CN101812476B - 一种利用球孢白僵菌几丁酶基因提高植物抗病性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用球孢白僵菌几丁酶基因提高植物抗病性的方法。该方法首先构建几丁酶基因组成型表达的植物表达载体，然后利用根癌农杆菌介导法将该基因导入番茄或棉花，实现其在番茄或棉花内的组成型表达，从而提高番茄和棉花的抗病性。应用本发明方法获得的转基因番茄可明显提高对早疫病的抗性；转基因棉花温室内接种非落叶型黄萎病菌后，病情指数可小于20，较野生型对照低80％左右。

Description

一种利用球孢白僵菌几丁酶基因提高植物抗病性的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体地说，涉及利用非植物来源的几丁酶基因提高植物对病害的抗性，特别是提高棉花对黄萎病的抗性。

技术背景

自从人类开始栽培作物以来，由病原菌引起的作物病害一直是限制农业生产的主要因素之一。病害每年可造成全世界作物减产15％以上，直接经济损失达300～500亿美元(李润植等，2001；Osusky等，2000)。此外，病害还引起作物产品品质下降，病原菌产生的毒素严重危害人体健康。在作物病害综合防治策略中，培育和推广应用抗病品种是最经济有效的措施。由于病原菌变异迅速，植物抗性资源有限以及常规育种方法耗时费力，所培育的抗病品种远不能满足生产需要。利用现代生物技术分离、克隆和转化抗性基因，不仅定向性强、基因型来源丰富，而且不受抗源亲缘关系限制、育种周期短、理论上也不存在性状的负相关连锁，可对单一性状进行根本改良。此外，将某些抗病基因转入植物中，不仅可以提高植物对病原真菌致病因子的解毒能力，而且可以提高植物获得性系统抗性能力。通过这种方法获得的抗病植物，具有抗性不易丧失、抗性基因来源广容易转育等优点(Cornelissen等，1993)。因此，基因工程技术已成为植物抗病育种的重要途径。

几丁质酶是一种水解酶，广泛存在于植物和微生物中，具有降解几丁质的作用。几丁质是植物病原真菌中绝大多数真菌细胞壁的主要成分，而植物中还未发现几丁质酶的作用底物。此外，真菌细胞壁的降解产物还可进一步诱导植物的防御反应(Grison et al.，1996；Velazhahan et al.，2000；Lorito et al.，1998)。因此，几丁质酶基因一直受到人们关注。

作为重要经济作物的棉花是世界上最重要的天然纤维作物。在中国，棉花历来是关系国计民生的重要物资，我国棉花产业涉及约2亿农村人口的收入，关系到1900万纺织工人就业和1000多亿美元的出口创汇，对纺织工业乃至整个国民经济发展都具有举足轻重的作用。但是，棉花黄萎病自1935年传入我国后，对我国棉花生产的危害逐年加重，重病年份损失皮棉超过40万吨，直接经济损失达60多亿元(陈捷胤等，2005)。黄萎病为害严重的棉田，可减产70％以上，同时还严重降低纤维品质。棉花黄萎病这一世界性的重大病害，严重阻碍着我国棉花生产的发展。棉花黄萎病(cotton Verticillium wilt)属土传维管束病害，其特点是分布广、危害重、寄主范围广、传播途径多、存活时间久，是棉花生产中最具毁灭性的病害之一。在我国，生产上一直没有找到理想的防治技术与控制方法，因此被称之为棉花的“癌症”(陈捷胤等，2005)。选育和推广抗黄萎病品种，是我国也是世界各产棉国防治黄萎病最经济有效，而且是唯一有效的途径(顾本康等，1996)。

我国育种专家经过几十年的努力，利用常规育种手段，获得了一些对黄萎病具有一定抗病能力的地方品种。但是，黄萎病菌变异快、小种多，具有明显的致病力分化，针对黄萎病菌这种特性的广谱抗性棉花品种基本没有，因此，在一个地区表现为抗病的棉种到另一个不同生理和地理条件下抗病性就会丧失。另一方面，由于陆地棉栽培种内缺乏高抗黄萎病的抗源，直接导致了我国棉花抗黄萎病育种进程缓慢，特别是抗落叶型黄萎病育种基本没有进展(马存等，2002)。此外，不同地域种子交流导致病原菌在地方上的种类越来越多，形成了复合种群。各地的棉花黄萎病菌均存在致病力的分化和提高，强致病力菌系的出现是造成棉花黄萎病逐年加重的主要原因之一(房卫平等，2001)。为此，解决生产中抗黄萎病资源缺乏的问题已迫在眉睫，急需获得具有广谱和持久抗性的抗源以减轻棉花生产中因黄萎病造成的巨大损失。利用几丁酶基因提高棉花对黄萎病的抗性，我国的乐锦华(2002)和程红梅(2005)等已取得了一些进展。但他们所用的几丁酶基因都来自植物。由于进化的原因，来自植物的基因转入植物后，病原菌对转基因表达产物容易产生耐性。因此，利用几丁酶基因提高棉花对黄萎病的抗性还有待进一步的进行研究和寻找新的基因，特别是寻找和研究非植物来源的几丁酶基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种成本低、效果好的利用球孢白僵菌几丁酶基因提高植物抗病性的方法。

本发明的目的是这样实现的：一种利用球孢白僵菌几丁酶基因提高植物抗病性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)获得球孢白僵菌几丁酶基因Bbchit1：设计引物引入酶切位点后，以球孢白僵菌基因组DNA为模板进行扩增，扩增产物与pUC-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆获得Bbchit1基因；

2)构建组成型表达几丁酶基因植物表达载体：将Bbchit1基因插入植物表达载体P5，构建一个新的植物表达载体，命名为p5-35S-Bbchit1，组成型表达启动子为花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子；

3)利用根癌农杆菌介导法，将所述CaMV35S启动子控制下的球孢白僵菌几丁酶基因Bbchit1整合入植物基因组，实现Bbchit1基因在植物内的组成型表达，提高植物对真菌病害的抗病能力；

4)将步骤3)获得的转基因植物进一步进行培养栽培、分子鉴定、人工气候室和温室内的抗病鉴定，获得抗病性提高的转基因植株。

进一步，组成型表达的p5-35S-Bbchit1植物表达载体构建的步骤包括：从球孢白僵菌中提取基因组总DNA后，设计上游引物：5’-CGG GGT ACC ATG GCT CCT TTT CTT CAAACC A-3’，下游引物：5’-CG GAA TTC TTA CGC AGT CCC CAA AGT CCC CTT-3’进行PCR扩增，扩增产物连接入pUC-T载体，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆得到Bbchit1基因；然后将该基因插入植物表达载体P5，构建一个新的植物表达体，命名为p5-35S-Bbchit1，以实现该基因在植物内的组成型表达。

所述植物主要是指番茄或棉花。

步骤2)所述构建组成型表达几丁酶基因植物表达载体的方法为本领域的常规方法，使用的载体为植物转基因领域所使用的常规载体，组成型表达启动子为花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子。

步骤3)所述根癌农杆菌介导法，其中将植物表达载体转入农杆菌的方法为电转化法，将植物表达载体整合入番茄和棉花基因组的方法为根癌农杆菌介导法。

步骤4)所述分子鉴定为分子生物学，生物技术领域常用的检测鉴定技术，如GUS组织化学染色、PCR以及RT-PCR等。

步骤4)所述的抗病鉴定指人工气候室内幼苗植株抗性鉴定，以及温室内进行的棉花幼苗和整个生育期对黄萎病的抗性鉴定。转基因棉花的鉴定方法为常规的抗黄萎病鉴定法，如灌菌液法，病圃鉴定等；转基因番茄为常规的离体叶片接种方法。

本发明所提供的培育抗病植物的方法，是将来自球孢白僵菌的几丁酶基因重组植物表达载体转入番茄或棉花细胞中，实现该基因在转基因植株内的组成型表达，提高植物对病害的抗病能力，特别是提高植物对真菌病害的抗病能力。含有该几丁酶基因的重组植物表达载体、重组菌和转基因细胞系都属于本发明的保护范围。

应用本发明方法获得的转基因番茄可明显提高对早疫病的抗性；转基因棉花温室内接种非落叶型黄萎病菌后，病情指数可小于20，较野生型对照低80％左右。

本发明利用基因工程领域的常规方法和常规载体，构建CaMV35S(35S)启动子控制Bbchit1基因的植物表达载体，再利用根癌农杆菌介导法，将Bbchit1基因整合入番茄和棉花基因组，获得抗病性提高的转基因再生植株。实验结果表明，组成型表达Bbchit1基因的番茄可明显提高对早疫病的抗性，离体叶片接种早疫病菌块10d，转基因株系的病情指数低于25，甚至为0，与野生型对照(100)相比可降低70％以上。转基因棉花纯合T₃代温室病池接种落叶型和非落叶型黄萎病菌30d，与对照相比，病情指数可分别降低60％和80％。说明，本发明提供的提高植物抗病性的方法效果显著。该方法不仅适用于棉花和番茄，还可用于其它植物抗病性的提高。因此，本发明具有重要的经济利用价值。

附图说明

图1为35S启动子控制几丁酶基因Bbchit1植物表达载体构建流程图

Amp：氨苄青霉素抗性基因；NPT：新霉素磷酸转移酶基因nptII；GUS：β-葡萄糖酸苷酶基因；35S：来源于花椰菜花叶病毒的植物组成型表达启动子；LB，T-DNA左边界；RB，T-DNA右边界。用于构建植物表达载体的骨架载体为p5，具有CaMV35S启动子调控下的GUS基因，便于在植物遗传转化过程中对转化子进行GUS组织化学染色，以筛选转化子。

图2为pBI121植物表达载体改造为P5载体的流程图

图3为转基因番茄中Bbchit1基因PCR扩增结果

M：Marker 2000；1：水对照；2：野生型植株对照；3：质粒DNA阳性对照；4-13：GUS阳性转基因番茄。黑色箭头示840bp的Bbchit1特异片段。

图4为离体叶片接种早疫病菌10d，Bbchit1转基因番茄的病情指数

CK：再生的野生型植株；Bb3、Bb5和Bb15：Bbchit1转基因株系。

图5为番茄离体叶片接种早疫病菌菌块10d的病症

Bb3和Bb15：Bbchit1转基因番茄不同株系叶片；CK：野生型番茄叶片。

图6为转基因棉花中几丁酶基因Bbchit1的PCR分析

M：Marker 2000；1：野生型植株对照；2：阳性质粒对照；3-12：GUS阳性植株；13：水对照；黑色箭头示Bbchit1基因840bp的目标特异带。

图7为转基因棉花中Bbchit1基因的RT-PCR分析

1：非纯合转基因株系中分离的GUS阴性非转基因植株；2-9：GUS阳性植株；Bb：以转基因和GUS阴性植株的cDNA为模板扩增Bbchit1基因的结果；HIS：以转基因和GUS阴性植株的cDNA为模板扩增HIS3基因的结果；RNAas template：以转基因和GUS阴性植株的RNA为模板扩增HIS3基因的结果。Bbchit1基因扩增30个循环，HIS3基因扩增20个循环。

图8为纯合T₂代株系人工气候室内接种落叶型黄萎病菌15d的病情指数

CK：未纯合株系分离的GUS阴性非转基因植株对照；Bb21和Bb23：纯合Bbchit1转基因棉花不同株系

图9为纯合T₂代株系人工气候室内接种落叶型黄萎病菌15d植株的表型

Bb21和Bb23：Bbchit1转基因棉花不同株系；GUS-：转基因株系分离的GUS阴性非转基因对照；WT：野生型植株对照。

图10为人工气候室内，纯合T₂代株系接种非落叶型黄萎病菌20d的病情指数

CK：未纯合株系分离的GUS阴性接种对照植株；Bb21和B23：Bbchit1转基因棉花纯合T₂代不同株系。

图11为纯合T₂代株系人工气候室内接种非落叶型黄萎病菌20d植株表型

Bb：Bbchit1转基因棉花植株；CK：GUS阴性非转基因植株接种对照。白色箭头示植株叶片或子叶的病症。

图12为纯合T₃代株系温室接种落叶型黄萎病菌30d的病情指数

CK：未纯合株系分离的GUS阴性植株对照；Bb21和Bb23：纯合T₃代不同株系。

图13为纯合T₃代株系温室接种落叶型黄萎病菌30d植株的表型

图14为纯合T₃代温室接种落叶型黄萎病菌植株生长后期茎杆内部组织的病情指数

CK：未纯合株系分离的GUS阴性植株对照；Bb21和Bb23：纯合T₃代不同株系。

图15为纯合T₃代温室接种落叶型黄萎病菌后，植株生长后期茎杆内部组织的病症

图16为温室内纯合T₃代株系接种非落叶型黄萎病菌30d的病情指数

CK：来自未纯合株系分离的GUS阴性非转基因植株接种对照；Bb21和Bb23：纯合T₃代不同株系。

图17为纯合T₃代株系温室接种非落叶型黄萎病菌30d植株的表型

图18为纯合T₃代株系接种非落叶型黄萎病菌后，植株生长后期茎内部组织的病情指数

CK：未纯合株系分离的非转基因植株接种对照；Bb21和Bb23：纯合转基因株系。

图19为温室内，纯合株系接种非落叶型黄萎病菌植株生长后期茎内部组织的病症

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

本发明实施实例中的药品试剂未进行具体说明的均为国产常规化学试剂，材料方法未进行具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。

实施例1：DNA的提取

1.1DNA提取缓冲液

(1)真菌DNA提取缓冲液

Tris-HCl(pH 7.5)0.2mol/L，NaCl 0.5mol/L，EDTA 0.01mol/L，SDS 1％(w/v)。

(2)植物DNA提取缓冲液

CTAB提取液：100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol/L EDTA(pH8.0)，1.5mol/LNaCl，2％CTAB(w/v)，4％PVP40(w/v)和2％巯基乙醇(v/v)，PVP和巯基乙醇使用前加入。

(3)碱裂解法质粒提取缓冲液

STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH 8.0)。

溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。

溶液II：0.2mol/L NaOH，1％(w/v)SDS。

溶液III：50mL 5mol/L乙酸钾，11.5mL冰醋酸，28.5mL水。

1.2球孢白僵菌基因组DNA的提取方法

1.5ml离心管收集菌液，10000rpm离心5min，弃上清液，加入真菌DNA提取液500μl，于涡旋器充分混匀，65℃水浴30min后加入等体积的酚(pH8.0)∶氯仿，然后10000rpm离心10min，取上清液，加入等体积氯仿抽提1-2次，取上清液，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min。10000rpm离心5min，弃上清液，75％乙醇洗涤沉淀2次，然后风干。沉淀双蒸水溶解后加入适量RNaseA(RNA酶A)，37℃静置3h，10000rpm离心5min，取其上清液即为基因组DNA溶液。

1.3质粒DNA的提取

根癌农杆菌质粒DNA的提取按卢圣栋方法(1993)略作修改。

取根癌农杆菌菌液1mL，10000r/min离心1min收集菌体；用200μL STE重悬菌体后，离心(10000r/min，1min)收集菌体；加入180μL溶液I和20μL溶菌酶重悬菌体，37℃温浴30min，加入400μL溶液II，上下颠倒多次，冰浴不超过3min；再加入300μL冰预冷的溶液III，上下颠倒多次，冰浴3min。12000r/min、4℃离心10min，将上清液转入另一离心管中；等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)先后各抽提一次；再将上清液转入另一离心管，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温静置2min；12000r/min、4℃离心10min收集沉淀DNA，然后用75％的乙醇洗涤沉淀一次；室温干燥，50μL TE溶解沉淀即得到质粒DNA。

1.4番茄和棉花基因组DNA的提取方法

采用改良的CTAB法(Doyle，1987；肖月华等，2002a)提取番茄和棉花组织DNA，方法为：

番茄和棉花等植物幼嫩组织0.5-1g，在液氮中迅速研成粉末，加入3mL 65℃预热的CTAB提取液，快速振荡混匀，65℃水浴30min，加入1mL 5mol/L KAc冰浴20min。用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次，10,000rpm，4℃离心5min，上清液加入2/3倍体积-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃静置30min，用玻棒挑出絮状沉淀，并用75％的乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗一次，风干后重悬于500μL TE溶液。加入10mg/mL的RNaseA 2μL，37℃处理1h，然后用酚(pH8.0)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次，10,000rpm，4℃离心5min，上清液加入2倍体积的无水乙醇进行沉淀，离心弃上清液。沉淀用75％的乙醇漂洗，风干，溶于200μl TE，-20℃保存备用。μL实施例2：棉花RNA的提取

2.1RNA提取缓冲液

CTAB提取缓冲液：2％CTAB(w/v)，2％聚乙烯吡咯烷酮PVP40(w/v)，100mmol/LTris-HCl(pH8.0，DEPC处理的水配制)，25mmol/L EDTA，0.5g/L亚精胺Spermidine，2.0mol/LNaCl，2％巯基乙醇(v/v，使用前加入)。

SSTE溶解液：1mol/L NaCl，0.5％SDS(w/v)，10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1.0mmol/LEDTA。

2.2RNA提取方法

用CTAB法提取棉花组织的总RNA。取约3g棉花组织新鲜材料，在液氮中迅速研成粉末，装入DEPC水处理的50ml离心管，然后加入15ml 65℃预热的RNA提取液，颠倒混匀后65℃水浴3min，8,000rpm、4℃离心10min，将上清液转入一新的DEPC水处理的50ml离心管，用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提两次。10,000rpmm，室温离心5min后取上清液，加入1/4体积10mol/L LiCl溶液，4℃放置6h以上，10,000rpm，4℃离心10min，弃上清液，沉淀用500μL SSTE溶解。再用等体积的酚(pH4.5)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次，10,000rpm，室温离心5min，上清液加入2倍体积-70℃预冷的无水乙醇，-70℃沉淀30min以上。12,000rpm，4℃离心10min，弃上清液，沉淀用200μL的DEPC处理水溶解，非变性凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA质量后，-80℃保存备用。

实施例3：Bbchit1植物表达载体的构建

3.1组成型表达Bbchit1基因植物表达载体的构建

以球孢白僵菌基因组总DNA为模板，以序列6和序列7为引物进行PCR扩增，回收扩增产物并与pUC-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆得到Bbchit1基因(序列1)。

以含有NPTII筛选标记基因和GUS报告基因的植物表达载体p5为基本骨架，将Bbchit1基因连接入载体的多克隆位点，构建组成型表达的植物表达载体，并命名为p5-35S-Bbchit1。p5-35S-Bbchit1植物表达载体构建流程图见图1。所有限制性内切酶均购自Roche公司，按照使用说明书操作完成。

P5植物表达载体为改选常用的pBI121载体而得，改选的流程图见图2。

3.2植物表达载体质粒转入根癌农杆菌LBA4404

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将构建的组成型表达几丁酶Bbchit1基因的植物表达载体P5-35S-Bbchit1通过电击转化法导入根癌农杆菌LBA4404。

实施例4：番茄的遗传转化

4.1番茄遗传转化用培养基

基本培养基：MSB0(MS无机+B5有机+30g/L蔗糖，pH5.8)。固体培养基加入6g/L的琼脂(Murashige和Skoog，1962；Gamborg等，1968)；

共培养培养基MSB1：MSB0+2.0mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)+0.2mg/L IAA(吲哚乙酸)+100uMAS(乙酰丁香酮)+6g/L琼脂，pH5.4；

筛选培养基MSB2：MSB1+500mg/L cb(羧苄青霉素)+100mg/L Km(卡那霉素)+6g/L琼脂，pH5.8；

继代培养基MSB3：MSB0+200mg/Lcb+100mg/L Km+6g/L琼脂，pH5.8；

生根培养基MSB4：MSB0+0.5mg/L IAA+200mg/L Cef+50mg/L Km+6g/L琼脂，pH6.0。

4.2番茄的遗传转化

(1)转化用农杆菌浸染液的制备

挑取含P5-35S-Bbchit1载体的根癌农杆菌单菌落，接种入附加50mg/L Km(卡那霉素)和125mg/L Sm(链霉素)10mL液体YEB(5g/L蔗糖，1g/L细菌用酵母抽提物，10g/L细菌用胰化蛋白胨，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，pH7.0)，28℃、200rpm培养过夜，然后按5％的比例将菌液接种入20mL不含抗生素的液体YEB，28℃、200rpm培养至OD600约为0.8。取5mL菌液6000rpm离心5min，倾去上清液，用10mL MSB0液体培养基重悬菌体，重悬菌液即为浸染外植体的农杆菌浸染液。

(2)番茄遗传转化

参考Cortina等(Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2004，76(3)：269-275)的方法，以生长约10d无菌苗的子叶为外植体，利用根癌农杆菌介导法进行遗传转化。

具体操作为：番茄种子1％次氯酸钠溶液灭菌10-15min，无菌自来水冲洗5-6次，25℃、16h光照/8h黑暗的光周期于固体MSB0萌发约10d，生长健壮的无菌幼苗子叶作为农杆菌介导遗传转化的外植体。农杆菌浸染液浸染外植体10min后倾去菌液，无菌吸水纸吸去外植体表面多余菌液，然后接种入铺有一层无菌滤纸的共培养培养基MSB1，25℃暗共培养2d。共培养完成后，将外植体接种入筛选培养基MSB2中进行分化培养，25℃、16h光照/8h黑暗的光周期培养2周，然后将外植体继代入MSB3培养基诱导愈伤生成，每2周继代一次。产生Km抗性幼芽后，将幼芽切下接种入MSB4生根培养基，获得Km抗性再生植株。根长3-5cm的再生幼苗，移栽入温室生长成苗。

实施例5：转基因番茄的分子生物学鉴定

5.1转基因番茄GUS组织化学染色

参照Jefferson等(1987)的方法，取再生植株幼嫩的根和叶片少许置GUS染色液(500mg/L X-Gluc，0.1mol/L K₃Fe(CN)₆，0.1mol/L K4Fe(CN)6，1％Triton X-100(v/v)，0.01mol/LNa₂EDTA，0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0))中，37℃保温2h。染色后，75％乙醇脱色，每2h更换一次脱色液，直至未着色部分的颜色完全褪去。根和叶片都没有蓝色出现的再生材料为非转基因植株，染出蓝色的为转基因植株。

5.2转基因番茄Bbchit1基因的PCR验证

以转基因番茄基因组DNA为模板，以序列2和序列3为引物，扩增Bbchit1基因片段。

PCR 25μl反应体系包括：1×PCR buffer，1.5mmol/L的MgCl₂，0.2mmol/L的dNTPs，上下游引物均为0.2μmol/L，25ng Template DNA，1U Taq DNA聚合酶。

PCR反应参数：94℃预扩增5min，然后94℃，30s；55℃，30s；72℃，60s；30个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR扩增结果显示，所有GUS阳性反应的植株都能扩增出Bbchit1基因840bp的目标特异带。说明GUS阳性植株都是Bbchit1转基因植株。部分扩增结果见图3。

实施例6：转基因番茄对早疫病的抗性

为了研究转基因番茄对叶片病害早疫病的抗性，以4～6片真叶的T₁代GUS阳性植株顶部完全展开幼叶为材料，参考Emani等(Plant Biotechnology Journal，2003，1(5)：321-336)的方法，利用离体叶片对转基因番茄T₁代进行早疫病抗性检测。早疫病病菌单孢菌落接种于PDA平板，26℃暗培养7d，用9mm无菌打孔器切取菌丝生长边缘的菌块，分别接种于PDA平板中央，26℃暗培养10d，然后于菌丝生长边缘切取9mm大小的菌苔，对称接种于每叶片顶部3个小叶的中部叶脉处，接种后26℃保湿培养10d，按0-5级的6级标准(0级：无病；1级：病斑面积占叶片面积的0～3％；2级：病斑面积占叶片面积的3～6％；3级：病斑面积占叶片面积的6～12％；4级：病斑面积占叶片面积的12～25％；5级：病斑面积占叶片面积的25％以上)统计叶片的病级，并按下列公式计算病情指数。

病情指数＝∑(病级数*株数)/(4*总株数)*100

每植株剪取顶部1片叶，每株系检测10株，以野生型和空载载体转基因植株为对照，试验重复3次。三次重复病情指数的平均值见图4，结果显示，Bb3株系的病情指数为21.2，Bb15株系的病情指数为0，都极显著地低于野生型植株的病情指数(97.7)(p＜0.01)；Bb5的病情指数虽然达到了42.5，但是与野生型植株的病情指数(97.7)相比，亦显著低于对照(0.01＜P＜0.05)。接种10d所有野生型植株叶片都有明显病症，并扩展至整个叶片，甚至叶片因感染而坏死，而抗病植株叶片没有失绿和组织坏死现象(图5)。结果说明，利用Bbchit1基因可显著提高番茄对早疫病的抗性。

实施例7：棉花遗传转化

以无菌下胚轴为受体，利用根癌农杆菌介导法进行棉花的遗传转化，将P5-35S-Bbchit1植物表达载体整合入棉花基因组。

7.1根癌农杆菌介导的棉花遗传转化常用培养基

基本培养基：MSB(MS无机盐+B5有机)(T.Murashige，1962；O.L.Gamborg，1968)；

种子萌发培养基：1/2MSB+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，自来水配制，自然pH；

共培养培养基：MSB+0.5mg/LIAA(吲哚乙酸)+0.1mg/LKT(6-糠氨基嘌呤)+30g/L葡萄糖+100μmol/L乙酰丁香酮+2.0g/L Gelrite(Sigma)，pH5.4；

筛选脱菌培养基：MSB+0.5mg/L IAA+0.1mg/L KT+75mg/L Km(卡那霉素)+500mg/Lcef(头孢霉素)+30g/L葡萄糖+2.0g/L Gelrite，pH5.8；

愈伤诱导培养基：MSB+0.5mg/L IAA+0.1mg/L KT+30g/L葡萄糖+2.0g/L Gelrite，pH5.8；

胚性愈伤诱导培养基：MSB+0.1mg/L KT+30g/L葡萄糖+2.0g/L Gelrite，pH5.8；

液体悬浮培养基：MSB+1.91g/L硝酸钾+0.1mg/L KT+30g/L葡萄糖，pH5.8；

体胚成熟培养基：MSB+15g/L蔗糖+15g/L葡萄糖+0.1mg/L KT+2.5g/L Gelrite，pH6.0；

成苗培养基：SH+0.4g/L活性碳+20g/L蔗糖，pH6.0。(Schenk & Hildebrandt，1972)

7.2棉花遗传转化具体操作方法

(1)转化用农杆菌的培养

挑取含p5-35S-Bbchit1表达载体的农杆菌LBA4404单菌落，接种入5ml附加50mg/L卡那霉素(Km)和125mg/L链霉素(Sm)的YEB液体培养基，28℃，180rpm振荡培养至OD₆₀₀约为1.0，取100μL菌液接种入100mL不附加抗生素的YEB液体培养基，28℃、180rpm振荡培养过夜，至培养液OD₆₀₀约为1.0，菌液室温8000rpm离心5min，无菌条件下弃上清液，以原菌液体积并附加100μmol/L乙酰丁香酮(AS)的无菌MSB液体培养基(共培养培养基不附加Gelrite固化剂)重悬菌体，备用。

(2)转化外植体的获得

陆地棉栽培种冀棉14号种子去壳，籽仁0.1％升汞灭菌10min，无菌水漂洗5-6次后，接种于种子萌发培养基，28℃暗培养5-7d。无菌下胚轴切成3-5mm长的切段，作为转化外植体。

(3)下胚轴的遗传转化和胚性愈伤的诱导

农杆菌浸染液浸染3-5mm下胚轴切段20min，倾去菌液，再用无菌滤纸吸去外植体表面多余的菌液，浸染后的下胚轴切段接种于共培养培养基，26℃暗培养2d，将下胚轴接种至筛选脱菌培养基，20d后继代入附加卡那霉素(Km)和头孢霉素(cef)的愈伤诱导培养基进行愈伤的诱导，间隔20d继代一次，60d后继代入胚性愈伤诱导培养基，获得胚性愈伤后进行液体悬浮培养，以获得大量生长一致的胚性愈伤。

(4)体胚的诱导和成苗培养

液体悬浮培养的胚性愈伤，30目不锈钢筛网过滤，筛下的胚性愈伤均匀分散地接种入体胚成熟培养基，约15d大量的体胚产生后，将体胚继代入SH培养基，促进体胚成苗。3-4片真叶的再生体胚苗移栽入温室，然后于温室内生长繁殖。

实施例8：Bbchit1转基因棉花的分子生物学鉴定

8.1转基因植株的GUS组织化学检测

参照Jefferson(1987)的方法，切取少许再生转基因植株幼嫩的根和叶片组织放入扩增管内，加入少许GUS组织化学染色液(500mg/L X-Gluc，0.1mol/L K₃Fe(CN)₆，0.1mol/LK₄Fe(CN)₆，1％Triton X-100(v/v)，0.01mol/LNa₂EDTA，0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0))，37℃暗处理1h，再用75％乙醇脱色，脱色后的根和叶片组织体视镜下观察组织着色情况。以野生型植株材料为对照。组织染成蓝色为阳性转基因植株，否则为阴性非转基因植株。

8.2转基因棉花植株内Bbchit1基因的PCR检测

以棉花幼嫩叶片为材料，提取转基因植株和野生型植株的总DNA，然后以总DNA为模板，Bbchit1目标基因特异引物(序列2和序列3)扩增Bbchit1基因片段。PCR扩增采用25μl反应体系进行。

PCR反应25μl总体系包括：1×PCR buffer，1.5mmol/L的MgCl₂，0.2mmol/L的dNTPs，上下游引物均为0.2μmol/L，25ng DNA，1U Taq DNA聚合酶。

PCR反应参数：94℃预扩增5min，然后94℃，30s；55℃，30s；72℃，60s；30个循环，最后再72℃延伸10min。扩增产物1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

结果显示，所有经GUS检测为阳性的转基因植株都能扩增获得840bp的Bbchit1目标特异带，部分扩增结果见图6。说明GUS阳性植株内Bbchit1基因都已整合入棉花基因组。

8.3转基因棉花植株内Bbchit1基因转录表达的RT-PCR检测

以转基因棉花幼嫩叶片为材料，提取植株RNA，然后用cDNA一链合成试剂盒(MBI公司产品)合成各样品RNA的一链cDNA，操作均按试剂盒说明书进行。利用一链产物cDNA为模板进行PCR扩增，25μL PCR扩增体系包括：cDNA一链产物1μL，10×PCR缓冲液(无Mg²⁺)2.5μL，5.0mmol/L dNTP 1μL、序列2和序列3引物(5.0μmol/L)各1μL，Taq DNA聚合酶1.0U，25mmol/L MgCl₂2μL，加入ddH₂O(双蒸水)至25μL。用棉花组蛋白HIS3基因作内标，以检测RNA质量的一致性。HIS3的引物为序列4和序列5(Zhu YQ等，2003)。线性扩增程序：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃延伸10min。结果显示，外源基因在GUS阳性植株内都能有效转录表达，部分RT-PCR检测结果见图7。

实施例9：转基因棉花抗黄萎病鉴定方法

9.1抗病鉴定接种用致病菌的制备

挑取少许固体PDA保存的落叶型和非落叶型黄萎病菌接种入液体PD培养基，180rpm，25℃振荡培养7d，再按10％(菌液/PD培养基)的比例接种入新鲜无菌PD培养基，180rpm，25℃振荡培养10d，用两层无菌粗布过滤去除菌液中的菌丝及杂质，去离子水调整落叶型黄萎病菌孢子浓度达到10⁸个孢子/ml，非落叶型黄萎病菌孢子浓度达到10⁹个孢子/ml作为接种菌液。

9.2人工气候室内抗病鉴定接种方法

T₀代转基因棉花4-6片真叶，其余世代3-4片真叶，生长相对一致的幼苗植株采用伤根灌菌液法接种致病菌。移栽入盆钵时每株慢慢浇灌菌液100mL，尽量让菌液湿润有棉花植株的土壤团，接种两天后浇透水，以保持盆钵内土壤的湿度。接种后于20℃(夜)-25℃(昼)，湿度80％以上，14h光照/10h暗培养的光周期条件下生长，接种15d按5级标准(0级：棉花植株外表无病症；1级：棉株叶片1/3以下显病症；2级：棉株叶片1/3-2/3显病症；3级：棉株叶片2/3以上显病症；4级：棉株叶片全部出现病症，叶片和花蕾脱落严重或植株光杆甚至死亡)统计植株病级，并计算植株的病情指数。T₀代每次接种均以野生型和空载转基因棉花幼苗为对照。其余各世代以野生型和未纯合株系分离的GUS阴性非转基因植株为对照。落叶型黄萎病菌接种浓度为10⁸个孢子/ml，非落叶型黄萎病菌接种浓度为10⁹个孢子/ml。

病情指数＝[∑(病级数*株数)/(4*总株数)]*100

9.3温室内抗病鉴定接种方法

纯合T₃代株系3-4片真叶幼苗移栽入温室时，采用伤根灌菌液法分别接种落叶型和非落叶型黄萎病菌。按2500株/亩的密度栽种，移栽时每株浇灌黄萎病菌液200ml，尽量让菌液湿透营养团，然后于幼苗周围扶湿润土壤，移栽两天后浇透水，以保证温室内幼苗正常生长。接种30d后统计植株的病情指数。并于植株生长后期将茎杆均分为上部、中部和下部三部分，然后剖杆按五级标准(0级：木质部无变色；1级：茎杆变暗褐色部分占剖面的25％以下；2级：变色部分占25％-50％；3级：变色部分占50％-70％；4级：变色部分占70％以上，或茎杆木质部全部变暗褐色)统计茎杆不同部位内部组织的病级，并计算病情指数。以接种分离于未纯合转基因株系的GUS阴性植株和野生型植株为对照，并设置未接种野生型植株对照。温室内接种试验按随机区组排列，每个材料重复三次，每个重复30株幼苗。落叶型黄萎病菌接种浓度为10⁸个孢子/ml，非落叶型黄萎病菌接种浓度为10⁹个孢子/ml。

实施例10：人工气候室内Bbchit1转基因棉花纯合T₂代株系对黄萎病的抗性

转基因棉花T₀和T₁代分别于人工气候室内接种落叶型黄萎病菌进行抗病鉴定和筛选，抗病植株于温室内进行繁殖，收获自交种子。并利用GUS组织化学染色法筛选获得纯合T₂代株系。

10.1转基因纯合T₂株系对落叶型黄萎病的抗性

人工气候室内，纯合T₂代株系植株高剂量接种落叶型黄萎病菌孢子悬浮液15d，Bb21和Bb23株系的病情指数分别为68.6和56.7，与非转基因对照的100.0相比，差异明显(图8)。接种15d，对照植株严重发病，多数叶片因发病而脱落，而抗病植株生长正常，没有叶片脱落现象(图9)。

10.2转基因纯合T₂株系对非落叶型黄萎病的抗性

人工气候室内，纯合T₂代株系植株高剂量接种非落叶型黄萎病菌孢子悬浮液20d，Bb21和Bb23株系的病情指数分别为41.7和50.0(图10)，都极显著地低于非转基因对照(100.0)(P＜0.01)。接种20d，对照植株严重发病，所有叶片都出现明显的病症，而抗病或耐病的植株生长正常(图11)。

人工气候内接种落叶型和非落叶型黄萎病菌后，Bbchit1转基因棉花株系的病情指数和病症说明，Bbchit1基因在棉花内组成型表达可明显提高棉花对黄萎病的抗性。

实施例11：温室内转基因棉花纯合T₃代株系对黄萎病的抗性

11.1转基因棉花纯合T₃代株系对落叶型黄萎病的抗性

温室接种落叶型黄萎病菌30d，Bb21和Bb23两个株系的病情指数都低于对照。Bb21的病情指数为41.5，极显著地低于非转基因对照的96.9(p＜0.01)。Bb23的病情指数为79.6，也明显低于对照(图12)。非转基因接种对照植株叶片都有病症，并出现叶片脱落现象。而抗病植株与未接种对照没有明显差异，生长正常，叶色鲜绿(图13)。

植株生长后期，Bb21株系植株茎杆下部、中部和上部内部组织的病情指数分别为50.0、25.0和0.0，与非转基因对照(100.0)相比，差异极显著(P＜0.01)。Bb23株系植株下部的病情指数虽然达到87.5，和对照的100相比，差异不显著，但其上部和中部的病情指数(37.5和50.0)却极显著地低于对照(100.0)(图14)。接种的非转基因对照植株生长前期叶片全部脱落并且死亡，这部分植株剖杆后内部组织各部位都因黄萎病菌的侵染出现了严重的褐化现象。而转基因植株在生长后期只是中心维管组织有病症，周围木质部部分没有变褐现象(图15)。

温室内Bbchit1转基因棉花株系植株的病情指数、植株叶片病症以及茎内部的病症说明，Bbchit1基因在棉花内组成型表达可明显提高棉花对落叶型黄萎病的抗性。

11.2转基因棉花纯合T₃代株系对非落叶型黄萎病的抗性

温室接种非落叶型黄萎病菌孢子30d，Bb21和Bb23的病情指数分别为19.1和24.6，与非转基因棉花对照的病情指数94.3相比，差异都达到极显著水平(P＜0.01)(图16)。接种30d，对照植株叶片都有明显的病症，抗病植株与未接种对照没有明显差异(图17)。植株生长后期，对照植株茎下部、中部和上部内部组织的病情指数分别为100.0、92.1和89.4；Bb21株系植株的则分别为26.4、10.3和3.9，都极显著低于非转基因接种对照(P＜0.01)(图18)。对照植株茎内部的木质部都因黄萎病菌的侵染出现了严重的褐化现象，而转基因抗病植株只是中心维管组织有少许褐色斑点产生(图19)。

温室内接种非落叶型黄萎病菌后，Bbchit1转基因棉花株系植株的病情指数、植株叶片病症以及茎内部的病症表明：棉花内组成型表达Bbchit1基因可有效提高棉花对非落叶型黄萎病的抗性。

上述实施实例表明，本发明利用球孢白僵菌几丁酶基因Bbchit1提高植物抗病性的方法，能够实现Bbchit1基因在转基因植物内组成型表达，有效提高转基因植株对真菌病害的抗性。经本发明获得的转基因棉花可同时提高对落叶型和非落叶型黄萎病的抗性。本发明方法简便易行，效果显著，具有很好的市场前景。

序列表

序列1Bbchit1基因核苷酸序列，长1047bp

  1  ATGGCTCCTT TTCTTCAAAC CAGCCTCGCG CTCCTTCCAT TGTTGGCTTC CACCATGGTC

 61  AGCGCCTCGC CCTTGGCGCC GCGAGCCGGC ACCTGCGCCA CCAAAGGCCG GCCGGCCGGC

121  AAAGTGCTCC AGGGCTACTG GGAGAACTGG GACGGTGCCA AGAACGGGGT GCACCCTCCG

181  TTTGGCTGGA CGCCCATCCA AAACCCCGAC ATTCGCAAGC ACGGCTACAA CGTCATCAAT

241  GCTGCCTTTC CCATCATCCA GCCTGACGGC ACCGCGCTCT GGGAGGACGG CATGGACACG

301  GGCGTCAAGG TGGCGAGCCC GGCCGACATG TGCGAGGCCA AGGCAGCAGG TGCCACCATC

361  TTGATGTCGA TTGGCGGTGC TACTGCGGCC ATTGACCTGA GCTCGTCGGC TGTGGCTGAC

421  AAGTTTGTCT CGACCATTGT GCCGATTCTG AAAAAGTACA ACTTTGACGG CATTGATATC

481  GACATTGAAT CCGGCCTCAC AGGCAGCGGA AACATAAACA CCCTGTCCAC CTCGCAGACC

541  AACCTGATTA GAATCATTGA CGGCGTTCTC GCGCAGATGC CCGCCAACTT TGGCTTGACC

601  ATGGCGCCAG AGACTGCCTA CGTTACCGGT GGGACTATTA CGTACGGATC AATCTGGGGC

661  TCTTACCTCC CCATTATCAA AAAGTACCTG GACAATGGTC GTCTCTGGTG GCTCAACATG

721  CAGTACTACA ATGGCGAAAT GTACGGCTGC TCCGGCGACT CGCACAAGGC CGGTACTGTC

781  GAAGGATTCA TTGCTCAGAC CGACTGCCTG AACAAGGGAC TTAGTATTCA GGGCGTGACA

841  ATCACGATTC CCTATGACAA GCAAGTGCCT GGCCTTCCTG CCCAGCCTGG GGCTGGCGGC

901  GGCCACATGT CCCCGTCCAA CGTGGCGCAA GTTCTCTCCC ACTACAAGGG CGCTTTGAAG

961  GGATTGATGA CTTGGTCTCT GAACTGGGAC GGCTCCAAGA ATTGGACATT TGGCGACAAT

1021 GTCAAGGGGA CTTTGGGGAC TGCGTAA

序列2：转基因植株内Bbchit1基因扩增引物1

5’-TGC ACA ATG CTG ATC GCG-3’

序列3：转基因植株内Bbchit1基因扩增引物2

5’-TGG CAA GCG TTT TCA GGC-3’

序列4：转基因植株内GhHIS3基因扩增引物1

5’-GAA GCC TCA TCG ATA CCG TC-3’

序列5：转基因植株内GhHIS3基因扩增引物2

5’-CTA CCA CTA CCA TCA TGG C-3

序列6：基因组内Bbchit1基因扩增引物1

5’-CGG GGT ACC ATG GCT CCT TTT CTT CAA ACC A-3’

序列7：基因组内Bbchit1基因扩增引物2

5’-CG GAA TTC TTA CGC AGT CCC CAA AGT CCC CTT-3’

Claims (1)

1.一种利用球孢白僵菌几丁酶基因提高植物抗病性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)获得球孢白僵菌几丁酶基因Bbchit1：设计引物引入酶切位点后，以球孢白僵菌基因组DNA为模板进行扩增，扩增产物与pUC-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆获得Bbchit1基因，所述Bbchit1基因序列如序列1所示；

2)构建组成型表达几丁酶基因植物表达载体：将Bbchit1基因插入植物表达载体P5，构建一个新的植物表达载体，命名为p5-35S-Bbchit1，组成型表达启动子为花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子；所述P5、p5-35S-Bbchit1的构建分别如图2、图1所示；

3)利用根癌农杆菌介导法，将所述CaMV35S启动子控制下的球孢白僵菌几丁酶基因Bbchit1整合入植物基因组，实现Bbchit1基因在植物内的组成型表达，提高植物对真菌病害的抗病能力；

4)将步骤3)获得的转基因植物进一步进行培养栽培、分子鉴定、人工气候室和温室内的抗病鉴定，获得抗病性提高的转基因植株；所述植物为番茄或棉花。

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