CN101717784B - 一种利用基因的协同作用培育抗黄萎病棉花的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用基因的协同作用培育抗黄萎病棉花的方法及其应用。利用转基因技术，分别将抗黄萎病的几丁酶基因Bbchit1和抗菌蛋白基因LjAMP2转入棉花，然后通过有性杂交将两个不同来源的抗病基因整合到同一植株，实现不同抗病基因在同一植株内同时组成型表达，利用两个基因的协同作用有效提高棉花对黄萎病的抗病能力。结果表明，利用该方法获得的转基因棉花人工气候室接种落叶型黄萎病菌后，病情指数为10-25，可较野生型对照降低75％以上。该方法简便易行，效果显著，能为棉花抗黄萎病育种，特别是抗落叶型黄萎病育种提供新的抗源，为棉花生产带来巨大的经济效益，具有很好的市场前景。

Description

一种利用基因的协同作用培育抗黄萎病棉花的方法及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。主要涉及利用不同来源基因间的协同作用，培育抗黄萎病转基因棉花的方法。

技术背景

作物病害是作物高产稳产的主要障碍之一，常常引起作物产品品质下降，甚至产生一些对人类具有毒副作物的代谢物质。全世界每年因病害造成的作物减产超过15％，直接经济损失达300～500亿美元(李润植等，2001；Osusky等，2000)。培育和推广应用抗病品种是作物病害综合防治最经济有效的措施。由于病原菌变异迅速，植物抗性资源有限以及常规育种方法耗时费力，培育的抗病品种远不能满足生产需要。利用现代生物技术分离、克隆和转化抗性基因，可有效克服常规育种的不足，且基因来源广泛、不受抗源亲缘关系限制，一次克隆可用于多次转化。此外，将某些抗病基因转入植物中，还可以提高植物获得性系统抗病能力和对病原菌的免疫能力。通过这种方法获得的转基因植物抗性不易丧失，抗性基因容易转育(Cornelissen等，1993)。因此，基因工程技术已成为植物抗病育种的重要途径。

几丁质酶是一种水解酶，广泛存在于植物和微生物，具有降解几丁质的作用。几丁质是植物病原真菌中绝大多数真菌细胞壁的主要成分，而在植物中还未发现几丁质酶的底物，因此，几丁质酶在防御植物病原真菌的侵害中具有重要作用。自1991年，Broglie等首次报道转几丁质酶基因植物能提高对真菌病害的抗性以来，几丁质酶基因便倍受关注。但是，至今还没有利用几丁酶基因获得可利用的抗病转基因材料的报道。

抗菌蛋白(AMP，antimicrobial protein)是一类由生物产生的具有抗菌活性的蛋白或多肽，广泛分布于动物、植物和微生物中，具有抗菌谱广、抗菌活性高和抗性持久等特点。抗菌肽的抗菌机制特别，多以在膜上形成孔道导致细胞内容物泄漏的方式摧毁病原菌，致使病原菌难以产生抗性。大量的研究表明，在植物中表达异源的抗菌蛋白基因能增强植物的抗病性(AlanAR，2004；Cary JW，2000；Maria Coca，2006)。在提高植物抗病性的策略应用上，运用最广泛的是利用来自植物的抗菌蛋白基因提高不同植物的抗性。目前，抗菌蛋白基因在提高植物抗病性方面的研究已涉及烟草、水稻、小麦、棉花、油菜、大豆、葡萄、梨、苹果、玫瑰、杨树、橄榄等多种植物。但是，在植物中组成型高量表达异源蛋白或多肽常常对植株生长不利，易引起植株生长发育异常或不育。表达偏低时，植株生长发育正常但是抗性提高不明显。因此，单纯组成型表达抗菌蛋白基因，也难以获得可利用的转基因抗病材料。

作为重要经济作物的棉花在我国国民经济中占有重要地位。但是棉花生产常年受到多种病害的威胁，特别是棉花黄萎病仍是棉花生产中最具毁灭性的病害之一。因黄萎病是土传维管束病害，难以利用化学药剂进行防治。目前我国棉花黄萎病的发病面积已占植棉总面积的50％以上，每年损失皮棉7.5-10万吨，直接经济损失16-20亿元，已成为当前实现棉花高产、稳产的主要障碍因素，但是至今生产上没有找到有效的防治措施。生产实践证明，种植抗病品种是唯一经济有效的防治手段。我国育种专家经过几十年的努力，利用常规育种手段，获得了一些对黄萎病具有一定抗病能力的地方品种，但是由于黄萎病菌变异快、小种多，具有明显的致病力分化，针对黄萎病菌这种特性的广谱抗性品种基本没有，因此就存在着在一个地区表现为抗病的品种，到另一个不同生理和地理条件下，可能出现抗病性丧失的问题。另一方面，由于陆地棉栽培种内缺乏高抗黄萎病的抗源，直接导致了我国棉花抗黄萎病育种进程缓慢，特别是抗落叶型黄萎病育种基本没有进展。此外，不同地域种子交流导致病原菌在地方上的种类越来越多，形成了复合种群。不同地域黄萎病菌致病力的分化和提高，强致病力菌系的出现是造成棉花黄萎病逐年加重的主要原因之一。为此，解决生产中抗黄萎病资源缺乏的问题和寻找新的抗病育种方法已迫在眉睫，急需获得具有广谱和持久抗性的抗源以减轻棉花生产中黄萎病造成的巨大损失。

利用基因工程改良棉花的抗病性也已逐渐成为棉花病害防治的一条重要途径。但是将单个几丁酶基因或抗菌蛋白基因转入棉花还没有获得满足棉花生产要求的抗病材料。利用基因间的协同作用提高棉花对黄萎病的抗性已有报道。但是，这方面的研究主要集中在几丁质酶基因和葡聚糖酶基因间的协同作用(吴家和和张献龙等，2004)，而未见几丁酶基因和抗菌蛋白基因间协同作用提高转基因棉花对黄萎病抗性的报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种简便易行，效果显著，能为棉花抗黄萎病育种，特别是抗落叶型黄萎病育种提供新的抗源，利用基因的协同作用培育抗黄萎病棉花的方法及其应用。

本发明的目的是这样实现的：一种利用基因的协同作用培育抗黄萎病棉花的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获得球孢白僵菌几丁酶基因Bbchit1和益母草抗菌蛋白基因LjAMP2，并分别构建Bbchit1和LjAMP2基因组成型表达的植物表达载体；

(2)利用根癌农杆菌介导法将Bbchit1和LjAMP2基因组成型表达的植物表达载体分别转入棉花，实现Bbchit1和LjAMP2基因在棉花内的组成型表达；

(3)将步骤(2)获得的转基因棉花进行抗病鉴定和选育，筛选黄萎病病情指数60-80，植株生长发育正常的纯合株系；

(4)分别以步骤(3)获得的球孢白僵菌几丁酶基因Bbchit1和益母草抗菌蛋白基因LjAMP2转基因棉花纯合株系为父本和母本进行有性杂交，获得杂交F₁代，实现球孢白僵菌几丁酶基因Bbchit1和益母草抗菌蛋白基因LjAMP2在同一植株内同时进行组成型表达，利用二者的协同作用提高棉花对黄萎病的抗病能力。

进一步，所述步骤(3)的纯合株系为步骤(2)获得的转基因棉花经过抗病鉴定和选育，筛选生长发育正常的纯合株系，是指以转基因棉花后代中不再出现GUS基因的分离为标准确定纯合株系，以病情指数为60-80为标准确定抗病性的提高程度进行鉴定。

进一步，所述的抗病鉴定是指于人工气候室内进行的抗病鉴定，主要是对转基因棉花3-4片真叶幼苗进行伤根后浇灌病原菌孢子液的方法。

更进一步，所述利用基因的协同作用培育抗黄萎病棉花方法的应用，适用于培育不同抗真菌病害的植物。所述的植物是指通过有性生殖方式进行繁殖的单子叶和双子叶植物。

所述的几丁酶基因Bbchit1和抗菌蛋白基因LjAMP2分别来自球孢白僵菌和益母草，其植物表达载体的构建方法为基因工程领域的常规方法，使用的载体是植物转基因领域所使用的常规载体；

所述将基因的植物表达载体整合入棉花基因组的方法为常用植物转基因方法：根癌农杆菌介导法；

本发明中所指的“对黄萎病的抗性”主要是指对落叶型黄萎病的抗性。

本发明中所指的“转基因棉花”是指通过分子生物学、生物技术手段，将其他生物的基因转移到棉花中，进而获得对黄萎病抗性提高的棉花新材料。用于改造的基因分别来自于杀虫真菌球孢白僵菌和中草药益母草。

本发明在获得球孢白僵菌几丁酶基因Bbchit1和益母草抗菌蛋白基因LjAMP2组成型表达载体的基础上，利用根癌农杆菌介导法将Bbchit1和LjAMP2基因组成型表达的植物表达载体分别转入棉花，实现Bbchit1和LjAMP2基因在棉花内的组成型表达；分别获得超量表达Bbchit1和LjAMP2的转基因棉花，并筛选获得对黄萎病病情指数为60-80生长正常的纯合转基因棉花株系；然后利用有性杂交技术获得同一植株内同时组成型表达Bbchit1和LjAMP2的杂交F₁代，并于人工气候室内对F₁代及其亲本接种落叶型黄萎病菌，验证Bbchit1和LjAMP2协同抗黄萎病效果。

研究结果表明，杂交F₁代的病情指数可较亲本降低60％以上，较野生型对照降低75％以上。由此说明，利用Bbchit1和LjAMP2基因间的协同作用可有效提高棉花对落叶型黄萎病的抗病能力，可获得落叶型黄萎病病情指数在10-25的抗黄萎病转基因棉花材料。

本发明通过有性杂交，实现了球孢白僵菌几丁酶基因Bbchit1和益母草抗菌蛋白基因LjAMP2在同一植株内同时组成型表达，利用两个基因的协同作用有效提高了棉花对落叶型黄萎病的抗性。本发明首次利用几丁酶基因和抗菌蛋白基因间的协同作用提高棉花对落叶型黄萎病的抗性。本发明利用几丁酶基因和抗菌蛋白基因的协同作用，有效解决了上述单纯组成型表达几丁酶基因和抗菌蛋白基因提高植物抗病性的不足。可获得既能有效提高抗病性，又不影响植株生长发育的转基因材料。

本发明提供的方法简便易行，效果显著，能为棉花抗黄萎病育种，特别是抗落叶型黄萎病育种提供新的抗源，为棉花生产带来巨大的经济效益，具有很好的市场前景。

本发明提供的利用基因的协同作用培育抗黄萎病棉花的方法，还可用于其它以有性生殖方式进行繁殖的植物，培育对不同真菌病害具有抗性的抗病材料。因此，本发明具有重要的利用价值。

附图说明

图1为35S-Bbchit1植物表达载体构建流程图

图2为35S-LjAMP2植物表达载体构建流程图

图3为pBI121植物表达载体改造为P5载体的流程图

图4为Bbchit1转基因棉花中Bbchit1基因的RT-PCR检测结果

1-13：GUS阳性Bbchit1转基因植株；14：野生型植株对照；Bbchit1：以Bbchit1转基因植株和野生型植株cDNA为模板扩增Bbchit1基因的结果；HIS3：以Bbchit1转基因植株和野生型植株cDNA为模板扩增HIS3基因的结果；RNA as template：以Bbchit1转基因植株和野生型植株RNA为模板扩增HIS3基因的结果。Bbchit1基因扩增30个循环，HIS3基因扩增20个循环。

图5为LjAMP2转基因棉花中LjAMP2基因的RT-PCR检测结果

1-12：GUS阳性LjAMP2转基因植株；13：野生型植株对照；LjAMP2：以LjAMP2转基因植株和野生型植株cDNA为模板扩增LjAMP2基因的结果；HIS3：以LjAMP2转基因植株和野生型植株cDNA为模板扩增HIS3基因的结果；RNA as template：以LjAMP2转基因植株和野生型植株RNA为模板扩增HIS3基因的结果。LjAMP2基因扩增30个循环，HIS3基因扩增20个循环。

图6为以Bbchit1转基因棉花DNA为模板扩增LjAMP2和Bbchit1基因的结果

1：Bbchit1引物的水对照；2-6：以Bbchit11转基因棉花DNA为模板扩增Bbchit1基因的结果；7：Bbchit1质粒阳性对照；8：LjAMP2质粒阳性对照；9-13：以Bbchit1转基因棉花DNA为模板扩增LjAMP2基因的结果；14：LjAMP2引物的水对照；M：Marker 2000。

图7为以LjAMP2转基因棉花DNA为模板扩增LjAMP2和Bbchit1基因的结果

1：LjAMP2引物的水对照；2-6：以LjAMP2转基因棉花DNA为模板扩增LjAMP2基因的结果；7：LjAMP2质粒阳性对照；8：Bbchit1质粒阳性对照；9-13：以LjAMP2转基因棉花DNA为模板扩增Bbchit1基因的结果；14：Bbchit1引物的水对照；M：Marker 2000。

图8为以Bbchit1和LjAMP2杂交F₁代植株DNA为模板扩增LjAMP2和Bbchit1基因的结果

1：Bbchit1引物的水对照；2-6：以F₁植株DNA为模板扩增Bbchit1基因的结果；7：Bbchit1质粒阳性对照；8：LjAMP2质粒阳性对照；9-13：以F₁植株DNA为模板扩增LjAMP2基因的结果；14：LjAMP2引物的水对照；M：Marker 2000。

图9为Bbchit1和LjAMP2基因在杂交F₁代植株中的RT-PCR检测结果

Bbchit1：以F₁植株cDNA为模板扩增Bbchit1基因的结果；LjAMP2：以F₁植株cDNA为模板扩增LjAMP2基因的结果；HIS3：以F₁植株cDNA为模板扩增HIS3基因的结果；RNA as template：以F₁植株的RNA为模板扩增HIS3基因的结果。Bbchit1和LjAMP2基因分别扩增30个循环，HIS3基因扩增20个循环。

图10为接种落叶型黄萎病菌15d，转基因棉花及其杂交后代植株的病情指数

WT：野生型棉花；Bbchit1：Bbchit1转基因棉花；Bbchit1×LjAMP2和LjAMP2×Bbchit1：Bbchit1和LjAMP2转基因棉花正反交杂交F₁代；LjAMP2：LjAMP2转基因棉花。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

本发明实施实例中的药品试剂未进行具体说明的均为国产常规化学试剂，材料方法未进行具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。

实施实例1DNA的提取

1、球孢白僵菌基因组DNA的提取方法

1.5ml离心管收集菌液，10000rpm离心5min，弃上清液，加入真菌DNA提取液(Tris-HCl(pH 7.5)0.2mol/L，NaCl 0.5mol/L，EDTA 0.01mol/L，SDS 1％(w/v))500μl，于涡旋器充分混匀，65℃水浴30min后加入等体积的酚(pH8.0)∶氯仿，然后10000rpm离心10min，取上清液，加入等体积氯仿抽提1-2次，取上清液，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min。10000rpm离心5min，弃上清液，75％乙醇洗涤沉淀2次，然后风干。沉淀双蒸水溶解后加入适量RNase A，37℃静置3h，10000rpm离心5min，取其上清液即为基因组DNA溶液。

2、质粒DNA的提取

根癌农杆菌质粒DNA的提取按卢圣栋方法(1993)略作修改。

取根癌农杆菌菌液1mL，10000r/min离心1min收集菌体；用200μL STE(0.1mol/LNaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH 8.0))重悬菌体后，离心(10000r/min，1min)收集菌体；加入180μL溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0))和20μL溶菌酶重悬菌体，37℃温浴30min，加入400μL溶液II(0.2mol/L NaOH，1％(w/v)SDS)，上下颠倒多次，冰浴不超过3min；再加入300μL冰预冷的溶液III(50mL 5mol/L乙酸钾，11.5mL冰醋酸，28.5mL水)，上下颠倒多次，冰浴3min。12000r/min、4℃离心10min，将上清液转入另一离心管中；等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)先后各抽提一次；再将上清液转入另一离心管，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温静置2min；12000r/min、4℃离心10min收集沉淀DNA，然后用75％的乙醇洗涤沉淀一次；室温干燥，50μL双蒸水溶解沉淀即得到质粒DNA。

3、棉花基因组DNA的提取方法

采用改良的CTAB法(Doyle，1987；肖月华等，2002a)提取棉花组织DNA，方法为：

棉花植株幼嫩组织0.5-1g，在液氮中迅速研成粉末，加入3mL 65℃预热的CTAB提取液(100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol/L EDTA(pH8.0)，1.5mol/L NaCl，2％CTAB(w/v)，4％PVP40(w/v)和2％巯基乙醇(v/v)，PVP和巯基乙醇使用前加入)，快速振荡混匀，65℃水浴30min，加入1mL 5mol/L KAc冰浴20min。用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次，10,000rpm，4℃离心5min，上清液加入2/3倍体积-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃静置30min，用玻棒挑出絮状沉淀，并用75％的乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗一次，风干后重悬于500μL TE溶液。加入10mg/mL的RNaseA 2μL，37℃处理1h，然后用酚(pH8.0)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次，10,000rpm，4℃离心5min，上清液加入2倍体积的乙醇进行沉淀，离心弃上清液。沉淀用75％的乙醇漂洗，风干，溶于200μl双蒸水，-20℃保存备用。

实施实例2  益母草种子和棉花RNA的提取

用CTAB法提取益母草种子和棉花组织的总RNA。取约3g新鲜材料(益母草种子或棉花叶片)，在液氮中迅速研成粉末，装入DEPC水处理的50ml离心管，然后加入15ml 65℃预热的RNA提取液(2％CTAB(w/v)，2％聚乙烯吡咯烷酮PVP40(w/v)，100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，25mmol/L EDTA，0.5g/L亚精胺Spermidine，2.0mol/L NaCl，2％巯基乙醇)，颠倒混匀后65℃水浴3min，8,000rpm、4℃离心10min，将上清液转入一新的DEPC水处理的50ml离心管，用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提两次。10,000rpmm，室温离心5min后取上清液，加入1/4体积10mol/L LiCl溶液，4℃放置6h以上，10,000rpm，4℃离心10min，弃上清液，沉淀用500μL SSTE(1mol/LNaCl，0.5％SDS(w/v)，10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1.0mmol/L EDTA)溶解。再用等体积的酚(pH4.5)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次，10,000rpm，室温离心5min，上清液加入2倍体积-70℃预冷的无水乙醇，-70℃沉淀30min以上。12,000rpm，4℃离心10min，弃上清液，沉淀用200μL的DEPC处理水溶解，非变性凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA质量后，-80℃保存备用。

实施实例3  Bbchit1和LjAMP2基因植物表达载体的构建

1、Bbchit1基因的获得及植物表达载体的构建

以球孢白僵菌基因组总DNA为模板，以序列3和序列4为引物进行PCR扩增，回收扩增产物并与pUC-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆得到Bbchit1基因。Bbchit1基因全长见序列1。

以含有NPTII筛选标记基因和GUS报告基因的植物表达载体p5为基本骨架，将Bbchit1基因连接入载体的多克隆位点，构建组成型表达的植物表达载体，并命名为P5-35S-Bbchit1。P5-35S-Bbchit1植物表达载体构建流程图见图1。所有限制性内切酶均购自Roche公司，按照使用说明书操作完成。

2、LjAMP2基因的获得及植物表达载体的构建

以益母草种子为材料，提取RNA，然后用cDNA一链合成试剂盒(MBI公司产品)合成RNA的一链cDNA，操作均按试剂盒说明书进行。然后以合成的cDNA为模板，以序列5和序列6为引物进行PCR扩增，回收扩增产物并与pUC-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆得到LjAMP2基因。LjAMP2基因全长见序列2。

以含有NPTII筛选标记基因和GUS报告基因的植物表达载体p5为基本骨架，将LjAMP2基因分别连接入载体的多克隆位点，构建组成型表达的植物表达载体，并命名为P5-LjAMP2。P5-LjAMP2植物表达载体构建流程图见图2。所有限制性内切酶均购自Roche公司，按照使用说明书操作完成。

P5植物表达载体为改造常用的pBI121载体而得，改选的流程图见图3。

3、植物表达载体质粒转入根癌农杆菌LBA4404

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将构建的组成型表达几丁酶Bbchit1和LjAMP2基因的植物表达载体P5-35S-Bbchit1和P5-LjAMP2分别通过电击转化法导入根癌农杆菌LBA4404。

实施实例4棉花遗传转化

以无菌下胚轴为受体，利用根癌农杆菌介导法进行棉花的遗传转化，将P5-35S-Bbchit1和P5-LjAMP2植物表达载体分别整合入棉花基因组。

1、根癌农杆菌介导的棉花遗传转化常用培养基

基本培养基：MSB(MS无机盐+B5有机)(T.Murashige，1962；O.L.Gamborg，1968)；

种子萌发培养基：1/2MSB+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，自来水配制，自然pH；

共培养培养基：MSB+0.5mg/L IAA(吲哚乙酸)+0.1mg/L KT(6-糠氨基嘌呤)+30g/L葡萄糖+100μmol/L乙酰丁香酮+2.0g/L Gelrite(Sigma)，pH5.4；

筛选脱菌培养基：MSB+0.5mg/L IAA+0.1mg/L KT+75mg/L Km(卡那霉素)+500mg/Lcef(头孢霉素)+30g/L葡萄糖+2.0g/L Gelrite，pH5.8；

愈伤诱导培养基：MSB+0.5mg/L IAA+0.1mg/L KT+30g/L葡萄糖+2.0g/L Gelrite，pH5.8；

胚性愈伤诱导培养基：MSB+0.1mg/L KT+30g/L葡萄糖+2.0g/L Gelrite，pH5.8；

液体悬浮培养基：MSB+1.91g/L硝酸钾+0.1mg/L KT+30g/L葡萄糖，pH5.8；

体胚成熟培养基：MSB+15g/L蔗糖+15g/L葡萄糖+0.1mg/L KT+2.5g/L Gelrite，pH6.0；

成苗培养基：SH+0.4g/L活性碳+20g/L蔗糖，pH6.0。(Schenk&Hildebrandt，1972)

2、棉花遗传转化具体操作方法

(1)转化用农杆菌的培养

分别挑取含P5-35S-Bbchit1和P5-LjAMP2植物表达载体的农杆菌LBA4404单菌落，接种入5ml附加50mg/L卡那霉素(Km)和125mg/L链霉素(Sm)的YEB(蛋白胨5g/L，酵母膏1g/L，5g/L蔗糖)液体培养基，28℃，180rpm振荡培养至OD₆₀₀约为1.0，取100μL菌液接种入100mL不附加抗生素的YEB液体培养基，28℃、180rpm振荡培养过夜，至培养液OD₆₀₀约为1.0，菌液室温8000rpm离心5min，无菌条件下弃上清液，以原菌液体积并附加100μmol/L乙酰丁香酮(AS)的无菌MSB液体培养基(共培养培养基不附加Gelrite固化剂)重悬菌体，备用。

(2)转化外植体的获得

陆地棉栽培种冀棉14号种子去壳，籽仁0.1％升汞灭菌10min，无菌水漂洗5-6次后，接种于种子萌发培养基，28℃暗培养5-7d。无菌下胚轴切成3-5mm长的切段，作为转化外植体。

(3)下胚轴的遗传转化和胚性愈伤的诱导

农杆菌浸染液浸染3-5mm下胚轴切段20min，倾去菌液，再用无菌滤纸吸去外植体表面多余的菌液，浸染后的下胚轴切段接种于共培养培养基，26℃暗培养2d，将下胚轴接种至筛选脱菌培养基，20d后继代入附加卡那霉素(Km)和头孢霉素(cef)的愈伤诱导培养基进行愈伤的诱导，间隔20d继代一次，60d后继代入胚性愈伤诱导培养基，获得胚性愈伤后进行液体悬浮培养，以获得大量生长一致的胚性愈伤。

(4)体胚的诱导和成苗培养

液体悬浮培养的胚性愈伤，30目不锈钢筛网过滤，筛下的胚性愈伤均匀分散地接种入体胚成熟培养基，约15d大量的体胚产生后，将体胚继代入SH培养基，促进体胚成苗。3-4片真叶的再生体胚苗移栽入温室，然后于温室内生长繁殖。

实施实例5转基因棉花的分子生物学鉴定

1、转基因植株的GUS组织化学检测

参照Jefferson(1987)的方法，切取少许再生转基因植株幼嫩的根和叶片组织放入扩增管内，加入少许GUS组织化学染色液(500mg/L X-Gluc，0.1mol/L K₃Fe(CN)₆，0.1mol/LK₄Fe(CN)₆，1％Triton X-100(v/v)，0.01mol/L Na₂EDTA，0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0))，37℃暗处理1h，再用75％乙醇脱色，脱色后的根和叶片组织体视镜下观察组织着色情况。以野生型植株材料为对照。组织染成蓝色为阳性转基因植株，否则为阴性非转基因植株。

2、Bbchit1转基因棉花植株内Bbchit1基因转录表达的RT-PCR检测

以Bbchit1转基因棉花幼嫩叶片为材料，提取植株RNA，然后用cDNA一链合成试剂盒(MBI公司产品)合成各样品RNA的一链cDNA，操作均按试剂盒说明书进行。利用一链产物cDNA为模板进行PCR扩增，25μL PCR扩增体系包括：cDNA一链产物1μL，10×PCR缓冲液(无Mg²⁺)2.5μL，5.0mmol/LdNTP 1μL、序列7和序列8引物(5.0μmol/L)各1μL，Taq DNA聚合酶1.0U，25mmol/L MgCl₂ 2μL，加入ddH₂O(双蒸水)至25μL。用棉花组蛋白HIS3基因作内标，以检测RNA质量的一致性。HIS3的引物为序列11和序列12(ZhuYQ等，2003)。线性扩增程序：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃延伸10min。结果显示，Bbchit1基因在GUS阳性Bbchit1转基因植株内都能有效转录表达，部分RT-PCR检测结果见图4。

3、LjAMP2转基因棉花植株内LjAMP2基因转录表达的RT-PCR检测

以LjAMP2转基因棉花幼嫩叶片为材料，提取植株RNA，然后用cDNA一链合成试剂盒(MBI公司产品)合成各样品RNA的一链cDNA，操作均按试剂盒说明书进行。以一链产物cDNA为模板进行PCR扩增，25μL PCR扩增体系包括：cDNA一链产物1μL，10×PCR缓冲液(无Mg²⁺)2.5μL，5.0mmol/L dNTP 1μL、序列9和序列10引物(5.0μmol/L)各1μL，Taq DNA聚合酶1.0U，25mmol/L MgCl₂ 2μL，加入ddH₂O(双蒸水)至25μL。用棉花组蛋白HIS3基因作内标，以检测RNA质量的一致性。HIS3的引物为序列11和序列12(ZhuYQ等，2003)。线性扩增程序：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃延伸10min。结果显示，LjAMP2基因在GUS阳性LjAMP2转基因植株内都能有效转录表达，部分RT-PCR检测结果见图5。

实施实例6转基因棉花纯合株系的确定

以T2和T3代转基因植株幼嫩叶片为材料，参照Jefferson(1987)的方法，切取少许转基因植株幼嫩的叶片组织放入扩增管内，加入少许GUS组织化学染色液(500mg/LX-Gluc，0.1mol/L K₃Fe(CN)₆，0.1mol/L K₄Fe(CN)₆，1％Triton X-100(v/v)，0.01mol/LNa₂EDTA，0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0))，37℃暗处理1h，再用75％乙醇脱色，脱色后的叶片组织体视镜下观察组织着色情况。T₂和T₃代植株叶片GUS染色均为阳性的株系植株为纯合株系。

实施实例7同时整合Bbchit1和LjAMP2基因转基因棉花的获得

分别选取病情指数为60-80的Bbchit1和LjAMP2转基因棉花纯合T₃代植株为亲本，盛花期头日下午人工去雄，Bbchit1转基因棉花次日授LjAMP2转基因棉花植株的花粉，LjAMP2转基因棉花次日授Bbchit1转基因棉花植株的花粉。分别获得Bbchit1和LjAMP2转基因棉花的正反交杂交后代，该杂交后代即为同时整合Bbchit1和LjAMP2基因的转基因棉花。杂交后代分别标注为Bbchit1×LjAMP2和LjAMP2×Bbchit1。

实施实例8同时整合Bbchit1和LjAMP2转基因棉花的分子验证

1、Bbchit1和LjAMP2转基因棉花杂交F₁植株中外源基因的PCR检测

为了检测Bbchit1和LjAMP2转基因棉花杂交F₁代植株中是否同时整合了Bbchit1和LjAMP2基因，以Bbchit1和LjAMP2转基因棉花及其杂交F₁代植株的总DNA为模板，以序列9和序列10为引物扩增LjAMP2片段，序列7和序列8为引物扩增Bbchit1基因片段，以双亲亲本材料的DNA为模板同时扩增Bbchit1和LjAMP2基因片段为对照。PCR扩增结果表明，以Bbchit1转基因棉花DNA为模板只扩增出了与Bbchit1质粒相同的特异片段，没有扩增出LjAMP2质粒相同的特异片段(图6)。以LjAMP2转基因棉花DNA为模板只扩增出了与LjAMP2质粒相同的特异片段，没有扩增出Bbchit1质粒相同的特异片段(图7)。而以Bbchit1和LjAMP2转基因棉花杂交F₁代植株DNA为模板同时扩增出了与Bbchit1和LjAMP2质粒相同的特异片段(图8)。说明，以Bbchit1和LjAMP2转基因棉花为亲本获得的杂交F₁代植株中，同时整合了Bbchit1和LjAMP2基因。

2、Bbchit1和LjAMP2基因在杂交F₁中的RT-PCR检测

为了检测Bbchit1和LjAMP2基因在其转基因棉花杂交F₁代植株中的转录表达情况，提取植株叶片的RNA，反转录合成cDNA一链，利用Bbchit1和LjAMP2的引物扩增Bbchit1和LjAMP2基因，部分扩增结果见图9。以F₁代植株的cDNA为模板扩增Bbchit1和LjAMP2基因，都能获得约为840bp和201bp的目标特异片段。以RNA为模板扩增棉花HIS3基因的对照中没有扩增出任何特异条带，说明RNA中没有棉花基因组DNA的污染，以cDNA为模板扩增获得的目标片段是目标基因表达的结果。因此，Bbchit1和LjAMP2基因在其转基因植株杂交F₁代中都能独立地进行转录表达。

实施实例9转基因棉花对落叶型黄萎病的抗病鉴定方法

1、抗病鉴定接种用病原菌的制备

挑取少许固体PDA保存的落叶型黄萎病菌接种入液体PD培养基，180rpm，25℃振荡培养7d，再按10％(菌液/PD培养基)的比例接种入液体PD培养基，180rpm，25℃振荡培养10d，用四层无菌纱布过滤去除菌液中的菌丝及杂质，去离子水调整孢子浓度达到10⁸个/ml的菌液作为接种菌液。

2、人工气候室内抗病鉴定致病菌接种方法

生长相对一致3-4片真叶Bbchit1、LjAMP2纯合亲本以及同时整合两个基因的转基因棉花幼苗，采用伤根灌菌液法接种落叶型黄萎病致病菌。移栽入盆钵时每株慢慢浇灌落叶型黄萎病菌菌液100mL，尽量让菌液湿润有棉花植株的土壤团，接种两天后浇透水，以保持盆钵内土壤的湿度。接种后于20℃(夜)-25℃(昼)，湿度80％以上，14h光照/10h暗培养的光周期条件下生长，接种15d按5级病级标准(0级：棉花植株外表无病症；1级：棉株叶片1/3以下显病症；2级：棉株叶片1/3-2/3显病症；3级：棉株叶片2/3以上显病症；4级：棉株叶片全部出现病症，叶片脱落严重或植株光杆甚至死亡)统计植株病级，并计算植株的病情指数。以相同生长时期的野生型棉花幼苗为对照，落叶型黄萎病菌接种浓度为10⁸个孢子/ml。

病情指数＝[∑(病级数*株数)/(4*总株数)]*100

实施实例10同时整合Bbchit1和LjAMP2转基因棉花对落叶型黄萎病的抗性

按实施实例9的接种方法，转基因棉花材料于人工气候室内接种落叶型黄萎病致病菌，接种15d，Bbchit1、LjAMP2转基因棉花纯合亲本以及同时整合两个基因转基因棉花幼苗植株的病情指数见图10。结果显示，野生型植株(WT)的病情指数达到了100，LjAMP2和Bbchit1转基因棉花植株的病情指数分别为77.26和61.26，与野生型对照相比，差异不显著(P＞0.05)。相同条件下，Bbchit1和LjAMP2转基因棉花正反交杂交F₁代植株的病情指数分别为16.61和23.71，与野生型对照、Bbchit1和LjAMP2转基因棉花亲本相比，差异都极显著(P＜0.01)。接种病原菌后植株的病情指数表明，在转基因棉花内同时整合并有效表达Bbchit1和LjAMP2基因，利用二者的协同作用可有效提高棉花对落叶型黄萎病的抗性。抗病植株移栽入温室盆钵，进一步进行繁殖，结果显示，植株生长发育正常，能正常开花结实，对黄萎病的抗性稳定。

上述实施实例表明，本发明通过有性杂交，实现了球孢白僵菌几丁酶基因Bbchit1和益母草抗菌蛋白基因LjAMP2在同一植株内同时组成型表达，利用两个基因的协同作用能有效提高棉花对落叶型黄萎病的抗性。本发明方法简便易行，效果显著，获得的抗黄萎病转基因棉花可为棉花抗黄萎病育种，特别抗落叶型黄萎病育种提供新资源，具有很好的市场前景。

以上实施例仅对本发明详细描述但并不限制本发明，本领域的技术人员可以根据本发明做出各种变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求所定义的范围。

                            序列表

序列1  Bbchit1基因核苷酸序列，长1047bp

   1 ATGGCTCCTT TTCTTCAAAC CAGCCTCGCG CTCCTTCCAT TGTTGGCTTC CACCATGGTC

  61 AGCGCCTCGC CCTTGGCGCC GCGAGCCGGC ACCTGCGCCA CCAAAGGCCG GCCGGCCGGC

 121 AAAGTGCTCC AGGGCTACTG GGAGAACTGG GACGGTGCCA AGAACGGGGT GCACCCTCCG

 181 TTTGGCTGGA CGCCCATCCA AAACCCCGAC ATTCGCAAGC ACGGCTACAA CGTCATCAAT

 241 GCTGCCTTTC CCATCATCCA GCCTGACGGC ACCGCGCTCT GGGAGGACGG CATGGACACG

 301 GGCGTCAAGG TGGCGAGCCC GGCCGACATG TGCGAGGCCA AGGCAGCAGG TGCCACCATC

 361 TTGATGTCGA TTGGCGGTGC TACTGCGGCC ATTGACCTGA GCTCGTCGGC TGTGGCTGAC

 421 AAGTTTGTCT CGACCATTGT GCCGATTCTG AAAAAGTACA ACTTTGACGG CATTGATATC

 481 GACATTGAAT CCGGCCTCAC AGGCAGCGGA AACATAAACA CCCTGTCCAC CTCGCAGACC

 541 AACCTGATTA GAATCATTGA CGGCGTTCTC GCGCAGATGC CCGCCAACTT TGGCTTGACC

 601 ATGGCGCCAG AGACTGCCTA CGTTACCGGT GGGACTATTA CGTACGGATC AATCTGGGGC

 661 TCTTACCTCC CCATTATCAA AAAGTACCTG GACAATGGTC GTCTCTGGTG GCTCAACATG

 721 CAGTACTACA ATGGCGAAAT GTACGGCTGC TCCGGCGACT CGCACAAGGC CGGTACTGTC

 781 GAAGGATTCA TTGCTCAGAC CGACTGCCTG AACAAGGGAC TTAGTATTCA GGGCGTGACA

 841 ATCACGATTC CCTATGACAA GCAAGTGCCT GGCCTTCCTG CCCAGCCTGG GGCTGGCGGC

 901 GGCCACATGT CCCCGTCCAA CGTGGCGCAA GTTCTCTCCC ACTACAAGGG CGCTTTGAAG

 961 GGATTGATGA CTTGGTCTCT GAACTGGGAC GGCTCCAAGA ATTGGACATT TGGCGACAAT

1021 GTCAAGGGGA CTTTGGGGAC TGCGTAA

序列2 LjAMP2基因全长序列(288bp)

   1 ATGCTGCAGG GTCGCCAGTT CCGCTCCTGC CAAAGCTACC TTAGGCAGCG TGGGAATGTT

  61 CTAGAAATGG CCACCGGAAA CCCTCAGTCG CAGACGGTTG AAGAATGCTG CGAGAGTCTG

 121 AAGGATATTG AGCGGAAACA GCAGCAATGC GGGTGTGAAG CCATCAAGCA CGCGATGAGG

 181 CAGATGCAGG GGGGGCAGAG CGAGGAGGTG TATCGAAAGG CTAGGATGCT GCCACGTACT

 241 TGCGGATTAA GGTCACAGCA ATGCCAGTTT AATGTTATCT TTGTGTAG

序列3：基因组内Bbchit1基因扩增引物1

5’-CGG GGT ACC ATG GCT CCT TTT CTT CAA ACC AG-3’

序列4：基因组内Bbchit1基因扩增引物2

5’-CG GAA TTC TTA CGC AGT CCC CAA AGT CCC CT-3’

序列5：LjAMP2基因扩增引物1

5’-CG GGA TCC ATG CTG CAG GGT CGC CAG TTC-3’

序列6：LjAMP2基因扩增引物2

5’-CGA GCT CCT ACA CAA AGA TAA CAT TAA ACT GGC-3’

序列7：转基因植株内Bbchit1基因扩增引物1

5’-TGC ACAATG CTGATC GCG-3’

序列8：转基因植株内Bbchit1基因扩增引物2

5’-TGG CAA GCG TTT TCA GGC-3’

序列9：转基因棉花植株内LjAMP2基因扩增引物1

5’-CCA GTT CCG CTC CTG CCAAAG-3’

序列10：转基因棉花植株内LjAMP2基因扩增引物2

5’-CGA TAC ACC TCC TCG CTC T-3’

序列11：转基因植株内GhHIS3基因扩增引物1

5’-GAA GCC TCA TCG ATA CCG TC-3’

序列12：转基因植株内GhHIS3基因扩增引物2

5’-CTA CCA CTA CCA TCA TGG C-3

Claims (3)

1.一种利用基因的协同作用培育抗黄萎病棉花的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获得球孢白僵菌几丁酶基因Bbchit1和益母草抗菌蛋白基因LjAMP2，并分别构建Bbchit1和LjAMP2基因组成型表达的植物表达载体P5-35S-Bbchit1和P5-LjAMP2；其中，所述Bbchit1基因序列如序列1所示，所述LjAMP2基因序列如序列2所示，P5-35S-Bbchit1、P5-LjAMP2和P5的构建分别如图1、图2和图3所示；

(2)利用根癌农杆菌介导法将Bbchit1和LjAMP2基因组成型表达的植物表达载体P5-35S-Bbchit1和P5-LjAMP2分别转入棉花，实现Bbchit1和LjAMP2基因在棉花内的组成型表达；

(3)将步骤(2)获得的转基因棉花进行抗病鉴定和选育，筛选黄萎病病情指数60-80，植株生长发育正常的纯合株系；

(4)分别以步骤(3)获得的球孢白僵菌几丁酶基因Bbchit1和益母草抗菌蛋白基因LjAMP2转基因棉花纯合株系为父本和母本进行有性杂交，获得杂交F₁代，实现球孢白僵菌几丁酶基因Bbchit1和益母草抗菌蛋白基因LjAMP2在同一植株内同时进行组成型表达，利用二者的协同作用提高棉花对黄萎病的抗病能力。

2.根据权利要求1所述利用基因的协同作用培育抗黄萎病棉花的方法，其特征在于，所述步骤(3)的纯合株系是指以转基因棉花后代中不再出现GUS基因的分离为标准确定纯合株系，以病情指数为60-80为标准确定抗病性的提高程度进行鉴定。

3.根据权利要求2所述利用基因的协同作用培育抗黄萎病棉花的方法，其特征在于，所述的抗病鉴定是指于人工气候室内进行的抗病鉴定，主要是对转基因棉花3-4片真叶幼苗进行伤根后浇灌病原菌孢子液的方法。

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