CN100372935C - 辣椒抗根结线虫基因的克隆及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体地涉及一种DNA片段的分离、克隆。所述的DNA片段能够赋予植物抵抗由根结线虫引起的病害。将该DNA片段装入合适的载体获得植物表达载体(保藏号：CCTCC-M205110)，将该植物表达载体通过农杆菌介导的方法转入植物体内，转基因植物可产生对根结线虫的抗性。作为其中一个实施例，本发明已经获得抗根结线虫的转基因番茄。

Description

辣椒抗根结线虫基因的克隆及其应用

技术领域

本专利属于植物基因工程领域。具体涉及从抗性辣椒基因组中分离、克隆得到根结线虫抗性基因，然后将该基因导入到不具根结线虫抗性的植物材料中，如对根结线虫敏感的番茄，获得转基因抗根结线虫番茄植株。

背景技术

植物根结线虫(Meloidogyne spp.)病是一种世界病害，严重威胁作物的生产。根结线虫的寄主范围广泛(达2000多种植物)、传播途径多样，是一种极难防治的土传病源。国际上已经发现的根结线虫有80多种(Karssen et al.，1999)，我国已鉴定25种，其中分布最广、危害最严重的为南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)及花生根结线虫(M.arebaria)。据统计，在引起植物侵染性病害的四大病原中，植物寄生线虫的危害超过细菌和病毒，仅次于真菌病害，其每年造成世界农业生产的损失约1000亿美元(Sasser&Freekman，1987)，而其中根结线虫对重要经济作物造成的损失每年就高达数百亿美元(Barker et al.，1986)。我国每年因线虫对各种蔬菜的危害而造成的损失高达30多亿元人民币。

到目前为止，对根结线虫仍缺乏直接有效的防治方法，主要采用一些间接的手段，包括轮作防治、物理防治、化学防治及生物防治等。其中轮作防治被广泛应用，但对一些特殊经济作物或特定地区无法达到合理轮作的要求，具有较大的局限性，而且也不适用于寄主范围较宽的根结线虫的防治。物理防治如土壤高温消毒，费工费时，且只对30cm以内深度的土壤有效，而根结线虫具有往深层活动的能力(Cartia&Greco，1978)。化学防治如欧美等国家大多采用溴甲烷进行土壤熏蒸，由于成本高，而且溴甲烷可能破坏地球臭氧层，美国等一些国家已立法禁止使用。生物防治主要是利用自然界所有的线虫天敌生物，其对线虫的作用机制总体上分为捕食、寄生、拮抗或毒杀等三类。目前研究最多的是食线虫真菌，虽然有一定的进展，但是离实际应用还有很大的距离。实际上，根结线虫在生产上呈迅速扩大和蔓延的趋势，可见这些方法在遏制根结线虫发生上效果非常有限，且污染环境，降低产品品质，危害人体健康，影响农业的可持续发展。

由此可见，防治根结线虫，选育和利用抗病作物品种是最直接、有效、经济的途径。传统的有性杂交方法培育抗线虫病品种，存在抗源材料缺乏、选择周期长，费用高，不良性状的遗传累赘等缺陷，严重影响育种目标的实现，所以利用基因工程的方法获得根结线虫抗性基因并将其转化到特定植物中，获得具有抗根结线虫特性的植物是一个新的育种途径。

目前国际上已经报道克隆得到了四个抗线虫的基因。1)是在甜菜中克隆得到的抗孢囊线虫基因Hsl^pro-1(①Cai D，Kleine M，Kifle S，et al.(1997).Positional cloning of a gene for nematode resistance insugar beet.Science 275：832-834.)；2)是番茄中1998年通过图位克隆的方法得到的抗番茄根结线虫基因Mi(②Stephen B M，Jhon B，Jafar Y，et al.(1998).The Root Knot Nematode Resistance Gene Mifrom Tomato Is a Member of the Leucine Zipper，Nucleotide Binding，Leucine-Rich Repeat Family ofPlant Genes.The PlantCell，Vol 10，1307-1319.)；3)为马铃薯中克隆得到的抗土豆孢囊线虫基因Gpa2(③Van der V.，E.A.，van der V.，et al.(2000).Homologues of a single resistance-gene cluster in potatoconfer resistance to distinct pathogens：a virus and a nematode.PlantJ.23：567-576.)，4)是在番茄中克隆得到的抗马铃薯孢囊线虫基因Hero(④Ernst K，Kumar A.，Kriseleit D.，et al.(2002).Thebroad-spectrum potato cyst nematode resistance gene(Hero)from tomato is the only member of a largegene family of NBS-LRR genes with an unusual amino acid repeat in the LRR region.The Plant Cell，Vol31(2)：127-136.)。

辣(甜)椒抗根结线虫育种研究始于20世纪中叶。Martin于1948年首次报道了辣椒品种对根结线虫的抗性。现有的研究结果表明，辣椒属中存在多个抗线虫病基因，这些基因的来源、抗谱范围、对温度的稳定性和抗病机制各不相同，已经定位的抗线虫病基因如表1所示。Hare等(Hare WW，Inheritance of resistance to root-knot nematodes in pepper、Phytopathology，1957，47：455-459.)将他发现的第一个抗线虫基因命名为N，该基因为单显性基因，抗南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫，在28℃以上会丧失部分抗性。Hendy等(Hendy H，Pochard E，Dalmasso A.Transmissionhereditaire de Ia resistance aux nematodes Melooidigyne Chitwood(Tylenchida)portee par 2 lignees deCapsicum annuum L.：etude de descendances homozygotes issues d’androgenese.Agronomie，1985，5(2)：93-100)通过双单倍体群体，在PM217和PM687共发现了5个抗病显性基因(Me1～5)，其中Me1、Me3抗谱较广，利用价值较大。Di Vito等(Di Vito M，Zaccheo G，Catalano F，etal.Effect of temperature on stability of resistance to root-knot nematode(Meloidogyne spp.)IXthEUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Capsicum&Eggplant，1995-Budapest，Hungary，1995，230-232)在几个野生辣椒材料中也发现了几个抗线虫病基因，但没有命名。

表1 已定位尚未克隆的辣椒属(Capsicum spp.)抗线虫基因

基因名称	来源	特征、特性	遗传特征	文献
					NMe1Me2Me3Me4Me5---------	Santaka XSPM217PM687Yolo WonderPI15925646-530/746-530/756-547/756-547/7Tabasco28-201PA135PA-426	抗Mi，Mj和Ma，对温度敏感抗Mi，Mj和Ma，对温度敏感抗Mj和M.sp.Seville抗Mi，Mj和Ma，对温度稳定抗Ma抗Mj，抗性较弱抗Mi，Mj和Ma，对温度稳定抗Mi，Ma，对温度稳定抗Mj，对温度稳定抗Mi，Mj，对温度稳定抗Ma，对温度稳定抗Mi，Mj和Ma，对温度稳定抗Mi，Mj和Ma，对温度稳定抗Mi抗Mi	显性单基因显性，与Me2不连锁显性，与Me1不连锁显性，与Me4连锁显性，与Me3连锁-单隐性基因单显性基因两个显性基因，隐性上位互作单显性基因两个显性基因，显性上位互作单显性基因单显性基因一个显性基因和一个隐性基因，显性基因与N等位单显性基因，与N等位	345612

注：Mi：Meloidigyne incognita(南方根结线虫)，Mj：M.javanica(爪哇根结线虫)，Ma：M.arenaria(花生根结线虫)

表1中所列的参考文献见说明书末尾所示。

前人虽然已经在辣椒中定位了这些抗线虫基因，但目前尚未见基因克隆及其序列的报道，更未见应用上述有关基因培育转基因抗线虫植物，其中特别是培育转基因抗根结线虫番茄的文献报道。只是在专利查新中发现日本筑波大学的专利申请“新的根结线虫(Meloidogyne)抗性基因及其用途”(中国发明专利申请号：02829029.1)中提到抗根结线虫基因在茄科植物(其实施例为野生烟草和马铃薯转基因植物)中的应用，但本发明与其有以下的区别：

第一、基因及其来源。日本筑波大学申请的专利中的抗根结线虫基因来源于马铃薯；而本发明的根结线虫抗性基因来源于辣椒基因组，是一完整的基因，且与在先专利中的抗根结线虫基因没有多大的联系。

第二、应用范围及方法。前申请的专利中虽然提到是茄科植株，但在说明书及实施例中并没有提到番茄以及该基因在番茄中的应用方法及应用效果；而本发明则为从辣椒基因组中克隆到抗根结线虫基因，然后把它用于番茄的抗根结线虫的转基因植物的培育上，有详细的制备方法及应用效果说明。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，从辣椒(Capsicum annuum L.)植株基因组中克隆得到一个根结线虫抗性基因，通过遗传转化获得抗根结线虫的转基因番茄植株，以克服现有番茄植物不抗根结线虫的特性，实施绿色栽培，避免为防治根结线虫而大量施用农药对环境造成的污染，同时有利于降低农业生产成本。

本发明是这样实现的：

本发明主要是从抗性辣椒基因组中克隆得到一种根结线虫抗性基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；然后将该基因导入到不具根结线虫抗性的植物如对根结线虫敏感的番茄品种中，获得抗根结线虫番茄转基因植株。

本发明的技术流程如附图1所示。

1.本发明的基因的分离克隆，命名为Me

1.1同源序列克隆

本发明克隆的基因序列来自辣椒基因组，根据植物中目前已克隆得到的四个抗线虫基因(参见上述参考文献Hsl^pro-1①，Mi②，Gpa2③，Hero④)的核苷酸结合位点(Nucleotide binding site，NBS)和富亮氨酸重复区域(Leucine-rich repeat region，LRR)保守序列设计一对简并引物，以抗性辣椒基因组DNA为模板，PCR扩增，产物回收，克隆至载体pMD18T(购自日本TaKaRa公司)中，测序(由北京奥科生物技术有限公司完成)，NCBI中进行序列比对分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。

1.2 Me基因的克隆

根据以上测序比对结果，选择番茄抗根结线虫基因序列，进行氨基酸序列比较，设计特异引物，并在其后加12bp的attB位点核心序列，经两轮PCR扩增，获得带有attB位点25bp核心序列的Me基因PCR产物，其大小约5.4kb。

2. Me基因的应用

2.1 植物表达载体构建

上述Me基因PCR反应产物回收后，在B/P重组酶(购自美国Invitrogen公司)的作用下，与载体pDONR201(购自美国Invitrogen公司)进行B/P反应(参照Invitrogen公司产品说明书进行)，得到载体pDAMe，测序(由北京奥科生物技术有限公司完成)，并进行序列分析。载体pDAMe选用合适的内切酶(ApaI和NruI)酶切，将目的基因片段克隆至切除GUS基因的植物二元转化载体pBI121中，得到表达载体pBAMe(该载体已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号：CCTCC-M205110)。该载体pBAMe结构见附图6，构建过程如图2所示。

2.2 植物遗传转化

利用农杆菌(菌株号和详细操作方法见实施例)介导的遗传转化，把载体pBAMe转入对根结线虫敏感的植物如番茄中，获得具有根结线虫抗性的转基因植株。

2.3 分子鉴定及接种检测

根据载体T-DNA区结构，针对标记基因(如NPTII基因)或目的基因(Me基因)设计特异引物，分别进行PCR扩增或/和Southern杂交鉴定，确认获得抗根结线虫转基因番茄植株的真实性。同时在25-30天苗龄时接种二龄根结线虫幼虫如南方根结线虫(M.incognita)，40-50天后确认转基因植株的抗根结线虫的特性。

与现有技术相比本发明的积极效果是：

1、同源序列法克隆基因较其他方法更简便、迅速；

2、利用转基因的方法获得抗性植株较传统的育种方法更经济、直接、有效，解决了种质资源匮乏问题，大大缩短了育种年限；

3、与传统防治方法相比，本发明的转基因抗根结线虫番茄植株不需要施用农药防治根结线虫，既节省了生产成本，又保护了环境，是一种绿色农业技术。

附图说明

图1是本发明的技术流程图；

图2是本发明的其中一个实施例的载体构建流程；

图3是本发明的简并引物PCR扩增结果；

图4是本发明的抗根结线虫基因Me PCR扩增结果；

图5是本发明构建的中间载体pDAMe的酶切检测结果

图6是本发明构建的Me基因的植物表达载体pBAMe图；

图7是本发明构建的表达载体pBAMe的酶切检测结果；

图8是本发明其中一个实施例中部分T0代抗根结线虫转基因番茄植株PCR检测结果，1

为Marker，2为阳性对照，3为阴性对照，4-10为转基因植株；

图9是本发明其中一个实施例中部分T0代抗根结线虫转基因番茄植株Southern杂交检测

结果，1-22为转基因植株，23为阴性对照；

图10是本发明中一个实施例的转基因番茄植株的具有抗根结线虫特性的根外观；

图11是本发明中一个实施例的非转基因番茄感根结线虫病的根外观。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出更详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：本发明Me基因的分离克隆

本发明克隆的基因来自辣椒基因组，根据植物中目前已克隆得到的四个抗线虫基因(参见上述参考文献Hsl^pro-1①，Mi②，Gpa2③，Hero④)的核苷酸结合位点(Nucleotide binding site，NBS)和富亮氨酸重复区域(Leucine-rich repeatregion，LRR)保守序列设计一对简并引物(如下所述)，以抗性辣椒基因组DNA为模板，PCR扩增，反应体系为25μL，内含1×PCR buffer，1.5mmol/LMgCl₂，0.2mmol/L dNTPs，0.2mmol/L正向和反向引物，1U Taq DNA聚合酶，100ng模板。反应循环参数：94℃预变性5min，94℃30s，50℃1min，72℃90s，5个循环，94℃30s，55℃1min，72℃90s，25个循环，72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物回收，连接到pMD18T载体中，热击法(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》，第三版，金冬雁等译，科学出版社，2002，北京)转化大肠杆菌DH5a，在含有50mg/L氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个克隆测序(由北京奥科生物技术有限公司完成)，测序结果表明，其中一个克隆长493bp，该片段与已报道的番茄抗根结线虫Mi基因的同源性达到99％。

本发明所设计的简并引物序列如下：

NBS-FW1：5’-TG(G/C)(G/C)(G/A)GG(T/A/C)(T/A)(T/C)(G/A)GG(T/C/G)AAAACTAC-3’；

NBS-RV1：5’-(T/A/C)(G/A)C(T/A)A(A/G)AGG(A/G/C)A(A/G)CCCT(T/C)(T/G/C)ACA-3’。

根据以上测序比对结果，选择已报道的番茄抗根结线虫Mi两端的序列，设计特异引物，并在其后加12bp的attB位点核心序列，结合attB引物，以抗性辣椒基因组DNA为模板，经两轮PCR扩增，获得带有attB位点25bp的Me基因PCR产物。

扩增Me基因的正反引物分别是：

Me-FW：5′-AAAAAGCAGGCTTCCAATAGCTTCAACATTATT-3′，

Me-RV：5′-AGAAAGCTGGGTGTACTTATAAAAATTATATTTTTTG-3′，

扩增attB正反引物分别是：

attB FW：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3′，

attB RV：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3′。

PCR反应体系为：25μL体积内含1×PCR buffer，2.0mM/LMgSO₄，0.2mmol/L dNTPs，0.2pmol/L正向和反向引物，0.25U pfu酶，0.5U Taq DNA聚合酶，100ng模板。扩增反应循环参数为：94℃预变性5min，然后94℃30s，49℃1min，72℃7min，10个循环，最后72℃延伸10min。4℃保存。取5μL以上反应产物，利用attB引物进行第二轮扩增。反应体系：在50μL反应体系中，分别加入1倍PCR buffer，2.0mmol/LMgSO₄，0.2mmol/L dNTPs，0.2mmol/L正向和反向引物，0.5Upfu酶，1.0U Taq DNA聚合酶，模板为5μL第一轮PCR产物。反应循环参数：94℃预变性5min，94℃30s，45℃1min，72℃6min30s，反应5个循环，然后94℃30s，55℃1min，72℃6min30s，反应15个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物回收。在B/P重组酶的作用下，回收产物与正义表达位点重组载体pDONR201进行B/P反应(依照美国Invitrogen公司产品说明书进行)，得到载体pDAMe，测序(由北京奥科生物技术有限公司完成)。结果表明，本发明克隆得到的辣椒根结线虫抗性基因Me全长5447bp，含两个内含子及两个外显子，mRNA长3950bp，序列中包含3656bp的开放阅读框，86bp5’非翻译区和104bp的3’非翻译区。与已报道的番茄抗根结线虫Mi相比，Me基因的两个内含子大小不同，Mi基因内含子分别为1306bp和75bp，而Me基因内含子则分别为1182bp和315bp；另外，两个基因编码的氨基酸大小不同，Mi基因编码1257个氨基酸，而Me基因则编码1251个氨基酸；还有，相对于Mi基因，Me基因有一段从第1767个碱基到第1937个碱基的共171bp的插入突变，及第2801个碱基到第2989个碱基处共189bp的缺失突变。

实施例2、植物转化载体构建

将质粒pDAMe经ApaI和NruI酶切，然后利用T4DNA Polymerase补平，回收大片段；同时，质粒pBI121经BamHI和Sac I酶切，去掉GUS基因片段，利用T4 DNA Polymerase补平，再用酸性磷酸脂酶CIAP去磷酸化，凝胶电泳后回收大片段，与前回收产物在T4DNA连接酶的作用下连接，连接产物转化大肠杆菌菌株DH5a，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，获得含有插入目的片段的重组克隆，命名为pBAMe。应用电激法(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》，第三版，金冬雁等译，科学出版社，2002，北京)将pBAMe导入到农杆菌LBA4404(参考文献：Sakae S.And Masaru N.(2002)Agrobacterium-Mediated Transformationin Liliaceous Ornamental Plants JARQ36(3)，119-127)中。含有该质粒pBAMe的大肠杆菌DH5a保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC-M205110。本发明的植物表达载体pBAMe构建流程见附图2所示。

实施例3、植物遗传转化

利用电激法将质粒pBAMe导入到农杆菌LBA4404中，转化性状稳定且对根结线虫敏感的番茄品种“中蔬五号”(购买自商业品种)，通过分子鉴定及抗虫筛选及自交纯化，获得纯合的转基因植株或株系。

根癌农杆菌介导的番茄遗传转化步骤如下：

1、无菌苗和烟草细胞培养

无菌苗培养：将番茄品种“中蔬五号”种子用70％酒精消毒1min，而后在20％的次氯酸钠(含有效氯6％)中消毒15min，灭菌蒸馏水冲洗3次，将种子接种到1/2MS基本培养基(参见Murashige T.andF.Skoog.Physiol.Plant，1962，15：473-497)中，于25±2℃暗处直至种子发芽，然后于光照强度1800 lx，16h光/8h暗的光周期条件下培养。

烟草细胞培养：烟草细胞NT1在KCMS-L培养基(见表2)中悬浮培养，每周按体积比2∶48稀释继代。

2、外植体准备和农杆菌培养

在分离外植体前一天准备烟草看护培养基KCMS-S(见表2)，将生长了7天的烟草悬浮细胞吸取1.5ml转移到KCMS-S培养基上，覆盖一张直径7cm的灭菌滤纸，25℃黑暗中过夜培养备用。

外植体准备：“中蔬五号”种子发芽后6天，将无菌苗的子叶剪下或用刀片切下，子叶带有一小段叶柄，接种于KCMS-S培养基中预培养1天。

农杆菌培养：在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上挑取含有pBAMe的农杆菌LBA4404单菌落接种于10ml含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中于28℃150转/分过夜培养至对数中期O.D1.0。

3、转化再生

将3～4皿的“中蔬五号”子叶外植体转移到50ml灭菌三角瓶中，经以MS0.2(见表2)稀释至O.D＝0.2～0.3的含有pBAMe农杆菌LBA4404液接种感染5min，并轻轻摇动三角瓶，用吸管吸去农杆菌液，将外植体转移到灭菌滤纸上，吸干残留的菌液，回接到KCMS-S培养基上，于22℃进行1～2天的共培养；培养后将外植体小心转入MRS1培养基(见表2)上。经过1～2周培养，大多数子叶颜色变暗，叶片萎焉并逐渐变白；有些子叶基部也能形成少量白色疏松的愈伤组织，但最终会在继代培养中死去；只有少数子叶的基部能逐渐长出少量致密的愈伤组织并慢慢转为绿色，大约3～4周后便能分化形成小芽点，将这种带有小芽点的外植体转入改良的MRS2培养基(见表2)中。此时小芽点逐渐分化出幼叶，形成小芽，但也有小芽点仅能分化出一、二片叶，无正常的生长点，不能正常生长。一个愈伤组织上一般只能形成一个小芽，多者也可以分化出3～4个芽。对“中蔬5号”这一基因型进行转化频率统计约为10％左右。未转化的对照子叶外植体(Wt)在选择性培养基上不能分化和生长，子叶很快退绿，最后死亡。而在非选择性即无卡那霉素筛选的芽分化培养基上的子叶外植体能高频率分化出芽，分化频率可达98％。

选择培养过程中应及时清除掉农杆菌污染的材料。

4、再生芽生根移栽

待再生芽长至1cm左右时，将芽切下放入RS培养基(见表2)中生根，2周后对生根良好，长至5cm左右的转化苗进行炼苗移栽至一次性塑料杯中，成活后移栽至大田中。

表2 本发明的用于番茄遗传转化所用培养基配方

培养基代号	用途	配方
			1/2MSMRS1MRS2RSMS0.2KCMS-LKCMS-S	无菌苗培养选择性再生选择性再生选择性生根农杆菌重悬烟草悬浮细胞培养看护培养	1/2MS基本培养基的无机盐和维生素+15g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，加水至1升，下同MS基本培养基的无机盐类和维生素+30g/L蔗糖+2.0mg/L玉米素+100mg/L吲哚-3-乙酸+100mg/L卡那霉素+200mg/L头孢霉素+7.5g/L琼脂MS基本培养基的无机盐类和维生素+30g/L蔗糖+0.2mg/L玉米素+1.0mg/L吲哚-3-乙酸+100mg/L卡那霉素+200mg/L头孢霉素+7.5g/L琼脂1/2MS基本培养基的无机盐类+1.0mg/L吲哚丁酸+3％蔗糖+7.5g/L琼脂MS基本培养基的无机盐类+2％蔗糖(液体培养基)MS基本培养基的无机盐+20mg/L肌醇1+0.65mg/L盐酸硫氨素+0.2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸+100mg/L磷酸二氢钾+0.1mg/L激动素(KT)+3％蔗糖KCMS-L+7.5g/L琼脂

注：以上培养基除名称为KCMS培养基的pH为5.5外，其余培养基的pH均为5.8。

实施例4、转化植株的分子鉴定

利用CTAB法(见Fulton，T.M等，Microprep protocol for extraction of DNA from tomato and otherherbaceous plants.，Plant Moleculor Biology Reporter，1995，(13)：207-209)提取待鉴定转基因番茄植株叶片DNA。取0.5-1g幼嫩叶片于1.5ml Eppendorf管中，迅速捣烂，加入700μl提取缓冲液(100mmol/lTris-HCl，pH＝8.0，1.4mol/l NaCl，20mmol/lEDTA，2％CTAB，0.1-2％巯基乙醇)65℃水浴30min，12000r/m离心5min，取上清液，用氯仿异戊醇(按体积比24∶1)抽提1次，加入冰冷的等体积异丙醇，摇匀，静置，12000r/m离心6min，沉淀用75％酒精洗涤、干燥、TE溶解、RNase处理后保存备用。分别以目的基因Me、标记基因NPTII的特异引物，通过PCR扩增进行鉴定。反应体系：在25μL反应体系中，分别加入1倍PCR buffer，1.5mmol/L MgCl₂，0.2mmol/L dNTPs，0.2mmol/L正向和反向引物，1U Taq DNA聚合酶，100ng模板，加ddH₂O至25μL。反应循环参数：94℃预变性5min，94℃30s，58℃1min，72℃1min30s，反应35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。1％凝胶电泳检测。或以Me、NPTII基因片段的特异探针进行Southern Blot(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》，第三版，金冬雁等译，科学出版社，2002，北京)分子鉴定。PCR扩增pBAMe载体上的目的基因和(或)NPTII片段为模板，采用随机引物法(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》，第三版，金冬雁等译，科学出版社，2002，北京)(a-³²p)dCTP标记探针。取20μg植物DNA Bam H I酶切过夜，1％琼脂糖胶电泳12h。转移到尼龙膜，预杂交，杂交，于-70℃放射自显影7天，洗X光片，照相记录结果。鉴定结果显示，Me基因已经以不同的拷贝数插入至番茄的基因组中，获得了转基因植株。PCR及Southern鉴定结果如图8、9所示。

实施例5、转基因植株的抗性评价

接种方法：将番茄转基因植株当代通过无性繁殖的方法拷贝6份，其中一份用于留种，其余5份用于转基因植株的抗性评价实验。将用于抗根结线虫实验的番茄转基因植株及用于阴性对照的对根结线虫敏感的非转基因植株“中蔬五号”定植在直径25cm，高30cm的花盆中，每个花盆内移栽一株番茄，花盆内装有已消毒的基质(泥炭土∶蛭石∶珍珠岩＝2∶2∶1)。植株成活后，每盆接种约3000头二龄南方根结线虫(M.incognita)幼虫。之后，进行正常的肥水管理和地上病虫害防治。温室内温度控制在20～30℃。2个月后将植株连根拔起，自来水洗尽后使用0.05％的罂红对根结线虫卵块进行染色，此时卵块会被染成兰色，以根上是否存在卵块和卵块的数量来作抗性评价。采用的抗性分级标准为：0级，根系上无卵块；1级，有1～5个卵块；2级，有6～20个卵块；3级，有21～50个卵块；4级，有51～100个卵块；5级，卵块数超过100个。其中，0～2级为抗病级(R)，3～5级为对根结线虫敏感(S)。鉴定结果表明本发明获得了对南方根结线虫具有良好抗性的转基因番茄植株(见表3)，该转基因番茄植株遗传性能稳定，发育良好，可以作为选育抗根结线虫新品种的种质资源。本发明的转基因抗根结线虫番茄的根与对照(感根结线虫)即非转基因番茄品种“中蔬五号”的根的外观形态如图10、11所示。图10中的转基因植株表现为根上无卵块或卵块很少，是抗根结线虫的典型表现，而图11中的非转基因番茄品种则严重感染了南方根结线虫，在整个根部均发现了许多根结。

表3 本发明的转Me基因抗根结线虫番茄植株抗性分析

转化植株编号	根结数	根结级数	抗性	Southern杂交确定引入基因的数目
					ZS1ZS3ZS6ZS12ZS15ZS19ZS18ZS33加1加4加10加11ZSCK加CK	6±64±851±122±24±51±20±058±571±155±172±427±7>100>100	21411104141355	RRSRRRRSRSRSSS	615121171413

注：卵块数为5棵无性繁殖植株根上卵块数的平均值±标准误。采用的分级标准：0级，根系上无卵块；1级，有1～5个卵块；2级，有6～20个卵块；3级，有21～50个卵块；4级，有51～100个卵块；5级，卵块数超过100个。其中，0～2级为抗病级(R)，3～5级为感病级(S)

实施例6、抗根结线虫番茄转基因品系的应用效益评价

目前国内外防治根结线虫最为广泛的方法是使用溴甲烷熏蒸土壤。溴甲烷是一种剧毒化合物，不仅对环境造成污染，还增加了生产成本。而栽培抗根结线虫番茄品种，不但不会对环境造成污染，符合绿色农业生产的要求，而且还可以节约生产成本，提高番茄品质，使农民增产增收。本发明利用对根结线虫敏感的非转基因番茄品种“中蔬五号”为对照，对新创造的转基因抗根结线虫番茄品系ZS12进行了经济效益的评估研究。具体的试验设计为：小区面积为8.0m×1.2m，双行种植，每行15株，株行距为50cm和55cm。四个处理：①未经溴甲烷熏蒸的土壤栽培转基因抗根结线虫番茄品系ZS12；②经溴甲烷熏蒸的土壤栽培转基因抗根结线虫番茄品系ZS12；③未经溴甲烷熏蒸的土壤栽培抗对根结线虫敏感的非转基因番茄品种“中蔬五号”；④经澳甲烷熏蒸的土壤栽培抗对根结线虫敏感的非转基因番茄品种“中蔬五号”(溴甲烷购自临海市建新化工有限公司，浓度为98％，液体，20元/千克，用量为75克/平方米土壤)。于2004和2005年春季分别栽种于华中农业大学园艺林学学院蔬菜科研教学实习基地有根结线虫的日光温室中，其他栽培条件一致。在整个生产周期内统计番茄产量，并根据当年番茄的平均价格计算其产值。同时结合使用溴甲烷的费用(1.5元/平方米)，评价栽培转基因抗根结线虫番茄的应用价值，如表4所示。

表4 本发明的抗根结线虫番茄转基因植株的应用效益评价

番茄品种本发明ZS12(R)平均值对照中蔬五号(S)	年份2004200520042005	番茄产量(千克/平方米)		产值(人民币，元/平方米)
						溴甲烷熏蒸9.1±0.88.9±0.99.0±0.98.5±1.08.1±1.0	无溴甲烷熏蒸9.0±1.08.8±0.98.9±1.15.3±1.14.9±1.2	溴甲烷熏蒸12.0214.9613.5013.2213.60	无溴甲烷熏蒸11.8814.7813.347.008.24
		平均值		8.3±1.3	5.1±1.2					13.40	7.62<sup>**</sup>

(R)表示抗根结线虫，(S)表示对根结线虫敏感。表中产量的数据为每个小区中30株番茄产量的平均值±标准误。澳甲烷的费用的费用为1.50元/平方米。2004和2005年番茄的平均价格分别为人民币1.32、1.68元/千克。^**邓肯氏新复级差检测P≤0.01。

从表4可知，栽培抗根结线虫番茄品种，有无溴甲烷熏蒸，对其产量的影响不显著，但是利用溴甲烷熏蒸每平方米增加的生产成本为人民币1.5元。而感病品种“中蔬五号”在没有溴甲烷熏蒸的情况下，产量大幅度下降，达到极显著水平，严重地影响了番茄的生产效益。

表1的参考文献

1.Fery R L，Thies J A.Genetic analysis of Resistance to the southern root-knot nematode in Capsicumchinense Jacq.J.Amer.Soc.Hort.Sci.，1998.123(6)：1008-1011.

1.Fery R L.The inheritance of resistance to the southern root-knot nematode in‘Carolina Hot’cayennepepper.J.Amer.Soc.Hort.Sci.，1996，121(6)：1024-1027.

2.Hare W W.Inheritance of resistance to root-knot nematodes in pepper.Phytopathology，1957，47：455-459.

3.Hendy H，Pochard E，Dalmasso A.Transmission hereditaire de Ia resistance aux nematodesMelooidigyne Chitwood(Tylenchida)portee par2 lignees de Capsicum annuum L.：etude dedescendances homozygotes issues d’and rogenese.Agronomie，1985，5(2)：93-100

4.Vito M D，SaccardoF，Errico A，et al.Genetics of resistance to root-knot nematodes(Meloidogyne spp.)in Capsicum chacoens.e，C.chinense and C.frutescens.J.Genet.&Breed，1993，47：23-26

5.Vito M D，Saccardo F.Resistance of pepper to root-knot nematode(Meloidogyne spp.)：present andfuture.D N Maynard ed，Proceeding of The National Pepper Conference，December8-11，1996：55-56.

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>华中农业大学

<120>辣椒抗根结线虫基因的克隆及其应用

<130>

<141>2005-10-14

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>5447

<212>DNA

<213>辣椒(Capsicum annuum)

<220>

<221>Intron

<222>(64)..(1245)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(5426)..(5447)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(1)..(5447)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(1767)..(1937)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(2801)..(2989)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(21)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1269)..(1312)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1628)..(5336)

<223>

<220>

<221>IntrOn

<222>(1313)..(1627)

<223>

<400>1

<210>2

<211>1251

<212>PRT

<213>辣椒(Capsicum annuum)

<400>2

Claims (7)

1.分离克隆的来源于辣椒基因组的具有抗根结线虫功能的基因Me的DNA片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的基因Me的DNA片段，其特征在于，序列表SEQ ID NO：1所述的1628-5336位核苷酸序列为该基因的编码区。

3.一种植物表达载体pBAMe，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC-M205110。

4.根据权利要求1所述的基因Me的DNA片段，其特征在于，克隆所述基因的简并引物的DNA序列如下：

NBS-F1：5’-TG(G/C)(G/C)(G/A)GG(T/A/C)(T/A)(T/C)(G/A)GG(T/C/G)AAACTAC-3’；

NBS R2：5’-(T/A/C)(G/A)C(T/A)A(A/G)AGG(A/G/C)A(A/G)CCCT(T/C)(T/G/C)ACA 3’。

5.分离克隆来源于辣椒基因组的具有抗根结线虫功能的基因Me的DNA片段的方法，其特征在于：

1)利用PCR从辣椒基因组中获得抗根结线虫基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；

2)步骤1)中PCR所用的高保真pfu酶与普通Taq酶按份数比为1∶2；

3)构建植物表达载体pBAMe，其保藏号为CCTCC-M205110；

4)利用农杆菌介导的方法将步骤3)的表达载体转入对根结线虫敏感的番茄植物，获得转化植株；

5)通过分子鉴定及接种鉴定，获得抗根结线虫的转基因植株。

6.权利要求1-2任一项所述的基因序列在培育抗根结线虫转基因番茄植物中的应用。

7.权利要求3所述的植物表达载体pBAMe在培育抗根结线虫转基因番茄植物中的应用。

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