CN103026966B

CN103026966B - 一种利用离体叶片鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法

Info

Publication number: CN103026966B
Application number: CN2012105467548A
Authority: CN
Inventors: 金凤媚; 薛琳; 薛俊; 杨迎霞; 吉立柱; 郝志愚
Original assignee: TIANJIN CITY AGRICULTURAL BIO-TECH RESEARCH CENTER
Current assignee: Beijing Institute of science and Technology Co Ltd AgroSciences seedlings
Priority date: 2012-12-17
Filing date: 2012-12-17
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2032-12-17
Also published as: CN103026966A

Abstract

本发明公开了一种利用离体叶片鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，包括侵染性克隆菌液的培养，菌液的收集，叶片处理离体叶片接种等步骤。本发明主要利用天津地区TYLCV的侵染性克隆，通过离体叶片接种番茄黄化曲叶病毒，鉴定不同番茄材料对该病毒的抗性。此方法无需饲养烟粉虱、操作简单、效率高、重复性好、可控性好，能提供相对一致的接种压力，结果准确，是一种简便有效的接种鉴定方法。通过该方法能科学高效准确地鉴定出番茄对TYLCV的抗性。

Description

一种利用离体叶片鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，涉及一种快速、简捷、高效的番茄黄化曲叶病毒抗性鉴定方法。

背景技术

目前鉴定番茄黄化曲叶病抗性的方法有烟粉虱传毒、嫁接接种和机械传毒等。嫁接法以嫩病叶做接穗，采用腹接法接种到健康番茄上，其优点是能够为待鉴定植株提供高含量的TYLCV病毒，但该方法耗时耗力，只适于少量鉴定。机械传播是在人工环境下把感染TYLCV的曼陀罗、心叶烟或潘那利番茄作为毒源，通过机械传播侵染健康番茄植株，成功率较低，且病毒从番茄传到番茄上成功的例子只有很少的报道，因此在接种中一般不用该方TYLCV病毒。在育种进程中最常用的接种方法是烟粉虱接种鉴定法，包括温室中烟粉虱接种、回型笼中烟粉虱接种、露地烟粉虱接种3种类型，但这个方法也有一些缺点：1. 虫口密度不均一对抗性鉴定的影响。若虫口密度过大，一些抗病品种也会表现出感病来；若虫口密度太小，又区分不出抗感品种，目前对虫口密度的要求还没有一个标准。2.虫子逃逸引起病害的大面积发生。烟粉虱的体长一般为1-2mm，它可随着调查人员的进出而逃逸出来，从而给周围番茄产区带来灾害。3.受季节限制。烟粉虱的最佳活动温度是26-28℃，低于15℃虫子基本不活动，也就不能传毒，这就会延缓接种鉴定的进程。

农杆菌接种法是近年来发展起来的一种病毒抗性鉴定方法。利用TYLCV-DNA侵染性克隆，通过根癌农杆菌侵染待鉴定植株，病毒DNA可在植物体内形成、复制、运输并诱发症状。侵染性克隆技术首先在噬菌体病毒Qβ、脊髓灰质炎病毒（poliovirus）中获得成功，植物病毒侵染性克隆由Ahlquist 等（1984）在雀麦花叶病毒（Brome mosaic virus，BMV）首次报道，至今国内外已有大量的植物病毒被成功地构建出全长cDNA 侵染性克隆，并证明通过农杆菌注射能诱导出病毒侵染症状（Zhang et al.,2010,2009；Jin et al.，2011）。但该方法在注射接种后需放置在有防虫设施的防虫网内，且发病周期较长要一个月左右才能表现出症状。

因此，鉴于以上TYLCV接种方法的不足之处，在番茄抗病育种的生产上迫切需要一种快速方便的抗性鉴定方法，本研究利用离体叶片通过农杆菌侵染即可鉴定出番茄对TYLCV的抗性，本方法从而加快抗病育种进程，对推进蔬菜产业可持续发展具有重要意义。

发明内容

针对传统技术不能准确地对TYLCV抗性进行鉴定的问题，本发明人进行了大量的研究工作，利用天津地区TYLCV的侵染性克隆，通过离体叶片接种番茄黄化曲叶病毒，鉴定不同番茄材料对该病毒的抗性。此方法无需饲养烟粉虱、操作简单、效率高、重复性好、可控性好，能提供相对一致的接种压力，结果准确，是一种简便有效的接种鉴定方法。本发明旨在提供一种简便的接种鉴定方法，通过该方法能科学高效准确地鉴定出番茄对TYLCV的抗性。

为实现上述目的本发明公开了如下的技术内容：

一种利用离体叶片鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，按如下的步骤进行：

（1）侵染性克隆菌液的培养：将含有病毒DNA-A侵染性克隆的农杆菌LBA4404接种在含50 ug/mL Kan和50 ug/mL Rif的YEB液体培养基中，28℃，200 rpm振荡培养48 h；

（2）菌液的收集：用5000rpm离心机离心收集菌体，用液体MS培养基重新悬浮菌体，调OD600值为0.5；其中MS培养基配方如下：

Figure 2012105467548100002DEST_PATH_IMAGE001

含100uM乙酰丁香酮；

（3）叶片处理：取5-6片苗龄的番茄叶片，在无菌操作台上用75%（V/V）的酒精表面消毒30 s，再用0.1%升汞（升汞即氯化汞）消毒3.5 min，无菌水冲洗5~6次，将叶片剪成1cm×2 cm大小的叶片块；

（4）离体叶片接种：将剪好的长方形叶片块置于含有侵染性克隆的农杆菌LBA4404中浸泡20min后，接种到MS培养基含（100uM乙酰丁香酮）上，25℃共培养2 -3天，然后将叶片用灭菌水清洗3遍，再转移到含有浓度为500mg/l头孢霉素的MS固体培养基上，7天后进行观察和测量；所述的用灭菌水为内含有500mg/l头孢霉素的水。在MS培养基上根据需要还可以添加不同浓度的GA3（赤霉素）。

本发明中所涉及到的侵染性克隆农杆菌LBA4404为本单位所构建，见文献《 Asia Journal of Plant sciences》2012年 9月 “The Infectious Clone Construction of Tomato Yellow Leaf Curl Virus Isolate from Tianjin”。侵染性克隆农杆菌LBA4404的具体性状、生化特性如下：

1.含有TYLCV的全长序列和双向启动子的560bp的重复序列。

2.该侵染性克隆能在50 ug/mL利福平（Rif）和50 ug/mL卡那霉素（Kan）的YEB培养基中，28℃，培养48 h长出单菌落。

本发明更加详细的步骤如下：

1 材料和方法

1.1材料

毒源：含TYLCV侵染性克隆（由天津市农业生物技术研究中心构建，菌株在超低温冰箱中保存，若公众需要可在本单位获得，该菌株可以存活20年）。

番茄材料：

6036：CLN2545A（自亚洲蔬菜研究发展中心，含TY1）；6019：MC1即自1998年从杂交种Heatwave II Hybrid（市售的一种杂交种）经过多代选择选育出来的自交系。每代选择农艺性状好的单株如果圆，大果，株形紧凑。

1. 2 方法

1.2.1侵染性克隆菌液的培养

将含有病毒DNA-A侵染性克隆的农杆菌LBA4404（天津市农业生物技术研究中心构建）接种在含Kan（50 ug/mL）和Rif（50 ug/mL）的YEB液体培养基中，28℃，200 rpm振荡培养48 h。

1.2.2菌液的收集

用离心机离心收集（5000rpm）菌体，用液体MS培养基（含100uM乙酰丁香酮）重新悬浮菌体，调OD600值为0.5；其中MS培养基配方如下：

1.2.3叶片处理

取5-6片苗龄的番茄叶片，在无菌操作台上用75%的酒精表面消毒30 s，再用0.1%升汞消毒3.5 min，无菌水冲洗5~6次。将叶片剪成1cm×2 cm大小的叶片块。

1.2.4离体叶片接种

将剪好的长方形叶片块置于含有侵染性克隆的农杆菌LBA4404中浸泡20min后，接种到MS（含100uM乙酰丁香酮）培养基上，25℃共培养2天。2天后将叶片用灭菌水（含有500mg/l头孢霉素）清洗3遍后转移到含有浓度为500mg/l头孢霉素的MS固体培养基上。7天后进行观察和测量。为了促进叶片的伸长，在MS培养基上添加了不同浓度（0；0.4%；0.6%）的GA3（赤霉素）。

2结果

经含有TYLCV的侵染性农杆菌LBA4404处理后，生长7天测量叶片的伸长，在抗病品系中叶片伸长较多，在感病品系中未见伸长（如图1）。对供试叶片伸长部份进行测量，结果在三个处理中（GA3浓度分别为0、0.4%、0.6%）6036均有伸长而6019未见伸长，且不加激素的处理亦可诱导叶片伸长，生长量比加激素处理的大（表2）。

表2 叶片伸长统计

	6019(cm)	6036(cm)
			MS	0.01	0.4
MS+0.4%GA3	0.02	0.2
			MS+0.6%GA3	0.02	0.2

本发明公开的利用离体叶片鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）本发明公开的鉴定方法与其它的TYLCV抗性鉴定方法不同，该方法只有到离体叶片而不需要整个植株，对所鉴定的植株没有破坏。

（2）该方法只需在实验室即可完成且所需的时间短，其它方法需1个月左右的时间而该方法只需约10天即可。

（3）该方法可准确地区分出番茄对TYLCV的抗感性。

（4）在番茄抗TYLCV的育种中，利用该方法可鉴定出杂交后代的抗感性，从而有效地节省时间和人力。

附图说明：

图1为经侵染后不同品系叶片伸长情况图；其中：A、B、C均为含有抗病基因的品系6036；D、E、F均为无抗病基因的品系6019； A、D为不加激素的处理；B、E为加0.4%GA3处理；C、F为加0.6%GA3处理；箭头所示为伸长情况。

具体实施方式：

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内。

毒源：含TYLCV侵染性克隆。

番茄材料：

6036：CLN2545A（来自亚洲蔬菜研究发展中心，含TY1）；6019：MC1即自1998年从杂交种Heatwave II Hybrid（市售）经过多代选择选育出来的自交系（常规方法）。每代选择农艺性状好的单株如果圆，大果，株形紧凑。本发明所述的各种试剂除特别说明以外，其他均有市售。

实施例1

一种利用离体叶片鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法：

（2）菌液的收集：用5000rpm离心机离心收集菌体，用液体MS培养基重新悬浮菌体，调OD600值为0.5；

所述的液体MS培养基成分如下：

Figure 2012105467548100002DEST_PATH_IMAGE003

含100uM乙酰丁香酮；

（3）叶片处理：取5片苗龄的番茄叶片，在无菌操作台上用75%（V/V）的酒精表面消毒30 s，再用0.1%升汞消毒3.5 min，无菌水冲洗5次，将叶片剪成1cm×2 cm大小的叶片块；

（4）离体叶片接种：将剪好的长方形叶片块置于含有侵染性克隆的农杆菌LBA4404中浸泡20min后，接种到MS（含100uM乙酰丁香酮）培养基上，25℃共培养2天，然后将叶片用含有500mg/L头孢霉素灭菌水清洗3遍，再转移到含有浓度为500mg/l头孢霉素的MS固体培养基上，7天后进行观察和测量；结果6036伸长了约0.4cm，而6019未见伸长。

实施例2

利用离体叶片鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法：

所述的液体MS培养基成分如下：

含100uM乙酰丁香酮；

（3）叶片处理：取6片苗龄的番茄叶片，在无菌操作台上用75%（V/V）的酒精表面消毒30 s，再用0.1%（W/V）升汞消毒3.5 min，无菌水冲洗6次，将叶片剪成1cm×2 cm大小的叶片块；

（4）离体叶片接种：将剪好的长方形叶片块置于含有侵染性克隆的农杆菌LBA4404中浸泡20min后，接种到MS培养基（含100uM乙酰丁香酮）上，25℃共培养3天，然后将叶片用内含有500mg/l头孢霉素灭菌水清洗3遍，再转移到含有浓度为500mg/l头孢霉素的MS固体培养基上（GA3浓度为0.6%），7天后进行观察和测量，测定的结果显示抗病品种伸长0.4cm，感病品种未见伸长。

实施例3

实际应用：

1材料： 2009年春以CLN2545A（来自亚洲蔬菜研究发展中心，含TY1）为父本，浙粉202（市售）自交5代后的品系为母本进行杂交得F1代，2010年春进行自交得F2代。

2.方法

2.1育苗

将F2代番茄种子播于育苗盘中每穴2粒，常规管理，待到5片真叶时进行离体接种。

2.2 菌体培养

取含有侵染性克隆的农杆菌LBA4404（天津市农业生物技术研究中心构建），用接种针接种于含有Kan（50 ug/mL）和Rif（50 ug/mL）YEB固体培养基上培养，2天后挑取单菌落于含有Kan（50 ug/mL）和Rif（50 ug/mL）的YEB液体培养基中，28℃，200 rpm振荡培养48 h。

2.3接种

2.3.1菌体收集

用离心机离心收集（5000rpm）菌体，用液体MS培养基（含100uM乙酰丁香酮）重新悬浮菌体，调OD值为0.5。

2.3.2叶片处理

2.3.3离体叶片接种

将剪好的长方形叶片块置于含有侵染性克隆的农杆菌中浸泡２0min后，接种到MS（含100uM乙酰丁香酮）培养基上，25℃共培养2天。2天后将叶片用灭菌水（含有500mg/l头孢霉素）清洗3遍后转移到含有浓度为500mg/l头孢霉素的MS固体培养基上。

2.4 症状观察

7天后对接种的叶片进行观察和测量。利用离体叶片接种法对我们配制的组合的F2代进行离体鉴定，共接种21个后长单株，其中有14株表现出叶片的伸长现象，7株未表现出伸长现象，基本符合单基因的遗传规律，证明这种方法能用于抗病育种的鉴定。

主要参考文献：

1.Ahlquist P, et al. MulticomponentRNA plant virus infection derived from cloned viral cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof Amercia, 1984, 81: 7066-7070.

2.Hui ZHANG et al. Molecular characterization and pathogenicity of tomato yellow leaf curl virus in China. Virus Genes ,2009, 39:249–255

3.Hui ZHANG et al. Molecular characterization and infectivity of Papaya leaf curl China virus infecting tomato in China. Zhejiang Univ-Sci B (Biomed & Biotechnol) 2010, 11(2):109-114

4.金凤媚，薛俊，郏艳红等。天津地区番茄黄化曲叶病毒DNA-A的克隆和序列分析。华北农学报，2011（20）：223-226。

5.Feng mei Jin et al. The Infectious Clone Construction of Tomato Yellow Leaf Curl Virus Isolate from Tianjin. Asian Journal of plant sciences. 2012,11(5):246-250。

Claims

1.一种利用离体叶片鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（2）菌液的收集：用5000rpm离心机离心收集菌体，用液体MS培养基重新悬浮菌体，调OD600值为0.5；其中所述的MS培养基配方如下：

Figure 2012105467548100001DEST_PATH_IMAGE001

含100uM乙酰丁香酮；

（3）叶片处理：取5-6片苗龄的番茄叶片，在无菌操作台上用75%V/V的酒精表面消毒30 s，再用0.1%升汞消毒3.5 min，无菌水冲洗5~6次，将叶片剪成1cm×2 cm大小的叶片块；

（4）离体叶片接种：将剪好的长方形叶片块置于含有侵染性克隆的农杆菌LBA4404中浸泡20min后，接种到含100uM乙酰丁香酮的MS培养基上，25℃共培养2-3天，然后将叶片用灭菌水清洗3遍，再转移到含有浓度为500mg/l头孢霉素的MS固体培养基上，7天后进行观察和测量；所述的灭菌水为内含有500mg/l头孢霉素的水。