆菌介导转化法是双子叶植物常用的遗传转化方法，因其成本低、操作简单、外源基因一般为单拷贝整合等优点引起育种家的强烈关注，但由于单子叶植物不是农杆菌的天然寄主，难以利用此方法进行小麦的遗传转化。直到1997年，Cheng等建立了一个由农杆菌介导的小麦快速转化体系，获得了转基因植株。虽然农杆菌介导法在小麦中得到应用，但转化频率低，一直以来未有较大突破。花粉管通道法是我国科学家周光宇在1978年提出，但因重复性和稳定性差、经验性强，转化率低、后期检测比较困难等问题，未在世界范围得到广泛应用。
目前，小麦遗传转化的效率主要受制于基因型和受体来源，克服基因型依赖性、培育合适的受体和建立高效的再生体系是转化频率提高的保证。现今在小麦遗传转化中用到的受体多以幼胚或其愈伤组织为主，转化频率较高的基因型多为模式小麦（例如Bobwhite）。基因枪转化频率分别为0.1%～16.7%（Jiarui Li,et al.,2012）。除了幼胚以外，也有以小麦幼穗、花药、花序等作为受体，但这些材料的取材均受季节限制，给转化工作带来不便，成熟胚取材不受季节限制、取材方便，以其诱导的愈伤或胚性愈伤组织在小麦遗传转化中得到应用并获得转基因植株，但转化频率更低。近年来，利用小麦幼胚愈伤诱导丛生芽及茎尖诱导丛生芽（SanjaySingh Parmar，et al.,2012）引起关注，但起步较晚，相关文献报道较少，转化工作进展缓慢。
本发明利用小麦成熟胚诱导形成的分生组织团，诱导周期短，分生组织团表面光滑致密，细胞生长状态均一，具有很强的再生能力，可在短时间内获得大量的再生植株，可在一定程度上提高遗传转化的频率，是一种值得关注的新型受体。经文献查阅，国内未见有关分生组织团培养及其在遗传转化中应用等方面的报道，也未见相关的专利技术公开或使用。
发明内容
本发明的目的在于克服小麦现有再生体系再生率低及遗传转化受体范围有限，且受体材料取材受季节限制、转化频率低等的缺陷，以小麦成熟胚经诱导培养快速得到分生组织团,进行再生和遗传转化，以建立小麦高频再生体系及提高小麦遗传转化频率。
本发明提供了一种小麦遗传转化受体即分生组织团的培养方法，此方法简单易行，培养周期短、效率高。
本发明提供了一种小麦成熟胚诱导的分生组织团在遗传转化中的应用，此受体再生能力强，可快速获得大量转化再生植株，提高遗传转化频率，缩短育种周期，加快小麦遗传改良进程。
本发明的技术方案如下所述：
一种利用小麦遗传转化受体即分生组织团培养快速获得再生植株的方法，其过程包含下列步骤：
（1）选取健康、饱满的成熟冬小麦或春小麦种子放入三角瓶中，用75%酒精处理3-5分钟，无菌水冲洗1-3次，0.1%升汞溶液处理7-15分钟，最后用无菌水冲洗3-5次，在三角瓶中加入无菌水，于25℃条件下浸泡14-18h，备用；
（2）在超净工作台中，用灭过菌的刀或针取出冬小麦或春小麦种子成熟胚，接入诱导培养基上培养，一周后保留幼苗基部生长部位，切去伸展的叶片组织和根组织，每15d继代一次；继代时保留膨大基部并切去伸展的叶片组织，培养至30天以后可获得外露或被残留叶片包被、表面光滑、呈绿色或浅绿色的细胞组织致密的分生组织团（直径>5mm），培养至40d~50d为分生组织团产生高峰；前述培养过程中的前15d进行暗培养，之后进行光培养，每天光照16h，光照强度为2000lux，培养温度为25±2℃；
（3）将步骤（2）所得的分生组织团接入分化培养基上培养，至产生丛生芽；
（4）将步骤（3）所得的丛生芽分离后接入生根培养基上培养至获得生根苗；
（5）依据小麦的类型，将步骤（4）所得的冬小麦生根苗进行春化处理，即在4℃下处理15-25d，对所获得的春小麦生根苗不进行春化处理；将上述生根苗炼苗后移栽；
上述步骤中涉及的培养基组分及配比如下所示：
诱导培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.1g/L谷氨酰胺+0.3g/L脯氨酸+0.5g/L水解酪蛋白+2～5mg/L噻二唑苯基脲（TDZ）+0.5～1mg/L 2,4-D，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调该培养基的pH至5.8；在121℃，即0.1～0.15MPa高压蒸汽下灭菌15分钟；
分化培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.5～1mg/L噻二唑苯基脲（TDZ），琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调该培养基的pH至5.8；在121℃，即0.1～0.15MPa高压蒸汽下灭菌15分钟；
生根培养基：1/2MS基本培养基+15g/L葡萄糖+0.5～1.5mg/L吲哚丁酸（IBA），琼脂4～6g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调该培养基的pH至5.8；在121℃，即0.1～0.15MPa高压蒸汽下灭菌15分钟；
申请人提供了上述发明在小麦遗传转化中的应用，它包含如下步骤：
（1）将冬小麦或春小麦的种子灭菌：选取健康、饱满的成熟冬小麦或春小麦种子放入三角瓶中，用75%酒精处理3-5分钟，无菌水冲洗1-3次，0.1%升汞溶液处理7-15分钟，最后用无菌水冲洗3-5次，在三角瓶中加入无菌水，于25℃条件下浸泡14-18h，备用；
（2）在超净工作台中，用灭过菌的手术刀或解剖针取出冬小麦或春小麦种子成熟胚，接入诱导培养基上培养，一周后保留幼苗基部生长部位，切去伸展的叶片组织和根组织，每15d继代一次；继代时保留膨大基部并切去伸展的叶片组织，培养至30天以后获得外露或被残留叶片包被、表面光滑、呈绿色或浅绿色的细胞组织致密的分生组织团，其直径>5mm，培养至40d~50d为分生组织团产生高峰；前述培养过程中的前15d进行暗培养，之后进行光培养，即每天光照16h，光照强度为2000lux，培养温度为25±2℃；
（3）选取冬小麦或春小麦分生组织团进行遗传转化，即：基因枪轰击前4-6h将小麦分生组织团接入高渗培养基，在1100psi/6cm或1350psi/9cm条件下轰击，轰击后继续在高渗培养基上处理16～18h；
（4）将步骤（3）转化后的材料接入筛选培养基中，培养30-60d，得到再生抗性幼芽；
（5）将步骤（4）得到的抗性幼芽少量进行GUS染色，鉴定转基因是否成功，将大量抗性幼芽接入生根筛选培养基中，直至得到生根苗；
（6）将步骤（5）得到的生根苗中的冬小麦进行春化处理，即在4℃下处理15-25d，对春小麦无需进行春化处理；将上述生根苗炼苗后移栽，得到抗性植株；
（7）对步骤（6）获得的抗性植株进行GUS染色或进行PCR扩增或除草剂抗性检测以鉴定是否为转基因植株；
（8）采用touchdown PCR方法进行扩增，扩增用的引物对的DNA序列如下所示：
上游引物：5'-CAAATCTCGGTGACGGGCAGGA-3'
下游引物：5'-CTGCACCATCGTCAACCACTACATCG-3'
反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复2个循环；后随退火温度递减2度重复3个循坏即：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，重复2个循环……至退火温度为44℃，重复16个循环；72℃继续延伸5min；10℃保温1h。
（9）用含有200mg/L草丁膦的水溶液涂抹抗性植株叶片的两面，将6d后转基因植株保持绿色或仅叶尖部位呈黄色的植株保留，将叶片尖端至叶中明显变黄的非转基因植株剔除；
上述培养中的培养基组分及配比如下所示：
诱导培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.1g/L谷氨酰胺+0.3g/L脯氨酸+0.5g/L水解酪蛋白+2～5mg/L噻二唑苯基脲+0.5～1mg/L 2,4-D，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调该培养基的pH至5.8；在121℃，即0.1～0.15MPa高压蒸汽下灭菌15分钟；
高渗培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.1g/L谷氨酰胺+0.3g/L脯氨酸+0.5g/L水解酪蛋白+2～5mg/L噻二唑苯基脲（TDZ）+0.5～1mg/L2,4-D+0.4mol/L甘露醇，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调该培养基的pH至5.8；在121℃，即0.1～0.15MPa高压蒸汽下灭菌15分钟；
筛选培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.5～1mg/L噻二唑苯基脲（TDZ）+5mg/L草丁膦（basta），琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调该培养基的pH至5.8；在121℃，即0.1～0.15MPa高压蒸汽下灭菌15分钟；其中basta在灭菌后加入，添加方法为，在超净工作台上向冷却后的培养基中加入basta混匀备用
生根筛选培养基：1/2MS基本培养基+15g/L葡萄糖+0.5～1.5mg/L吲哚丁酸（IBA）+2mg/Lbasta，琼脂4～6g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调该培养基的pH至5.8；在121℃，即0.1～0.15MPa高压蒸汽下灭菌15分钟；其中basta在灭菌后加入，添加方法为，在超净工作台上向冷却后的培养基中加入basta混匀备用
本发明选用小麦成熟胚经诱导培养得到分生组织团，具有比愈伤组织再生能力强，快速获得大量再生苗，且取材容易，不受季节限制，操作过程简单易行，培养周期短等特点。利用分生组织团进行遗传转化，能快速得到大量转基因植株。与幼胚愈伤组织相比，再生更容易，转化频率更高，解决了小麦遗传转化中再生难、转化频率低的问题，加快了育种进程，是一种适于小麦遗传转化的新型受体。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是本发明的引物扩增bar基因的片断，序列长度为489bp。
图1以成熟胚诱导培养分生组织团及分生组织团的分化再生过程。图中：
A-1、成熟胚形态（盾片向上）A-2、成熟胚形态（盾片向下）；B、种子出芽7d形态，图中线条所示为切苗位置；C、分生组织团形态；D、分生组织团再生成苗；E、再生苗生根；F、再生苗移栽成熟。
图2分生组织团分级及其对应的细胞形态结构。图中：
A、I级分生组织团形态；B、II级分生组织团形态；C、III级分生组织团形态；D、I级分生组织团石蜡切片；E、II级分生组织团石蜡切片；F、III级分生组织团石蜡切片。
图3载体pCAMBIA3301的物理图谱。
图4转基因组织和转基因植株GUS表达情况。图中：
A、抗性分生组织团；B、抗性丛生苗；C、T0植株授粉2-3d的子房；D、T2植株授粉5-7d的子房；E、T2植株的花药；F、T2植株的花器。
图5转基因植株bar基因的PCR检测。图中：
A、T0代Bar基因PCR扩增：从左至右依次为Marker；空白对照水(W)；阴性对照(非转基因植株DNA)；阳性对照质粒(P)；样品1-76；
B、T1代Bar基因PCR扩增：从左至右依次为Marker；空白对照水(W)；阴性对照（非转基因植株）(CK)；阳性对照质粒(P)；样品B1-B3、C1-C8。
图6转基因植株除草剂抗性试验结果。图中：
A、对照（非转基因植株）；B-C、转基因植株叶片。
具体实施方式
实施例1：不同基因型小麦成熟胚分生组织团的诱导培养
1、选取16个小麦栽培品种（见表1）的健康、饱满成熟种子放入三角瓶中，用75%酒精处理3-5分钟，无菌水冲洗1-3次，0.1%升汞溶液处理7-15分钟，最后用无菌水冲洗3-5次，在三角瓶中加入无菌水，于25℃条件下浸泡14-18h，在超净工作台中，用无菌的刀或针取出小麦种子成熟胚（见图1A），接入诱导培养基上培养，一周后保留幼苗基部生长部位，切去伸展的叶片组织和根组织（见图1B），每15d继代一次。继代时仍保留膨大基部并酌情切去伸展的叶片组织，大约30天以后即可出现直径>5mm分生组织团（见图1C）。40d-50d为出现的高峰。分生组织团外露或被残留叶片包被，表面光滑，呈绿色或浅绿色，细胞组织致密。培养过程中前15d进行暗培养，之后进行光培养，培养条件为25±2℃，每天16h光照，光照强度为2000lux,3d时统计总胚数，去除种子本身质量影响和操作污染影响，7d时统计出芽率、15d时统计出侧芽发生率，45d时统计分生组织团发生率。所得数据采用SPSS软件进行方差分析。
数据按照以下公式计算：
出芽率=出芽数/剥胚数×100%
侧芽率=出侧芽数/剥胚数×100%
多芽团率=多芽团数/出芽数×100%
试验发现，16个小麦品种均能诱导出分生组织团（见表1），诱导率45.37%～167.22%，不同基因型分生组织团诱导率不同是受出芽率及种子本身质量和操作污染等因素影响。诱导出的分生组织团放置于分化培养基上，经过15d以后可以分化出丛生芽，30d以后分化出多个苗，这些苗接入生根培养基上能正常生根，春化（冬小麦需在4℃下处理15-25d，春小麦无需进行春化处理），上述生根苗炼苗移栽后可正常完成生长周期。
上述实施例中涉及的培养基组分及配比如下所示：
诱导培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.1g/L谷氨酰胺+0.3g/L脯氨酸+0.5g/L水解酪蛋白+2～5mg/L噻二唑苯基脲（TDZ）+0.5～1mg/L 2,4-D，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L。灭菌前调培养基的pH至5.8；121℃，0.1～0.15MPa，灭菌15分钟。
分化培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.5～1mg/L噻二唑苯基脲（TDZ），琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L。,灭菌前调培养基的pH至5.8；121℃，0.1～0.15MPa，灭菌15分钟。
生根培养基：1/2MS基本培养基+15g/L葡萄糖+0.5～1.5mg/L吲哚丁酸（IBA），琼脂4～6g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L。,灭菌前调培养基的pH至5.8；121℃，0.1～0.15MPa，灭菌15分钟。
表1 16个小麦品种多芽团的诱导
| 品种 | 胚数 | 出芽率（%） | 出侧芽率（%） | 分生组织团诱导率（%） |
| 鄂麦14 | 46 | 47.46±3.37fg | 70.20±6.15ab | 167.22±4.34a |
| 冀7369 | 58 | 65.33±3.97de | 80.45±7.13a | 143.99±10.74ab |
| 藁优9415 | 72 | 43.06±1.39g | 45.83±2.41cd | 132.12±6.15b |
| 烟2415 | 71 | 64.79±3.61de | 70.47±2.10ab | 105.18±8.30c |
| 石麦14 | 53 | 22.55±2.93hh | 11.33±0.22f | 101.67±13.02c |
| 衡观35 | 53 | 86.97±8.34ab | 70.84±4.56ab | 87.03±6.90cd |
| 良星99 | 129 | 84.51±0.61ab | 58.92±0.41bc | 86.21±1.69cd |
| 长6135 | 90 | 90.00±3.85ab | 46.67±1.93cd | 83.21±6.42cd |
| 龙麦30 | 81 | 85.13±2.27ab | 60.32±4.08bc | 79.69±1.32cde |
| 龙麦31 | 90 | 82.22±2.94abc | 53.33±5.77c | 76.78±3.61cde |
| 衡5229 | 66 | 68.21±2.30cde | 32.00±3.47de | 71.17±1.33def |
| 邯6172 | 93 | 80.64±4.93bc | 53.76±3.88c | 67.83±2.72def |
| 济麦22 | 85 | 48.24±1.03fg | 25.82±2.80ef | 63.19±7.75def |
| 郑9023 | 90 | 75.55±2.22bcd | 36.67±1.93de | 58.84±2.64def |
| 科农199 | 76 | 96.29±2.07a | 32.98±0.91de | 52.22±3.52ef |
| 华麦13 | 90 | 57.78±2.22ef | 24.44±4.01ef | 45.37±10.68f |
注：不同小写字母表示处理间差异显著，差异显著性水平P<0.01，上述小麦品种来源见《遗传资源来源披露登记表》，均为中国国家或中国相关省审定的允许公开推广应用的品种。
2、分生组织团的生长规律及分级（见图2）
在诱导培养基上培养30d后就有分生组织团形成，一般来自于主茎或侧芽，继续继代培养大多数原侧芽生长成为分生组织团，40d～50d为分生组织团形成的高峰期，同时仍有少数侧芽在主茎基部形成，这些侧芽继代培养至70d仍可形成分生组织团。按照分生组织团的特殊性，结合其生长状态可将分生组织团分为3级，各阶段特点见表2。
表2分生组织团的分级
如上述试验结果所示，成熟胚分生组织团的诱导具有可重复性，可在多个小麦栽培品种上实现诱导，分生组织团表面光滑致密，细胞生长状态均一，再生能力极强，尤其是I级团（见图2A），可快速得到大量再生苗，是小麦遗传转化的理想受体。
实施例2：分生组织团在小麦基因枪遗传转化中的应用
1、微弹制备（5枪用量）：吸取50μl金粉（2.5mg）加入1.5ml硅化离心管中，在涡旋仪上依次加入5μl质粒pCAMBIA3301（见图3）DNA（1μg/μl），50μl2.5M氯化钙，20μl0.1M亚精胺，于4℃持续涡旋20min后3000r/min离心1min，弃上清，70%乙醇（色谱纯/光谱纯）洗涤3次，无水乙醇（色谱纯/光谱纯）洗涤2次，加入50μl 100%乙醇（色谱纯/光谱纯），重新悬浮包被有DNA的金粉，并保存于冰上直至使用。
基因枪轰击（基因枪Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System，购自伯乐公司），将小麦郑9023（来源河南省农业科学院小麦研究所和西北农林科技大学审定品种）成熟胚诱导培养出的分生组织团接入高渗培养基4-6h，在1100psi/6cm或1350psi/9cm条件下进行轰击，在高渗培养基上继续培养16-18h，接入筛选培养基，每15d用筛选培养基继代一次。
2、将筛选30-60天的基因枪转化的抗性幼芽分别接入生根筛选培养基，直至生根，将生根苗进行春化处理，即在4℃下处理15-25d，炼苗后移栽；
上述实施例中的培养基组分及配比如下所示：
高渗培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.1g/L谷氨酰胺+0.3g/L脯氨酸+0.5g/L水解酪蛋白+2～5mg/L噻二唑苯基脲（TDZ）+0.5～1mg/L 2,4-D+0.4mol/L甘露醇，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L。灭菌前调培养基的pH至5.8。灭菌方法同本说明书的前述部分，为本领域常用方法（下同）。
筛选培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.5～1mg/L噻二唑苯基脲（TDZ）+5mg/Lbasta，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L。灭菌前调培养基的pH至5.8，其中basta在灭菌后加入，添加方法为，在超净工作台上向冷却后的培养基中加草丁膦（basta）混匀备用。
生根筛选培养基：1/2MS基本培养基+15g/L葡萄糖+0.5～1.5mg/L吲哚丁酸（IBA）+2mg/Lbasta，琼脂4～6g/L；灭菌前调培养基的pH至5.8，其中basta在灭菌后加入，添加方法为，在超净工作台上向冷却后的培养基中加basta混匀备用。
3、转基因小麦的鉴定
（1）转基因小麦gus基因（基因登录号AF234311.1）表达检测结果表明，分生组织团GUS阳性率为58.33%～84.38%。并对部分T1子房染色（见图4）表明gus基因已稳定整合入小麦基因组中。具体步骤如下：将转基因小麦材料置于EP管中，加入可淹没待检材料的90%丙酮，冰上处理15min；弃丙酮，加入可淹没外植体的工作液室温下洗涤2次，每次15min；弃工作液，加入可淹没外植体的染色液，37±1℃恒温培养箱过夜，观察结果。
GUS染色液配方参照Jefferson（1987）的方法：
配制50mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）：A液:称取NaH2PO4．2H2O3.12g溶于无菌蒸馏水，定容至100ml。B液：称取Na2HPO4．12H2O7.7g溶于无菌蒸馏水，定容至100ml。取39mlA液与61ml B液混合。
配制溴吲哚葡萄糖醛酸苷氯X-Gluc母液：称5mgX-Gluc，溶于1mlDMF（二甲基甲酰胺）。
染色液配制：50mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0），0.1%TritonX-100，亚铁氰化钾5mmol/L，高铁氰化钾5mmol/L，溴吲哚葡萄糖醛酸苷氯（X-Gluc）0.5mg/ml。
工作液配制：50mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0），0.1%TritonX-100，亚铁氰化钾5mmol/L，高铁氰化钾5mmol/L。
（2）转基因小麦bar基因（基因登录号JQ655420.1）分子检测（见图5）。T0代76个样品结果显示43个阳性，阳性率56.58%。T1代检测结果表明bar基因已稳定整合到小麦基因组中。检测方法如下：
采用CTAB法（参见王关林等2002报道的方法）提取小麦叶片基因组DNA；
采用touchdown PCR法（参见Don R，et al.1991报道的方法）进行PCR扩增；
上游引物：5'-CAAATCTCGGTGACGGGCAGGA-3'
下游引物：5'-CTGCACCATCGTCAACCACTACATCG-3'
扩增片断长度为489bp（见序列表SEQ ID NO：1）
PCR反应体系：10×PCR Buffer（Mg2+)2μl，1mmol/L dNTP3μl，10μmol/L上游引物和下游引物各1μl，Taq酶(1U/μl)0.2μl，模板DNA1μl，补超纯水至总体积为20μl。
PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复2个循环；后随退火温度递减2度重复3个循坏即：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，重复2个循环……至退火温度为44℃重复16个循环；72℃继续延伸5min；10℃保温1h。PCR扩增产物在含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，紫外荧光下观察结果并照相（见图5）。
（3）转基因小麦除草剂抗性鉴定表明，将T0代转基因植株用含有200mg/L草丁膦（Basta）的水溶液涂抹叶片（两面）6d后非转基因植株（对照）叶片明显变黄枯萎（见图6A），转基因植株仍保持绿色（见图6B），或仅叶尖部位少许变黄（见图6C），说明bar基因已经在小麦转基因植株中稳定表达，使小麦转基因植株表现出对除草剂草丁膦的抗性。
参考文献
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Claims (1)
1.一种利用小麦成熟胚培养进行小麦遗传转化的方法，其特征在于如下步骤：
(1)将冬小麦或春小麦的种子灭菌：选取健康、饱满的成熟冬小麦或春小麦种子放入三角瓶中，用75％酒精处理3-5分钟，无菌水冲洗1-3次，0.1％升汞溶液处理7-15分钟，最后用无菌水冲洗3-5次，在三角瓶中加入无菌水，于25℃条件下浸泡14-18h，备用；
(2)在超净工作台中，用灭过菌的手术刀或解剖针取出冬小麦或春小麦种子成熟胚，接入诱导培养基上培养，一周后保留幼苗基部生长部位，切去伸展的叶片组织和根组织，每15d继代一次；继代时保留膨大基部并切去伸展的叶片组织，培养至30天以后获得外露或被残留叶片包被、表面光滑、呈绿色或浅绿色的细胞组织致密的分生组织团，其直径>5mm，培养至40d～50d为分生组织团产生高峰；前述培养过程中的前15d进行暗培养，之后进行光培养，即每天光照16h，光照强度为2000lux，培养温度为25±2℃；
(3)选取冬小麦或春小麦分生组织团进行遗传转化，即：基因枪轰击前4-6h将小麦分生组织团接入高渗培养基，在1100psi/6cm或1350psi/9cm条件下轰击，轰击后继续在高渗培养基上处理16～18h；
(4)将步骤(3)转化后的材料接入筛选培养基中，培养30-60d，得到再生抗性幼芽；
(5)将步骤(4)得到的抗性幼芽少量进行GUS染色，鉴定转基因是否成功，将大量抗性幼芽接入生根筛选培养基中，直至得到生根苗；
(6)将步骤(5)得到的生根苗中的冬小麦进行春化处理，即在4℃下处理15-25d，对春小麦无需进行春化处理；将上述生根苗炼苗后移栽，得到抗性植株；
(7)对步骤(6)获得的抗性植株进行GUS染色或进行PCR扩增或除草剂抗性检测以鉴定是否为转基因植株；
步骤(7)中所述的PCR扩增方法为：
上游引物：5'-CAAATCTCGGTGACGGGCAGGA-3'，
下游引物：5'-CTGCACCATCGTCAACCACTACATCG-3'；
反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复2个循环；后随退火温度递减2度重复3个循坏即：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，重复2个循环，至退火温度为44℃，重复16个循环；72℃继续延伸5min；10℃保温1h；
步骤(7)中所述的除草剂抗性检测方法为：
用含有200mg/L草丁膦的水溶液涂抹抗性植株叶片的两面，将6d后转基因植株保持绿色或仅叶尖部位呈黄色的植株选留，将叶片尖端至叶中明显变黄的非转基因植株剔除；
上述步骤(2)至(5)中的培养基组分及配比为：
诱导培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.1g/L谷氨酰胺+0.3g/L脯氨酸+0.5g/L水解酪蛋白+2～5mg/L噻二唑苯基脲+0.5～1mg/L 2,4-D，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8；
高渗培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.1g/L谷氨酰胺+0.3g/L脯氨酸+0.5g/L水解酪蛋白+2～5mg/L噻二唑苯基脲+0.5～1mg/L 2,4-D+0.4mol/L甘露醇，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8；
筛选培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.5～1mg/L噻二唑苯基脲+5mg/L草丁膦，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调培养基的pH至；5.8；在121℃，即0.1～0.15MPa下高压蒸汽灭菌15分钟；其中草丁膦在灭菌后加入，添加方法为，在超净工作台上向冷却后的培养基中加入草丁膦混匀备用；
生根筛选培养基：1/2MS基本培养基+15g/L葡萄糖+0.5～1.5mg/L吲哚丁酸+2mg/L草丁膦，琼脂4～6g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调该培养基的pH至5.8；在121℃，即0.1～0.15MPa下高压蒸汽灭菌15分钟；其中草丁膦在灭菌后加入，添加方法为，在超净工作台上向冷却后的培养基中加入草丁膦混匀备用。
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