CN103215307B - 农杆菌介导梅花成熟子叶再生体系的遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的梅花成熟子叶再生体系的遗传转化方法。本发明的步骤包括遗传转化、筛选再生、GUS染色检测和PCR检测。其特征在于，通过农杆菌介导将GUS报告基因和PmCBFb基因导入受体梅花成熟子叶细胞中，对影响梅花成熟子叶转化的不同因素进行了筛选，利用卡那霉素作为选择剂，对转化后的受体细胞进行筛选，再通过GUS染色或PCR检测等辅助方法筛选得到转基因梅花植株。本发明的优点在于，本发明的遗传转化体系不经过体细胞胚发生途径，直接获得转基因植株，因而显著提高了梅花的遗传转化效率。

Description

农杆菌介导梅花成熟子叶再生体系的遗传转化方法

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及以通过农杆菌介导、利用梅花成熟子叶再生体系进行遗传转化方法。

背景技术

梅花(Prunus mume)属于蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)植物，是中国十大传统名花之一，国外仅日本、朝鲜、新西兰等少数几个国家有种植。根据植物采集家的实际工作和中、日若干古籍的记载，肯定了中国乃梅之故乡。梅花主要分布于我国的长江流域及整个江南地区。川、滇、藏交界的横断山区和云贵高原一带被认为是梅、半野生梅的自然分布中心，即梅的变异与种质多样化中心。在我国有7000年以上的应用史和2000年以上的栽培史。梅花集色、香、姿、韵于一身，有“梅天下尤物”的美称，具有极高的观赏价值。其生性较为耐寒(一般能耐-5℃的低温)，且开花较早，能在早春怒放。

然而，梅花一般不能抵御-15℃--20℃的低温，仅杏梅系的品种除外。梅花绝大多数品种(多属真梅系)集中分布于我国长江流域一带，在北方梅花品种则较少且主要以杏梅系和樱李梅系为主，少见真梅系品种，有“南梅北杏”之称。此外，梅花切花品种较少。为了使梅花在我国分布范围更为广泛，为了使梅花的栽培应用国际化，培育出大量的抗寒品种势在必行。

传统的梅花品种选育和品质改良多采用实生苗选种、杂交育种等，这些方法周期长、偶然性大、消耗大量人力物力，且受季节限制，同时在性质改良上局限性很大。而现代化的生物技术，特别是植物基因工程的应用则可以克服传统育种方法的局限性，可以使我们在较短的育种周期内获得大量符合我们要求的植株。植物基因工程技术在保持品种的其他性状相对稳定的基础上，能够利用外源基因对其所控制的性状进行定向改良，从而为培育梅花新品种提供了新的途径。

要获得转基因植物，最重要的前提是要建立遗传转化体系所需的植株再生体系。目前梅花再生体系的建立还存在较大的难度，目前只有从樱李梅系的‘美人’梅叶片再生出不定芽，并获得完整植株，所以有关梅花遗传转化成功的报道非常有限。目前只有一篇关于梅花遗传转化的报道，Mei Gao et al.(2010)以梅花品种‘Nanko’的未成熟子叶作为遗传转化受体，利用体细胞胚发生途径，经农杆菌侵染、共培养、选择培养、萌发培养、增殖培养和生根培养，转化GUS报告基因并得到抗性植株。这篇报道采用梅花未成熟子叶作为转化受体材料，通过体细胞胚发生途径，建立了一个遗传转化体系并且得到了抗性植株，但是转化效率极低，而且体细胞胚的诱导对于未成熟子叶的大小有严格的要求，当未成熟子叶为2-3mm长的时候，诱导效率最高，小于或者大于2-3mm的时候诱导效率均很低，这对于外植体的采样时间有严格要求，一年只能够采样一次，而且未成熟的果实容易腐烂不易保存，不能周年进行细胞培养和生产；并且在遗传转化的过程中，未成熟子叶经侵染和共培养后延迟筛选7d，这势必导致假阳性率高，转化效率低，这些都不利于转化。目前，国内外还没有关于以梅花成熟子叶为受体进行遗传转化的成功报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种以梅花成熟子叶再生体系为基础，通过农杆菌介导的方法，建立一种梅花遗传转化体系，该体系不需要通过胚发生途径，直接获得转基因植株。

本发明的技术方案如下：

一种农杆菌介导的梅花成熟子叶直接再生体系的遗传转化方法，其步骤包括遗传转化及植株鉴定，其特征在于，以梅花成熟子叶作为遗传转化的受体材料，不经过体细胞胚发生途径，通过直接的器官发生途径获得转化植株，其步骤经预培养、农杆菌侵染、共培养、选择培养、成苗培养和生根培养，将GUS报告基因和正义PmCBFb基因导入受体细胞，利用抗生素进行抗性筛选，通过GUS化学染色或PCR检测筛选得到转基因植株，其步骤如下所示：

1)预培养：将消毒后梅花成熟子叶接种到成熟子叶再生培养基中，置于24±2℃，光照强度为20001x光下预培养0-5d；

2)菌株的制备：从-70℃冰箱中取出保存的包含有GUS报告基因和正义PmCBFb基因的农杆菌EHA105，用接种环在100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，然后将平板倒置于28℃温箱中黑暗培养直至单菌落产生；挑取单菌落接种于100mg/L卡那霉素LB液体培养基中，在28℃恒温摇床上200r/min振荡培养过夜；然后将对数生长期为OD₆₀₀＝0.6-0.8的菌液从三角瓶中转入无菌的50ml离心管中，4000r/min离心10min，去上清液，将收集得到的农杆菌置于100μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基中，作为重悬液使用，在28℃恒温摇床上200r/min重悬培养2-4h后用于转化受体的侵染；

3)侵染：将步骤1)的梅花成熟子叶再生培养基中生长健壮、无污染的子叶转入步骤2)中制备好的农杆菌菌液侵染10-30min，期间每隔2-3分钟摇动一下；

4)共培养：将步骤3)中侵染过的梅花成熟子叶放在滤纸上除去菌液后接种到共培养培养基中，置于24±2℃，黑暗条件下培养1-5d；

5)选择培养：将步骤4)中共培养后的梅花成熟子叶转入选择培养基中，置于24±2℃光下培养，光照强度为20001x，每两周补充一次新鲜选择培养基直至不定芽分化；

6)成苗培养：将步骤5)中再生出的不定芽接种到到成苗培养基培养，对获得的抗性芽进一步的筛选和促进生长，于光下培养，光照强度为20001x，每四周补充一次新鲜的成苗培养基，直到得到抗性苗；

7)生根培养：将步骤6)获得的抗性苗切成2-3厘米长的茎段转入生根培养基中进行生根培养，光下培养，光照强度为20001x，直到获得抗性植株；

8)将步骤7)中获得的转GUS报告基因的抗性苗进行GUS化学染色，验证获得转基因植株；或

提取步骤7)中获得的转正义PmCBFb基因植株的基因组DNA，进行PCR检测，验证获得转基因植株；

培养基组分及配制：

成熟子叶再生培养基：1/2MS，6-苄基腺嘌呤1.0-2.0mg/L，α-萘乙酸0.2mg/L，噻二唑苯基脲0.2-0.4mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH6.0；

共培养培养基：1/2MS，6-苄基腺嘌呤1.0-2.0mg/L，α-萘乙酸0.2mg/L，噻二唑苯基脲0.2-0.4mg/L，乙酰丁香酮100μmol/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH6.0；

选择培养基：1/2MS，6-苄基腺嘌呤1.0-2.0mg/L，α-萘乙酸0.2mg/L，噻二唑苯基脲0.2-0.4mg/L，卡那霉素20mg/L，头孢霉素300mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH6.0；

成苗培养基：1/2MS，玉米素1.0mg/L，3-吲哚乙酸0.1mg/L，卡那霉素20mg/L，头孢霉素300mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH6.0；

生根培养基：1/2MS，α-萘乙酸0.5mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH6.0。

作为优选方案，步骤1)中所述的成熟子叶预培养时间为3d。

作为优选方案，步骤3)中所述的农杆菌的侵染时间为20min。

作为优选方案，步骤4)中所述的农杆菌与转化受体的共培养时间为3d。

本发明的积极效果是：

本发明是国内外首次利用梅花成熟子叶转化报告基因和目的基因获得梅花转基因植株，为今后梅花的遗传改良提供新的技术平台。具体的优点如表1所示。

表1本发明与现有技术的区别

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是GUS(β-葡萄糖苷酸酶)报告基因的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：2是NPTII选择基因的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：3是PmCBFb目的基因的核苷酸序列。

图1：本发明中以梅花成熟子叶为受体的遗传转化技术流程图。

图2：是本发明应用的一个报道的质粒pBI121的物理图谱。

图3：是本发明应用的表达载体pCAMBIA2300s的物理图谱。

图4：本发明中以梅花成熟子叶为受体的GUS瞬时表达检测。图中：

a.未转化成熟子叶染色；b.转化成熟子叶染色；c.转基因植株。

图5：本发明中以梅花成熟子叶为受体再生出抗性不定芽的GUS稳定表达检测。

图6：本发明实施例中由梅花成熟子叶诱导出的不定芽。

图7：本发明实施例中转化PmCBFb目的基因所得的阳性植株，提取其叶片的基因组DNA进行PCR检测结果。(泳道“P”代表农杆菌质粒，泳道“CK”代表未转化的植株，泳道“1”-“11”代表转化得到的植株)。

图8：本发明实施例中转化GUS报告基因，卡那霉素对梅花成熟子叶不定芽诱导率的影响。

具体实施方式

以下实施例进一步定义本发明，但不是限制本发明的保护范围。

实施例1梅花成熟子叶转化获得转基因植株

1.转化受体材料及培养：

：用于本实施例的梅花材料来自于中国(武汉)梅花研究中心晏小兰高级工程师惠增的梅花品系‘雪梅’和‘米单绿’的成熟果实(晏小兰，刘小祥等，2007)，用锤子将成熟的梅花果实敲开，取出梅花成熟胚，再用含有洗衣粉的水浸泡10min后，流水冲洗30min，然后在超菌操作台上用70％的酒精消毒30s，无菌水冲洗1次，然后用0.1％升汞溶液消毒15min，用无菌水冲洗4-5次，用无菌水浸泡约24h后，在无菌操作台上将外植体(梅花成熟子叶)接种到子叶再生培养基中，置于24±2℃，光照强度为20001x光下预培养3d，选择没有污染，生长状况良好的梅花成熟子叶为受体材料。

2.转化载体材料：

1)GUS报告基因

携带GUS报告基因所用的根癌农杆菌菌株为EHA105(由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室宋建坤惠赠)为一种报道和常用的商业菌株，该菌株包含商业质粒pBI121(见GenBank，基因登录号：AF485783.1，该质粒的物理图谱参见图2，其携带GUS报告基因和NPTII选择基因(该GUS基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示)，NPTII选择基因(其核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：2所示)。

2)正义PmCBFb基因

携带正义PmCBFb基因的根癌农杆菌菌株为EHA105(一种报道的商业菌株，由华中农业大学作物园艺植物生物学教育部重点实验室过聪惠增)，该农杆菌包含表达载体pCAMBIA2300s(该载体的原始来源为澳大利亚CAMBIA实验室，一种公开销售的商业载体，其物理图谱参见图3)，该载体正向插入PmCBFb目的基因(其序列见GenBank，登陆号：HM099910.1所示，参见序列表SEQ ID NO：3)，携带NPTII选择基因(见序列表SEQ ID NO：2)。

3.遗传转化方法：

1)受体材料的准备：以梅花‘米单绿’、‘雪梅’(来源同上)成熟子叶为外植体，将所述的外植体成熟子叶接种到成熟子叶再生培养基中，置于24±2℃，光照强度为20001x光下预培养3d(在另外的实施例中预培养时间为0-5d)，为遗传转化提供受体材料；

2)菌株的制备：从-70℃冰箱中取出所保存的农杆菌EHA105(来源同上)，用接种环在含100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，然后将平板倒置于28℃温箱中黑暗培养直至单菌落产生。挑取单菌落接种于含有100mg/L卡那霉素LB液体培养基中，在28℃恒温摇床上200r/min振荡培养过夜。然后将对数生长期的菌液(OD₆₀₀＝0.6-0.8)从三角瓶中转入无菌的50ml离心管中，4000r/min离心10min，去上清液，将收集到的农杆菌菌体置于含有100μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基(作为重悬液使用)中，在28℃恒温摇床上200r/min重悬培养2-4h后用于转化受体的侵染；

3)侵染：将步骤1)中在梅花成熟子叶再生培养基中生长健壮、无污染的子叶转入制备好的菌液侵染20min；

4)共培养：将步骤3)中侵染过的梅花成熟子叶放在滤纸上除去菌液后接种到共培养培养基中，置于24±2℃，黑暗条件下培养3d；

5)选择培养：将步骤4)中共培养后的梅花成熟子叶转入选择培养基中，置于24±2℃光下培养，光照强度为20001x，每两周补充一次新鲜选择培养基直至不定芽分化；

6)成苗培养：将步骤5)中再生出的不定芽接种到到成苗培养基中进行抗性芽的进一步的筛选和促进芽的生长，光下培养，光照强度为20001x，每四周补充一次新鲜的成苗培养基，直到得到抗性苗；

7)生根培养：将步骤6)获得的抗性苗切成2-3厘米长的茎段转入生根培养基中进行生根培养，光下培养，光照强度为20001x，从而获得抗性植株；

本实施例涉及的培养基组分及配比见表

表2本发明的梅花的遗传转化用的培养基设计

注：

1/2MS(MS大量元素减半，其他成分不变，MS培养基参见Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant，1962，15：473-497报道的方法)。

固体或液体LB培养基(含100mg/L Km)，配方是：10g/L蛋白胨+5g/L酵母提取物+10g/L氯化钠，固体培养基中加15g/L琼脂粉，pH值为7.0，液体培养基不加琼脂粉。

1/2MS液体培养基(农杆菌重悬培养基)：1/2MS+100μmol/L AS+蔗糖30.0g/L。

表2中的玉米素(ZT)、3-吲哚乙酸(IAA)、卡那霉素(Kanamycin，Km)、头孢霉素(Cefotaxime，Cef)、乙酰丁香酮(AS)均采用0.45μm滤膜过滤灭菌，在超净工作台上分别加入到灭菌后各培养基中。

培养基中各种成分的代号如下：6-苄基腺嘌呤(6-BA)、α-萘乙酸(α-NAA)、噻二唑苯基脲(Thidiazuron，TDZ)、玉米素(ZT)、3-吲哚乙酸(IAA)、卡那霉素(Kanamycin，Km)、头孢霉素(Cefotaxime，Cef)、乙酰丁香酮(AS)、琼脂、蔗糖均可以从商业上购买。

3.GUS基因表达观察

将共培养后梅花成熟子叶放入GUS染液中，在培养箱中恒温37℃过夜，观察染色结果，此为GUS瞬时表达结果。之后随机选取部分在选择培养基上诱导出的不定芽，进行染色观察(处理方法同上)，即为稳定表达结果。

从图4b可以看出，共培养后的梅花成熟子叶经GUS染液染色及乙醇脱色后，转化的子叶表面可见较多的蓝色斑点，而未转化的材料则没有染上色。从图5可以看出，在选择培养基上诱导出的不定芽经GUS染液染色后，抗性植整体呈现蓝色。

4.抗性植株的PCR检测

用改良的CTAB法(具体步骤如下所述)提取转化后再生植株和未转化植株的叶片基因组DNA作为模板，根据表达载体上携带的CaMV35S启动子(常用)和PmCBFb基因的序列设计引物(引物的核苷酸序列如下所述)，对正义PmCBFb基因进行PCR扩增，以农杆菌质粒DNA作为阳性对照，以未转化植株的叶片DNA作为阴性对照，琼脂糖凝胶电泳检测。

1、提取梅花叶片基因组DNA方法采用改良的CTAB法，具体操作步骤如下：

(1)取4ml提取缓冲液(2g/100ml CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris·Cl，pH8.0)入10ml离心管，预热至65℃。

(2)取梅花的叶片放入研钵中，在液氮中迅速研磨成粉末状。

(3)迅速将粉末状样品转入预热的提取缓冲液(如上所述)中，上下颠倒混匀，65℃水浴30min，每隔5min混匀一次。

(4)水浴完后，将离心管冷却至室温。

(5)向离心管中加入等体积氯仿/异戊醇(体积比24∶1)，充分混匀，冰浴10min.

(6)将离心管在8℃下12000rpm离心10min。

(7)取上清，转入新的10ml离心管，重复操作步骤(5)和(6)。

(8)取上清，转入新的10ml离心管中，加入1/3体积的异丙醇，混匀，-20℃静置30min。

(9)将离心管在8℃下12000rpm离心15min。

(10)弃上清，加入1ml 72％浓度的乙醇漂洗8min。将离心管在8℃下12000rpm离心15min。

(11)弃上清，重复一次步骤(10)-(11)的操作。

(12)弃上清，沉淀在室温下自然微干。

(13)向离心管中加入500μl高盐TE缓冲液(10mmol/L Tris·HCl，1mmol/L EDTA，1mol/L NaCl，pH8.0)溶解沉淀。

(14)每个离心管中加入1μlRnase A，37℃水浴30min，降解RNA。

(15)DNA纯化两次，方法重复第(5)-(12)步，其中将异丙醇用无水乙醇代替进行沉淀。

(16)自然干燥后溶于50μlTE缓冲液(10mmol/L Tris·HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)，于-40℃保存使用。

用于PCR检测的引物对的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’；

反向引物：5’-CCTTCGCAAGACCCTTCCTC-3’。

PCR反应体系：

去离子水          14.4μl；

dNTP(2mM)         0.4μl；

正向引物(10mM)    1μl；

反向引物(10mM)    1μl；

10倍Buffer        2.0μl；

Taq酶(5U/L)       0.2μl；

模板DNA(20ng/μl) 1μl；

反应总体积        20μl。

PCR循环反应参数：94℃预热4min，然后依次在94℃变性30s，59℃退火35s，72℃延伸1min，循环35次后在72℃总延伸10min。PCR扩增产物在含溴化乙锭的1.1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，紫外荧光下观察结果并照相。

PCR扩增结果如图7所示，质粒DNA扩增出现预期大小的片段(大小约900-1000bp，见图7的泳道“P”)，未转化的植株基因组未出现PCR特异扩增片段(见图7的泳道“CK”)，转基因植株经PCR扩增，均得到与质粒DNA扩增产物大小一样的片段(大约为900-1000bp，见图7的泳道“1”-“11”)。

实施例2对比试验的实施例(应用实施例)

1、不同浓度的对梅花成熟子叶再生的影响

本实施例采用不同浓度的6-BA，TDZ，α-NAA的正交实验(表3)来确定最适梅花子叶再生的培养基。方法是将消毒后的梅花‘雪梅’、‘米单绿’成熟子叶接种到不同激素组合的培养基上，光下培养20d后，统计不定芽诱导率及平均再生芽数。不定芽诱导率(％)＝诱导不定芽的外植体数/接种外植体总数×100％，平均再生芽数(个)＝再生不定芽总数/接种外植体总数×100％。

培养约3d后，梅花成熟子叶由白色变成绿色；培养约10d后，梅花成熟子叶基部开始分化出丛状小芽点；培养约15d后，梅花成熟子叶基部的芽点已长成一丛不定芽。将‘雪梅’的成熟子叶在1/2MS+TDZ0.4mg/L+6-BA1.0mg/L+α-NAA0.2mg/L上培养时不定芽诱导率最高，诱导率达91.67％，且此时的平均不定芽诱导数也最高，达19.19个；‘米单绿’的子叶在1/2MS+TDZ0.2mg/L+6-BA2.0mg/L+α-NAA0.2mg/L上培养时不定芽诱导率最高，达89.58％，且此时的平均不定芽诱导数也最高，达16.19个。6-BA为0时，‘雪梅’和‘米单绿’的成熟子叶均未诱导出不定芽(表3)。

表3不同激素组合对梅花成熟子叶再生的影响

2、不同浓度卡那霉素对梅花成熟子叶再生的影响

本实施例所用质粒为pBI121，该质粒携带有选择标记基因为NPTII，对卡那霉素具有抗性。由于梅花成熟子叶用于转化以前未见报道，对较适合的用于转化选择压力的卡那霉素浓度并没有报道，因此，本发明将未转化的梅花成熟子叶接入含不同浓度的卡那霉素的培养基中，观察并统计不同浓度的抗生素对梅花成熟子叶再生的影响，以确定适宜的抗生素浓度。

以梅花‘雪梅’、‘米单绿’成熟子叶为外植体，确定卡那霉素对其再生的影响，以选择相应的卡那霉素选择压力用于转化。将成熟子叶接种于附加不同浓度卡那霉素的叶片再生培养基(1/2MS+6-BA1.0-2.0mg/L+α-NAA0.2mg/L+TDZ0.2-0.4mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂7.5g/L，pH6.0)上，设0、10、15、20、25和30mg/L六种卡那霉素浓度梯度(卡那霉素过滤灭菌后加入培养基至相应浓度)。每15天更换一次新鲜培养基，30天后统计不定芽诱导率。

本发明中发现，梅花成熟子叶接种到含有卡那霉素的培养基上，生长会受到抑制。不定芽诱导率随卡那霉素浓度增大而逐渐降低，当卡那霉素10-15mg/L时，‘雪梅’、‘米单绿’成活率就由对照的90.28％、88.89％迅速下降到25.00％、22.22％，但仍未达到亚致死浓度(抗生素选择浓度略低于全部致死浓度)。当卡那霉素浓度为20mg/L时，‘雪梅’和‘米单绿’不定芽诱导率仅为2.78％和1.39％；当卡那霉素浓度增加到25-30mg/L时，全部外植体均不能分化出不定芽(图8)。为了保证有较大数量的阳性转化子，因此本发明的选择培养基中卡那霉素的最适浓度为20mg/L(见图8)。

3、预培养时间对农杆菌侵染后GUS瞬间表达、不定芽诱导率的影响

将梅花‘雪梅’、‘米单绿’成熟子叶在再生培养基中分别预培养0、1、3、5d。在相同转化条件下进行农杆菌(含有GUS的农杆菌EHA105)侵染实验，经共培养并脱菌培养后，随机抽取部分外植体进行GUS瞬时表达的染色，观察预培养时间对农杆菌侵染后GUS瞬间表达的影响，30天后统计抗性芽的诱导率。

对梅花成熟子叶GUS瞬间表达的情况进行观察，实验结果表明，不同预培养时间对GUS瞬间表达影响较大(表4)。从表4中可以看出，预培养0d时，外植体的瞬间表达率均为0。瞬间表达率以预培养3d效果最好，‘雪梅’和‘米单绿’均高达75％以上，其抗性芽诱导率也较高。预培养时间达到5d，虽然抗性芽诱导率有所提高，但瞬间表达率显著下降，表明假阳性的抗性芽增多。所以，以‘雪梅’和‘米单绿’成熟子叶为受体进行梅花的遗传转化时，预培养的最佳时间为3d。

表4预培养时间对梅花成熟子叶转化的影响

4、侵染时间对GUS瞬间表达、不定芽诱导率的影响

将预培养3d后的梅花‘雪梅’和‘米单绿’成熟子叶分别用制备好的农杆菌(含有GUS的农杆菌EHA105)菌液侵染10、20、30min，经共培养并脱菌培养后，随机抽取部分外植体进行GUS瞬时表达的染色，观察侵染时间对GUS瞬间表达的影响，30天后统计抗性芽的诱导率，以确定最佳农杆菌侵染时间。

不同侵染时间对梅花的成熟子叶转化的实验结果见表5。由表5，侵染10min时，‘雪梅’和‘米单绿’的抗性芽诱导率虽然均达到最高，但是瞬间表达率均较低，势必导致假阳性的不定芽增多。侵染20min时，‘雪梅’和‘米单绿’的抗性芽诱导率均较低，但瞬间表达率均达到最高，分别为80.56％和75.00％。侵染30min时，‘雪梅’和‘米单绿’的瞬间表达率及抗性芽诱导率均较低，主要原因可能是侵染时间过长导致农杆菌对外植体分化造成了较大的伤害，致很多外植体褐化死亡。故，以‘雪梅’和‘米单绿’成熟子叶为遗传转化的受体时，农杆菌的侵染时间以20min为最佳时间。

表5侵染时间对梅花成熟子叶转化的影响

5、共培养时间对GUS瞬间表达、不定芽诱导率的影响

将侵染20min后的子叶分别在共培养培养基中共培养1、3、5d(暗培养)，比较不同共培养时间对GUS瞬间表达、不定芽诱导率的影响，以确定最佳共培养时间。

实验结果表明(表6)，共培养1d时，未见农杆菌菌落生长且‘雪梅’和‘米单绿’的瞬间表达率均较低；共培养3d时，成熟子叶周围出现微菌落，且‘雪梅’和‘米单绿’的瞬间表达率达最高，分别为77.78％及72.22％；当共培养时间延长至5d时，瞬间表达率较高，但是有部分农杆菌菌落在选择培养基中难以抑制，对外植体(成熟子叶)的分化不定芽有较强的毒害作用。因此，以‘雪梅’和‘米单绿’成熟子叶遗传转化受体时，以共培养3d为宜。

表6共培养时间对梅花成熟子叶转化的影响

附录说明：

GUS染色检测表达采用组织化学染色法及GUS染色液的基本配方参照：王关林，方宏筠.2002，植物基因工程.科学出版社，具体配比如下：

(1)X-Gluc  50mg；

(2)50mmol磷酸缓冲液80ml(从A、B混合液中取)

A：NaH₂PO₄·2H₂O  3.12g加蒸馏水定容至100ml；

B：Na₂HPO₄·12H₂O 7.17g加蒸馏水定容至100ml；

从A、B液中分别取39ml和61ml混合定容至400ml；PH调至7.0；

(3)20％甲醇           20ml；

(4)0.5mol EDTA        2ml；

(5)1％Triton X-100    1ml；

(6)双蒸水定容至100ml。

参考文献

1、吕英民，曹亮，张启翔.梅花品种‘美人’叶片离体再生体系建立.分子植物育种，2006，4(6)：887-894。

2、王关林，方宏筠.植物基因工程.第二版.北京：科学出版社，2002。

3、晏小兰，刘小祥，陶冬枝，张波，袁华.武汉梅园花果兼用梅花品种性状表现及栽培初探.北京林业大学学报，2007，29：45-47。

4、Mei Gao，Makiko Kawabe，Tatsuya Tsukamoto，Hiromi Hanada，Ryutaro Tao.Somatic embryogenesisand Agrobacterium-mediated transformation of Japanese apricot(Prunus mume)using immaturecotyledons.Scientia Horticulturae，2010，124：360-367。

Claims (4)

1.一种农杆菌介导的梅花成熟子叶直接再生体系的遗传转化方法，其步骤包括遗传转化及植株鉴定，其特征在于，以梅花成熟子叶作为遗传转化的受体材料，不经过体细胞胚发生途径，通过直接的器官发生途径获得转化植株，其步骤经预培养、农杆菌侵染、共培养、选择培养、成苗培养和生根培养，将GUS报告基因和正义PmCBFb基因导入受体细胞，利用抗生素进行抗性筛选，通过GUS化学染色或PCR检测筛选得到转基因植株，其步骤如下所示：

1）预培养：将消毒后梅花成熟子叶接种到成熟子叶再生培养基中，置于24±2℃，光照强度为20001x光下预培养0-5d；

2）菌株的制备：从-70℃冰箱中取出保存的包含有GUS报告基因和正义PmCBFb基因的农杆菌EHA105，用接种环在100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，然后将平板倒置于28℃温箱中黑暗培养直至单菌落产生；挑取单菌落接种于100mg/L卡那霉素LB液体培养基中，在28℃恒温摇床上200r/min振荡培养过夜；然后将对数生长期为OD₆₀₀=0.6-0.8的菌液从三角瓶中转入无菌的50ml离心管中，4000r/min离心10min，去上清液，将收集得到的农杆菌置于100μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基中，作为重悬液使用，在28℃恒温摇床上200r/min重悬培养2-4h后用于转化受体的侵染；

3）侵染：将步骤1）的梅花成熟子叶再生培养基中生长健壮、无污染的子叶转入步骤2）中制备好的农杆菌菌液侵染10-30min，期间每隔2-3分钟摇动一下；

4）共培养：将步骤3）中侵染过的梅花成熟子叶放在滤纸上除去菌液后接种到共培养培养基中，置于24±2℃，黑暗条件下培养1-5d；

5）选择培养：将步骤4）中共培养后的梅花成熟子叶转入选择培养基中，置于24±2℃光下培养，光照强度为20001x，每两周补充一次新鲜选择培养基直至不定芽分化；

6）成苗培养：将步骤5）中再生出的不定芽接种到成苗培养基培养，对获得的抗性芽进一步的筛选和促进生长，于光下培养，光照强度为20001x，每四周补充一次新鲜的成苗培养基，直到得到抗性苗；

7）生根培养：将步骤6）获得的抗性苗切成2-3厘米长的茎段转入生根培养基中进行生根培养，光下培养，光照强度为20001x，直到获得抗性植株；

8）将步骤7）中获得的转GUS报告基因的抗性苗进行GUS化学染色，验证获得转基因植株；或

提取步骤7）中获得的转正义PmCBFb基因植株的基因组DNA，进行PCR检测，验证获得转基因植株；

其中PmCBFb基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示；

上述培养基组分及配制：

成熟子叶再生培养基：1/2MS，6-苄基腺嘌呤1.0-2.0mg/L，α-萘乙酸0.2mg/L，噻二唑苯基脲0.2-0.4mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH6.0；

共培养培养基：1/2MS，6-苄基腺嘌呤1.0-2.0mg/L，α-萘乙酸0.2mg/L，噻二唑苯基脲0.2-0.4mg/L，乙酰丁香酮100μmol/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH6.0；

选择培养基：1/2MS，6-苄基腺嘌呤1.0-2.0mg/L，α-萘乙酸0.2mg/L，噻二唑苯基脲0.2-0.4mg/L，卡那霉素20mg/L，头孢霉素300mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH6.0；

成苗培养基：1/2MS，玉米素1.0mg/L，3-吲哚乙酸0.1mg/L，卡那霉素20mg/L，头孢霉素300mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH6.0；

生根培养基：1/2MS，α-萘乙酸0.5mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH6.0；

1/2MS液体培养基：1/2MS+100μmol/L AS+蔗糖30.0g/L，用蒸馏水定容至1L，pH5.5。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述的成熟子叶预培养时间为3d。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）所述的农杆菌的侵染时间为20min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）所述的农杆菌与转化受体的共培养时间为3d。

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