CN102181473B - 一种植物根系相关功能基因研究模型的构建方法 - Google Patents
一种植物根系相关功能基因研究模型的构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种植物根系相关功能基因研究模型的构建方法，所述方法包括：将植物根系相关功能基因连接到转基因表达载体pRI101-AN上，得到含有目标基因的重组质粒转入到发根农杆菌K599中，侵染黄瓜萌发4天的活体苗的子叶下方0.2～0.5cm处，诱导形成转基因毛状不定根，待毛状不定根生长至长度为5～10cm时，在形成毛状根的部位以下剪掉主根，将形成的毛状不定根埋入土壤，继续生长1～2个月，即得所述植物根系相关功能基因的研究模型。本发明利用具有转基因毛状不定根的黄瓜植株，可以直接对黄瓜根相关功能的候选基因进行快速鉴定，无需获得转基因植株再进行鉴定，可以大大减少实验的程序，克服转基因再生效率低的缺陷，因此，可以大规模地进行根系相关的基因功能的快速分析。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种快速分析与根相关的功能和基因的前处理方法，即植物根系相关功能基因研究模型的构建方法。
(二)背景技术
黄瓜不仅是重要的果蔬两用的蔬菜作物，而且，黄瓜也是研究植物性别分化决定、研究植物维管生物学(包括木质部和韧皮部)、研究植物长距离信号传导等植物生理的模式植物(Huang Sanwen et al.The genome ofthe cucumber，Cucumis sativus L.，Nature Genetics，2009，41(12)：1275-1281)。
另一方面，根系对植物地上部的生长及生物学产量起到重要的作用，根系具有固定、吸收、合成和分泌的功能，与根系分泌行为密切相关的根际研究、化感作用、修复受污染土壤等已经成为日益活跃的研究领域(Kijne JW et al.Root lectins and rhizobia.Plant Physilogy，1997，115(3)：315-320)。
为了研究植物根系相关基因的功能，目前使用的方法有RNA干涉、增强子陷阱、激活标签等分析法，但所有这些方法都需要获得转基因植物才能进行基因功能的验证。虽然目前包括黄瓜在内的多数植物建立了农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法、电击法、注射法等转基因方法；但是，这些植物转基因方法存在技术效率低(转基因再生植株的频率低)、实验周期(需要花费大量的时间)、劳动强度大(需要大量的实验操作)等问题，因此还不能大规模地应用(章冰，卫志明.《植物遗传转化中存在的问题及对策》.2000，36(3)：245-251。何光源，杨广笑，刘勇.《植物基因工程》，清华大学出版社，2007年4月第1版，第203～204页)。
发根农杆菌侵染植物细胞，其Ri质粒中的T-DNA插入和整合到植物基因组中并表达，诱导植物细胞形成毛状不定根。这种毛状不定根在形态上保持了植物原根系统的特征，在生理上具有原根系统完整的代谢通路；这种毛状不定根起源于单细胞而不存在嵌合体，在遗传上具有高度的稳定性和一致性(Hu ZB，Du M.Hairy root and its application in plantgenetic engineering.J Integr Plant Biol，2006，48(2)：121-127。Guillon S，Tremouillaux-Guiller J，Pati P K，Rideau M，Gantet P.Hairy root research：recent scenario and exciting prospects.Curr Opin Plant Biol，2006，9(3)：341-346)。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种植物根系相关功能基因研究模型的构建方法，采用该方法能够快速分析与根相关的功能和基因。
本发明采用的技术方案是：
一种植物根系相关功能基因研究模型的构建方法，所述方法包括：
(1)将植物根系相关功能基因连接到转基因表达载体pRI101-AN上，得到含有目标基因的重组质粒；
(2)将含有目标基因的重组质粒转入到发根农杆菌K599中，以所得带有重组质粒的发根农杆菌K599侵染黄瓜萌发4天的活体苗的子叶下方0.2～0.5cm处，诱导形成转基因毛状不定根，待毛状不定根生长至长度为5～10cm时，在形成毛状根的部位以下剪掉主根，将形成的毛状不定根埋入土壤，继续生长1～2个月，所获得的生长旺盛的带有转基因不定根的植株，即为所述植物根系功能基因的研究模型，用于快速研究分析与根相关的植物生理和基因的功能。
所述植物根系相关功能基因为常规与植物根功能相关的基因和标志基因，如gfp基因，与根辐射形态相关基因SHORT-ROOT(简称SHR)，与产生根毛相关基因SCHIZORIZA(简称SCZ)，与根基本组织子细胞分裂相关基因SCARCROW(简称SCR)等。
具体的，所述方法如下：
(A)将含植物根系相关功能基因质粒与转基因表达载体pRI101-AN进行酶切后，用T4DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，在LB+Km 50mg/L固体培养基上筛选阳性克隆，挑取获得的单克隆，在LB+Km 50mg/L液体培养基上繁殖，提取质粒利用酶切进行鉴定，获得含有目标基因的重组质粒；LB+Km 50mg/L固体培养基是指添加Km 50mg/L的LB固体培养基；LB+Km 50mg/L液体培养基是指添加Km 50mg/L的LB液体培养基，以下表示方法类同；
(B)利用冻融法将含有目标基因的重组质粒转入发根农杆菌K599菌株，含重组质粒的发根农杆菌K599菌液在LB+Str50mg/L+Km 50mg/L固体培养基上划线，于28℃培养2天后转入LB+Str50mg/L+Km 50mg/L液体培养基，28℃、200r/min振荡培养至菌液OD600为0.5，离心取菌体，以MS+As 25mg/L液体培养基悬浮清洗2次，然后以MS+As 25mg/L液体培养基重悬，制成菌悬液；本发明中MS+As 25mg/L液体培养基是指添加As 25mg/L的1/4MS液体培养基；
(C)用带针的无菌注射器吸取菌悬液，用针尖刺穿生长4天的黄瓜幼苗的子叶节点下方0.2～0.5cm处，滴加10～20μL菌悬液到伤口中，将黄瓜幼苗于人工气候室中进行培养诱导形成转基因毛状不定根，保持湿度75％以上、温度20～25℃、12h/12h光照和黑暗交替、光强1200～2400Lux；待毛状不定根生长至长度为5～10cm时，在形成毛状根的部位以下剪掉主根，将形成的毛状不定根埋入土壤，继续生长1～2个月，即得所述植物根系相关功能基因的研究模型。
本发明利用具有转基因毛状不定根的黄瓜植株，可以直接对黄瓜与根相关的功能候选基因进行快速鉴定，无需获得转基因植株再进行鉴定，可以大大减少实验的程序，克服转基因再生效率低的缺陷，因此，可以大规模地进行根系相关基因功能的快速分析。
(四)附图说明
图1为质粒pRI101-AN-gfp经EcoR I和Sal I酶切鉴定图；M1：1Kb DNALadder标准分子标记量(生工公司)；M2：100bp DNA Ladder标准分子标记量(东盛公司)；1：质粒pRI101-AN被EcoR I和Sal I酶切；2：质粒pRI101-AN-gfp被EcoR I和Sal I酶切；3：质粒pGFP被EcoR I和SalI酶切。
图2为发根农杆菌侵染形成的转基因毛状不定根(A)、愈伤组织(B)、膨大组织(C)以及无发根农杆菌K599侵染的对照(D)。
图3为培养生长3d(A)、4d(B)和5d(C)的黄瓜幼苗照片。
图4A为光照(左边)和遮光(右边)的黄瓜苗，B为正常光照的植株诱导出不定根，C为遮光的黄瓜苗仅诱导出膨大的组织。
图5为发根农杆菌K599侵染黄瓜诱导形成的毛状根生长至5～10cm的照片。
图6为剪掉主根的植株依靠转基因毛状根进行正常生长的照片。
图7为诱导出的不定根发出强烈的荧光。
图8为茎维管部位观察到发出荧光。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
一、实验材料
黄瓜品种中农8号购于中国农业科学院蔬菜花卉研究所；野生型发根农杆菌K599由本实验保存(the National Collection of Plant PathogenicBacteria in U.K.购买获取)；植物转基因表达载体pRI101-AN购买于TaKaRa公司，含有gfp基因的质粒pGFP购买于Clontech公司；其它试剂：草木灰、蛭石、1/4MS液体培养基、LB固体培养基、LB液体培养基、硫酸链霉素(Str)、卡那霉素(Km)、乙酰丁香酮(As)、无菌水。
器材：高压灭菌锅、塑料或陶土花盆(直径15cm)、无菌注射器(针管直径0.36mm)、人工气候室(温度20～25℃，12h/12h光照和黑暗交替，光强1200～2400Lux)、PCR扩增仪(PE公司9700型)、电泳仪和凝胶成像系统(Bio/Rad公司)。
二、实验方法
(一)、含gfp基因的质粒pRI101-AN-gfp的构建
1、保存在-80℃冰箱中含有pRIl01-AN(购买于TaKaRa公司)和pGFP(购买于Clontech公司)质粒的大肠杆菌DH5α分别在LB+Km 50mg/L和LB+Amp 100mg/L的固体培养基上划线繁殖，挑取单菌落，分别在LB+Km 50mg/L和LB+Amp 100mg/L液体培养基上繁殖，提取质粒。
2、pRI101-AN质粒经过EcoR I+Sal I双酶切，获得2个片段，提取纯化其中的大片段；同时，pGFP质粒经过EcoR I+Sal I双酶切，获得2个片段，提取纯化其中的小片段。
3、pRI101-AN质粒经过EcoR I+Sal I双酶切获得的大片段，与pGFP质粒经过EcoR I+Sal I双酶切获得的小片段，经过T4DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，在LB+Km 50mg/L上筛选阳性克隆。
4、挑取LB+Km 50mg/L上获得的单克隆，在LB+Km 50mg/L的液体培养基上繁殖，提取质粒，利用EcoR I+Sal I双酶切鉴定获得的单克隆是否为真正的重组质粒pRI101-AN-gfp。
(二)、黄瓜种子的萌发
1、预先准备无菌土，即：将草木灰和蛭石按1∶1的比例混合，加入1/4MS液体培养基(不含蔗糖)致湿润，并搅拌均匀，然后高温高压灭菌(121℃，20min)，分装于花盆中(直径15cm)。
2、取4℃保存的黄瓜中农8号种子放置在含有湿润滤纸的培养皿中，在25℃(人工培养箱)、黑暗条件下保持12～16h，以促进种子萌发。
3、取步骤2前处理过的黄瓜种子种植于无菌土的花盆中，然后放入人工气候室中，每天浇水1次、保持湿度在75％以上、温度20～25℃、2h/12h光照和黑暗交替、光强1200～2400Lux。
4、生长3d、4d、5d的黄瓜幼苗分别用于诱导转基因毛状不定根。
(三)、转基因毛状不定根的诱导和植株依靠转基因毛状根进行的生长
1、利用冻融法将质粒pRI101-AN-gfp转入发根农杆菌K599菌株，含质粒pRI101-AN-gfp发根农杆菌K599菌液在LB+Str50mg/L+Km 50mg/L固体培养基上划线，于28℃培养2天。
2、用灭菌的牙签挑取单菌落接种于20mL LB+Str 50mg/L+Km 50mg/L液体培养基中，于28℃、200r/min培养过夜。
3、按1∶50比例(V/V)转接菌液于20mL LB+Str50mg/L+Km 50mg/L液体培养基中，继续在28℃、200r/min振荡培养至OD600为0.5左右。
4、取1mL菌液于离心管中，4000r/min离心4min，弃上清，以MS+As 25mg/L液体培养基悬浮清洗2次，然后加入200μL MS+As 25mg/L液体培养基重悬，制成菌悬液。
5、用带针的无菌注射器吸取菌悬液，用针尖刺穿黄瓜幼苗的子叶节点下方0.2～0.5cm处，并且确保针尖穿过了胚轴中心。然后，滴加10～20μL(2滴)菌悬液到伤口中。
6、用无菌的注射器针尖刺穿黄瓜幼苗的子叶节点下方0.2～0.5cm处，滴加10～20μL(2滴)无菌蒸馏水作为对照。
7、将黄瓜幼苗培养于人工气候室中，保持湿度75％以上、温度20～25℃、12h/12h光照和黑暗交替、光强1200～2400Lux。部分黄瓜幼苗进行遮光培养，其他条件不变。
8、培养3～4周后，在滴加菌液处会形成1～2cm的不定根，继续培养2～3天，不定根可生长至5～10cm，这个长度足以支撑植物生长。此时，在形成毛状根的部位以下剪掉主根，将形成毛状根埋入土壤，继续生长2～3个月。
9、生长期间，每天用无菌水浇灌植物1次，保持湿润；并且每隔4周每盆添加1次100mL 1/4MS培养基的大量元素和微量元素。
(四)、转基因毛状不定根的分子鉴定
取生长旺盛的毛状不定根，按照常规方法提取基因组DNA。根据rolB基因序列(GenBank登记号EF433766.1)，设计扩增Ri质粒rolB基因(rolB基因是发根农杆菌转化植物的决定因子，rolB基因表达引起转基因植物形成大量毛状根)的引物rolB-P1：5′-GCCAGCATTTTTGGTGAACT-3′，rolB-P2：5′-CTGGCCCATCGTTCTAAAAA-3′；根据gfp基因序列(GenBank登记号：U17997)序列设计扩增gfp基因引物，GFP-P1：5′-GTCAGTGGAGAGGGTGAAGG-3′，GFP-P2：5′-AAAGGGCAGATTGTGTGGAC-3′。以提取的DNA作为模板，加入反应体系，进行PCR。
PCR反应体系组成：每35μL体积中含有ddH2O 22.5μL，10×Buffer(含15mmol/L Mg2+)3.5μL，dNTP(2mmol/L)2μL，2个引物各2μL，DNA模板2μL，Taq polymerase(2u/μL)1μL。
PCR反应程序为：94℃5min变性后，按94℃45s、55℃45s、72℃90s的设置进行30个循环，反应结束后在72℃下延伸10min，最后在4℃保存备用。
扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳1.5h(5V/cm)，溴化乙锭(EtBr)染色，用美国Bio/Rad凝胶成像系统观察并拍照记录。
(五)、转基因毛状不定根中gfp基因的表达分析及转基因毛状不定根合成的GFP蛋白通过维管系统运输的鉴定
用ZEISS显微镜(型号：Axio imager)，在蓝色激发光下(滤光片FITC)对诱导出的不定根直接进行荧光检测。用徒手切片法制备茎的切片，再在蓝色激发光下(滤光片FITC)对切片进行荧光检测。用ZEISS显微镜配套的数码成像系统拍照记录。
三、实验结果：
(一)、含gfp基因的质粒pRI101-AN-gfp的构建
pRI101-AN质粒经过EcoR I+Sal I双酶切，获得2个片段，提取纯化其中的大片段；同时，pGFP质粒经过EcoR I+Sal I双酶切，获得2个片段，提取纯化其中的小片段。pRI101-AN质粒经过EcoR I+Sal I双酶切获得的大片段，与pGFP质粒经过EcoR I+Sal I双酶切获得的小片段，经过T4DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，在LB+Km 50mg/L上筛选阳性克隆。利用EcoR I+Sal I双酶切鉴定，表明获得的单克隆是为重组质粒pRI101-AN-gfp(图1)。
(三)、转基因毛状不定根的诱导、鉴定和植株依靠转基因毛状根进行的生长
1、转基因毛状不定根的诱导
用发根农杆菌K599侵染黄瓜子叶节点下方0.2～0.5cm处，在伤口部位可出现3种不同的状态：(1)形成毛状的不定根；(2)形成愈伤组织；(3)形成膨大的组织。而仅用针尖刺伤的黄瓜幼苗滴加无菌蒸馏水的伤口会在生长过程中逐渐愈合，形成较小的膨大组织，刺伤部位颜色较其他部位较深，不同于发根农杆菌侵染形成的3种形态(图2)。
2、转基因毛状不定根的鉴定
利用rolB基因的引物rolB-P1：5′-GCCAGCATTTTTGGTGAACT-3′，rolB-P2：5′-CTGGCCCATCGTTCTAAAAA-3′；和gfp基因引物：GFP-P1：5′-GTCAGTGGAGAGGGTGAAGG-3′，GFP-P2：5′-AAAGGGCAGATTGTGTGGAC-3′对毛状不定根扩增出预期的大小分别约450bp和538bp的DNA片段。而对普通黄瓜植株的根以及叶片均没有扩增加出任何条带，表明获得的毛状不定根为转基因不定根。
3、黄瓜幼苗生长状态对诱导转基因不定根的影响
生长3d、4d、5d的黄瓜幼苗分别用于诱导转基因不定根(图3)，结果显示：生长4d的幼苗诱导转基因不定根的频率最高，此时幼苗多处于子叶将要张开却未张开的状态。生长3d的幼苗太弱，此时针刺侵染，对其随后的植物生长不利，也不利于不定根的形成。生长5d的幼苗侵染效果不如4d的诱导效率高(表1)。
表1
3、光照对诱导转基因不定根的影响
考虑到根的生长不需要光照，所以该实验对部分黄瓜幼苗进行遮光培养。结果发现，遮光培养的黄瓜生长缓慢，植株矮小，在发根农杆菌侵染的部位大多形成膨大组织，不利于发根的诱导。而正常光照的植株生长速度较快，植株粗壮，有利于诱导形成不定根(图4)。当侵染部位形成1-2cm的毛状不定根时，将幼苗倾斜，使形成的毛状不定根接触土壤，则会有利于此处毛状不定根的生长，分析这可能是光照会抑制对毛状不定根的生长，也可能是土壤中丰富的营养有利于毛状不定根的生长。实验中还发现，当侵染部位形成的根被自身的叶片遮挡光照的，其生长速度相对在光照下要较快。
因此，在农杆菌侵染的初期，光照有利于毛状不定根的诱导；而一旦诱导形成毛状不定根后，则遮光有利于毛状不定根生长、光照不利于毛状不定根的生长。
4、植株依靠转基因毛状根进行的生长
发根农杆菌K599侵染后，黄瓜苗培养3～4周，在滴加菌液处会形成1～2cm的不定根，继续生长2～3天，根可生长至5～10cm(图5)。此时，在形成毛状根的部位以下剪掉主根，并将转基因毛状根埋入土壤，植株依靠转基因毛状根能完成正常的生长(图6)。
(五)、转基因毛状不定根中gfp基因的表达分析及转基因毛状不定根合成的GFP蛋白通过维管系统运输的鉴定
用ZEISS显微镜(型号：Axio imager)，在蓝色激发光下(滤光片FITC)对诱导出的不定根发出强烈的荧光(图7)。同时，依靠转基因毛状根进行生长的植株，其茎的维管部位也可以观察到发出荧光(图8)，表明转基因毛状不定根中gfp基因进行了高效表达，同时，根部表达合成的GFP通过植物的维管系统运输到了植株的地上部位，如茎。
利用本发明，将任何需要分析研究的、与根功能相关的基因替换上述pRI101-AN-gfp中的gfp基因，再按照上述程序过程，就可对相关的基因功能进行快速高效的分析，此处不再一一列举。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州师范大学
<120> 一种植物根系相关功能基因研究模型的构建方法
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<170> PatentIn version 3.4
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Claims (2)
1.一种植物根系相关功能基因研究模型的构建方法，所述方法包括：
(1)将植物根系相关功能基因连接到转基因表达载体pRI101-AN上，得到含有目标基因的重组质粒；
(2)将含有目标基因的重组质粒转入到发根农杆菌K599中，以所得带有重组质粒的发根农杆菌K599侵染黄瓜萌发4天的活体苗的子叶下方0.2～0.5cm处，诱导形成转基因毛状不定根，待毛状不定根生长至长度为5～10cm时，在形成毛状根的部位以下剪掉主根，将形成的毛状不定根埋入土壤，继续生长1～2个月，即得所述植物根系相关功能基因的研究模型。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：
(A)将含植物根系相关功能基因质粒与转基因表达载体pRI101-AN进行酶切后，用T4DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，在LB+Km 50mg/L固体培养基上筛选阳性克隆，挑取获得的单克隆，在LB+Km 50mg/L液体培养基上繁殖，提取质粒利用酶切进行鉴定，获得含有目标基因的重组质粒；
(B)利用冻融法将含有目标基因的重组质粒转入发根农杆菌K599菌株，含重组质粒的发根农杆菌K599菌液在LB+Str 50mg/L+Km50mg/L固体培养基上划线，于28℃培养2天后转入LB+Str50mg/L+Km 50mg/L液体培养基，28℃、200r/min振荡培养至菌液OD600为0.5，离心取菌体，以MS+As 25mg/L液体培养基悬浮清洗2次，然后以MS+As 25mg/L液体培养基重悬，制成菌悬液；
(C)用带针的无菌注射器吸取菌悬液，用针尖刺穿生长4天的黄瓜幼苗的子叶节点下方0.2～0.5cm处，滴加10～20μL菌悬液到伤口中，将黄瓜幼苗于人工气候室中进行培养诱导形成转基因毛状不定根，保持湿度75％以上、温度20～25℃、12h/12h光照和黑暗交替、光强1200～2400Lux；待毛状不定根生长至长度为5～10cm时，在形成毛状根的部位以下剪掉主根，将形成的毛状不定根埋入土壤，继续生长1～2个月，即得所述植物根系相关功能基因的研究模型。
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