CN109679993B - 一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法，涉及植物基因工程技术领域，本发明所述方法首先构建带有目的基因的发根农杆菌，并使植物的无菌苗生根后进行栽种，当栽种后的无菌苗的茎长距根部超过3cm时，将带有目的基因的发根农杆菌的菌液注射至所述植物无菌苗的茎内；待茎部注射处生长出植物的转基因毛状根后，培养至转基因毛状根长度超3cm且根数多10根时，去除其非毛状根，并将毛状根伸入土壤，得毛状根转基因植物。与常规植物转基因体系相比，本发明的方法可省去植物愈伤细胞再分化步骤，克服利用愈伤细胞进行遗传转化存在的周期长等问题。本发明所述方法所需设备简单、操作技术容易掌握，具有广阔的开发应用前景。

Description

一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法。
背景技术
发根农杆菌是一类宿主范围广泛的G-土壤杆菌。农杆菌在侵染植物后，能够诱导植物产生大量高度分支的不定根，通常称为发根。发根农杆菌侵染植物所产生的发根具有生长速度快、分化程度高、生理生化和遗传性稳定、易于进行操作控制等特点。
基因工程中发根农杆菌侵染形成转基因毛状根是一种快速高效的转基因方法。本研究以同一地域、同一年龄、长势一致的‘Gala’无菌苗为材料，通过农杆菌侵染建立了一种快速高效的苹果转基因体系。发根农杆菌是一种侵染性很强的根瘤菌科农杆菌属革兰氏阴性菌，在植物基因工程中具有广泛的应用，其携带的Ri质粒能有效侵染众多植物，Ri质粒的T-DNA片段在植物细胞基因组中插入、整合并表达，诱导植物细胞形成转基因毛状根(hairyroot)。由于发根农杆菌转化的毛状根起源于单细胞而不存在嵌合体，在遗传上具有高度的稳定性和一致性。并且，其不仅在形态上植物原根系统的特征得以保存，而且在生理上能够持续合成次生代谢产物，具有原根系统完整的代谢通路。因此，毛状根可作为生物反应器来生产和研究植物的次生代谢物质以及基因的验证。
常规的农杆菌介导转基因主要是利用根癌农杆菌，但是这种转基因植物的构建方法需要大量的时间进行愈伤组织诱导和分化、继代，获得转基因植物的周期较长。
中国专利CN102010877B公开了一种发根农杆菌K599介导的菊花转基因方法，以发根农杆菌K599菌液侵染菊花叶片伤口处或叶腋处，直接利用活体植物材料作为受体来诱导不定根，不定根再诱导愈伤组织，分化培养得到完整植株。该方法能够克服假阳性不定根的出现，得到不定根后的诱导愈伤组织以及分化过程无需再使用抗生素杀菌，提高了转基因再生的效率。
中国专利CN101121942B公开了一种以发根农杆菌介导的玉米遗传转化新方法，其通过发根农杆菌侵染玉米组织，诱导产生毛状根，所得毛状根经分化培养再生，得到转基因植株。该方法的毛状根转化率较高，再生植株移栽成活率高，所得植物表现为根系发达、抗旱性强，可用于生产玉米转基因抗旱植物。
可以看出，现有技术主要是利用发根农杆菌介导得到毛状根，再将毛状根进行诱导分化等，形成新的转基因植株，这些方法获得转基因植株的方法仍然需要进行愈伤组织培养、分化培养、生根培养等步骤，周期较长。
发明内容
本发明为了克服现有转基因植物获得周期较长的缺陷，提供了一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法，本发明直接向活植物注射带有目的基因的发根农杆菌，在获得毛状根后本发明直接将植物原有根系去除，快速建立植物的转基因体系。与常规的植物转基因体系相比，本发明所述方法可省去愈伤细胞再分化的步骤，有效缩短转基因植物的构建周期。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法，包括以下步骤：
(1)将携带有目的基因的表达载体转化到发根农杆菌中，得到带有目的基因的发根农杆菌；
(2)将植物的无菌苗接种在生根培养基上，培养得到生根的植物无菌苗，栽植；
(3)当植物无菌苗的茎长距根部超过3cm时，将带有目的基因的发根农杆菌的菌液注射至所述植物无菌苗的茎内；
所述注射的位置为植物无菌苗的茎距根部0.5～3cm处；
(4)待茎部注射处生长出植物的转基因毛状根后，培养至转基因毛状根长度超过3cm且根数多于10根时，去除其非毛状根，并将毛状根伸入土壤，得到毛状根转基因植物；
所述步骤(1)和(2)之间无顺序上的限定。
优选的，所述步骤(1)中，发根农杆菌的种类包括MSU440、C58C1或K599。
优选的，所述植物的种类包括木本植物。
优选的，所述木本植物包括苹果Gala、湖北海棠或山荆子。
优选的，所述步骤(2)中，生根培养基包括：每升MS液体培养基中含有0.2～1mgIBA、20～45g蔗糖和4～12g琼脂，pH值为5.6～5.9。
优选的，所述步骤(2)中，所述植物的无菌苗先在继代培养基中培养8～14d后，再接种于生根培养基中；
所述继代培养基包括：每升MS液体培养基中含有0.1～0.6IBA、0.1～0.5mg 6-BA、20～45g蔗糖和4～12g琼脂，pH值为5.6～5.9。
优选的，所述步骤(3)中，带有目的基因的发根农杆菌的菌液的OD600值为0.2～0.6。
优选的，所述步骤(3)中，所述带有目的基因的发根农杆菌的菌液的制备步骤包括：
S1、将转化后的发根农杆菌接入液体培养基中，26～30℃振荡培养10～16h，得到培养液；
所述液体培养基包括：每升YEP培养基中含有15～25mg利福平和40～60mg卡钠霉素；
S2、将培养液接入液体培养基中，培养至菌液浓度OD600＝0.2～0.6后，离心，取沉淀用MES缓冲液重悬，静置，得到用于注射的带有目的基因的发根农杆菌液。
优选的，所述步骤(3)中，所述注射的位置为植物无菌苗的茎距根部1～2cm处。
优选的，所述步骤(4)中，注射后的2～3天后在相同位置进行一次再注射。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供了一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法，构建带有目的基因的发根农杆菌，使植物的无菌苗生根后进行栽种，当栽种后的无菌苗的茎长距根部超过3cm时，将带有目的基因的发根农杆菌的菌液注射至所述植物无菌苗的茎内；待茎部注射处生长出植物的转基因毛状根后，培养至转基因毛状根长度超过3cm且根数多于10根时，去除其他非转基因毛状根，并将毛状根伸入土壤，得到毛状根转基因植物。与常规植物转基因体系相比，本发明所述方法可省去植物愈伤细胞再分化的步骤，克服了利用愈伤细胞进行遗传转化存在的周期长等问题。本发明利用发根农杆菌可诱导出植物毛状根的特点，基于毛状根中具有完整的代谢通路，为研究植物代谢产物和通路提供了一条快速高效的新途径。本发明所述方法所需设备简单、操作技术容易掌握，具有广阔的开发应用前景。
附图说明
图1为实施例1中继代培养得到的苹果Gala无菌苗；
图2为实施例1中生根培养基培养得到的苹果Gala生根无菌苗；
图3为实施例1中诱导出毛状根的转eGFP基因的苹果Gala；
图4为实施例1中构建的转eGFP基因的苹果毛状根基因检测图；其中，a为凝胶电泳图，b为Western Blot图；
其中，L1，L2为苹果Gala转eGFP基因的毛状根。
具体实施方式
本发明提供了一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法，包括以下步骤：
(1)将携带有目的基因的表达载体转化到发根农杆菌中，得到带有目的基因的发根农杆菌；
(2)将植物的无菌苗接种在生根培养基上，培养得到生根的植物无菌苗，栽植；
(3)当植物无菌苗的茎长距根部超过3cm时，将带有目的基因的发根农杆菌的菌液注射至所述植物无菌苗的茎内；
所述注射的位置为植物无菌苗的茎距根部0.5～3cm处；
(4)待茎部注射处生长出植物的转基因毛状根后，培养至转基因毛状根长度超过3cm且根数多于10根(毛状根强壮)时，去除其他非转基因毛状根，并将毛状根伸入土壤，得到毛状根转基因植物；
所述步骤(1)和(2)之间无顺序上的限定。
本发明将携带有目的基因的表达载体转化到发根农杆菌中，得到带有目的基因的发根农杆菌。本发明提供的是一种转基因植物的构建方法，对于具体的目的基因和其适宜的表达载体无特殊限定。在本发明的实施例中，作为举例说明的以eGFP基因作为目的基因，构建了eGFP-pROK2载体转化至发根农杆菌中。本发明对表达载体转化发根农杆菌的方法无特殊限定，采用本领域已知的方法即可，比如热激法。
在本发明中，所述发根农杆菌的种类包括但不限于MSU440、C58C1或K599；如本发明实施例所示，不同的发根农杆菌种类对于毛状根的诱导率有影响，根据不同植物可选择其适宜的发根农杆菌类型。
本发明将植物的无菌苗接种在生根培养基上，培养得到生根的植物无菌苗，栽植。本发明选择直接将植物的无菌苗培养生根，而不是诱导愈伤组织后转入目的基因，是为了缩短愈伤组织诱导分化时间，缩短转基因植物构建的周期。本发明对所述栽植的操作无特殊限定，采用本领域常规的无菌苗栽种方法即可。
在本发明中，所述植物的种类优选的包括木本植物。在本发明中，所述木本植物包括但不限于苹果Gala(Malus domastica(Gala))、湖北海棠(Malus hupehensis)或山荆子(Maluspallasiana)。
如本发明的具体实施方式所示，当植物的种类为苹果时，生根培养基优选的包括：每升MS液体培养基中含有0.2～1mg IBA、20～45g蔗糖和4～12g琼脂，pH值为5.6～5.9；更优选的包括：每升MS液体培养基中含有0.5mg IBA、30g蔗糖和4～12g琼脂，pH值为5.8。
在本发明中，所述生根培养基培养时，培养的温度优选为22～24℃，更优选为23℃。本发明对生根培养基的培养时间无特殊限定，能够获得生根的植物无菌苗即可。
在本发明中，所述植物的无菌苗优选的先在继代培养基中培养8～14d后，再接种于生根培养基中。如本发明的具体实施方式所示，当植物的种类为苹果时，所述继代培养基包括：每升MS液体培养基中含有0.1～0.6IBA、0.1～0.5mg 6-BA、20～45g蔗糖和4～12g琼脂，pH值为5.6～5.9；更优选的包括：每升MS液体培养基中含有0.3IBA、0.3mg 6-BA、30g蔗糖和8g琼脂，pH值为5.8。
在本发明中，所述继代培养基培养时，培养的温度优选为22～24℃，更优选为23℃；所述培养的时间优选为8～15d，更优选为10～12d。
栽植生根的植物无菌苗后，本发明当植物无菌苗的茎长距根部超过3cm时，将带有目的基因的发根农杆菌的菌液注射至所述植物无菌苗的茎内；所述注射的位置为植物无菌苗的茎距根部0.5～3cm处。本发明选择直接将带有目的基因的发根农杆菌的菌液在植物幼苗茎部注射，主要目的是为了以诱导的毛状根替代植物原有根系，从而直接获得转基因植物，缩短构建周期。
在本发明中，所述带有目的基因的发根农杆菌的菌液注射浓度优选为OD6000.2～0.6，更优选为OD6000.4。如本发明的具体实施例所示，注射的菌液浓度对于毛状根诱导率有一定影响，选择OD6000.4的浓度进行注射后，毛状根的诱导率更高。
在本发明中，所述带有目的基因的发根农杆菌的菌液菌液的制备步骤优选的包括：
S1、将转化后的发根农杆菌接入液体培养基中，26～30℃振荡培养10～16h，得到培养液；
所述液体培养基包括：每升YEP培养基中含有15～25mg利福平和40～60mg卡钠霉素；
S2、将培养液接入液体培养基中，培养至菌液浓度OD600＝0.2～0.6后，离心，取沉淀用MES缓冲液重悬，静置，得到用于注射的带有目的基因的发根农杆菌液。
在本发明中，所述液体培养基优选的包括：每升YEP培养基中含有20mg利福平和50mg卡钠霉素。
在本发明中，所述步骤S1中，振荡的频率优选为150～200rpm，更优选为180rpm。在本发明中，所述培养时间优选为12～14h。
在本发明中，所述步骤S2中，培养液的接种量优选为8～15％(v/v)，更优选为10％(v/v)。
在本发明中，所述离心的转速优选为7000～8500rpm，更优选为8000rpm。在本发明中，所述离心的时间优选为5～15min，更优选为10min。
在本发明中，所述MES缓冲液为：10mM/L MES-KOH(pH 5.2)+10mM/L MgCl2+200mM/L乙酰丁香酮。
在本发明中，所述注射的位置优选为植物无菌苗的茎距根部1～2cm处。如本发明的具体实施例所示，注射的位置高度不同对于毛状根诱导率有一定影响，选择上述注射位置的毛状根诱导率更高。
在本发明中，所述注射后的2～3天后在相同位置进行一次再注射。所述再注射时采用的菌液浓度、剂量均与第一次注射时相同。本发明进行再注射的目的是增强菌液的侵染效果。
注射完成后，本发明待茎部注射处生长出植物的转基因毛状根后，培养至转基因毛状根长度超过3cm且根数多于10根时，去除其他非转基因毛状根，并将毛状根伸入土壤，得到毛状根转基因植物。
按照本发明所述的构建方法可省去对愈伤组织进行分化诱导的时间，有效消除愈伤组织分化所带来的周期长等问题，更为方便简单，易于操作，适宜大规模推广。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1转eGFP基因苹果毛状根的诱导
(1)苹果无菌苗培养：苹果品种为Gala的无菌苗由北京林业大学林学院交叉创新平台提供，将无菌苗在MS+0.3mg/L IBA+0.3mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8继代培养基中22～24℃生长10天后(如图1所示)，转移至MS+0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8生根培养基，40天后得到生出根的苹果Gala无菌苗(如图2所示)。
(2)转基因侵染菌液制备：使用中美泰和公司的Seamless Assembly Cloning Kit构建35S-eGFP-pROK2载体。将构建好的载体用热激法转化发根农杆菌K599感受态细胞；挑取阳性克隆菌落，先以5ml YEP+20mg/L Rif+50mg/LKana液体培养基在28℃，180rpm的摇床中小摇过夜，再将5ml菌液加入50mlYEP+20mg/L Rif+50mg/L Kana液体培养基进行大摇，扩增至菌液浓度OD600＝0.4后，将菌液在室温下以8,000rpm离心10分钟，去上清，沉淀重悬于MES缓冲液(10mM/L MES-KOH(pH 5.2)+10mM/L MgCl2+200Μm/L乙酰丁香酮)，静置2～5小时制成转基因侵染菌液。
(3)侵染与共培养：将苹果Gala无菌苗移至土壤中，用注射器吸取0.2ml菌液，注射到苹果Gala苗根部以上1cm的茎里。3天后，以同样的菌液和方法注射在同一位置。22～24℃培养20天左右，茎部注射口处出现愈伤，大约40天左右，愈伤中生出苹果转基因毛状根。当毛状根生长到足够强壮(长度超过3cm且根数多于10根)时，剪断原始根，将毛状根伸入土壤(如图3所示)。
(4)转基因毛状根的检测：在RNA和蛋白两种水平上进行检测。取适量苹果毛状根，利用CTAB法提取毛状根RNA，以TIANGEN公司的反转录酶将苹果RNA反转为cDNA，设计引物：
eGFP-F(SEQ ID NO.1)：5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3’；
eGFP-R(SEQ ID NO.2)：5’-TTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’。
进行PCR检测，检测到苹果毛状根中存在eGFP基因；取适量苹果毛状根，提取粗蛋白，通过12％(w/v)SDA-PAGE分离蛋白质，并电泳转移至PVDF膜。
将PVDF膜在封闭溶液中封闭2小时，然后将第一抗体(抗GFP抗体)以1：5000稀释度与封闭溶液和TBST溶液混合，并与膜一起温育过夜。然后经TBST溶液进行5次冲洗。再以1：10,000的稀释比例将二抗与封闭溶液和TBST溶液混合，与膜一起温育2个小时，经TBST溶液进行5次冲洗后，在膜上加入发光液，使免疫反应条带可视化，检测到eGFP蛋白的条带(如图4所示)。
可以看出，利用本发明所述方法能够构建得到转基因的植物，相对于现有技术显著缩短了构建时间。
实施例2不同发根农杆菌对苹果Gala毛状根诱导的影响
表1不同发根农杆菌对苹果Gala毛状根诱导的影响
Figure BDA0001975977720000091
选择长势一致苹果Gala无菌苗，进行继代和生根。将3种发根农杆菌MSU440、C58C1和K599，用YEP+20mg/L Rif液体培养基在28℃，180rpm的摇床中扩增至OD600＝6.0，制成侵染菌液。按照实施例1所示的方法对经过继代生根的苹果Gala组培苗进行茎部注射，然后观察苹果Gala毛状根诱导状况。
如表1所示，采用不同的发根农杆菌对苹果Gala进行茎部注射，当用MSU440进行注射后，毛状根的诱导率为10％，用C58C1注射，毛状根诱导率为10％，用K599进行侵染注射时，毛状根诱导率达到20％。说明不同的发根农杆菌对毛状根的诱导效率会产生显著影响，因此，K599农杆菌对毛状根的诱导效果最好。
实施例3发根农杆菌的不同浓度对苹果Gala毛状根诱导的影响
表2不同浓度的发根农杆菌对苹果Gala毛状根诱导的影响
Figure BDA0001975977720000092
选择长势一致苹果Gala无菌苗，进行继代和生根。将三份发根农杆菌K599，用YEP+20mg/L Rif液体培养基在28℃，180rpm的摇床中分别扩增至OD600＝0.2，OD600＝0.4，OD600＝0.6制成侵染菌液。按照实施例1所示的方法对经过继代生根的苹果Gala组培苗进行茎部注射，在生出愈伤后的40天，观察苹果毛状根诱导状况。
如图表2所示，采用不同浓度的发根农杆菌对苹果进行茎部注射，当OD600＝0.4时，毛状根的诱导率最高，为20％，而OD600＝0.2和OD600＝0.6时诱导率仅为10％，说明不同浓度的发根农杆菌对毛状根的诱导效率会产生显著影响，因此，OD600＝0.4这一浓度对毛状根的诱导效果最好。
实施例4不同的注射位置对发根农杆菌诱导苹果Gala毛状根的影响
表3发根农杆菌的不同注射位置对苹果Gala毛状根诱导的影响
Figure BDA0001975977720000101
选择长势一致苹果Gala无菌苗，进行继代和生根。将继代生根的苹果无菌苗分为三份，除注射位置分别位于根上3cm、根上1cm和根上0.5cm的茎部外，其他操作均相同。在生出愈伤后的40天，观察苹果毛状根诱导状况。
由表3可知，发根农杆菌的注射位置不同，毛状根的诱导效果也不同。注射位置为根上3cm时和注射位置为根上0.5cm时，毛状根诱导率相同，均为14％，而注射位置为根上1cm时，毛状根诱导率最高，为20％，所以注射位置为根上1cm时是诱导苹果毛状根的最佳注射位置。
实施例5转eGFP基因湖北海棠毛状根的诱导
(1)无菌苗培养：取湖北海棠(Malus hupehensis)的无菌苗，将无菌苗在MS+0.3mg/L IBA+0.3mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8继代培养基中22～24℃生长10天后，转移至MS+0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8生根培养基，40天后得到生出根的湖北海棠(Malus hupehensis)无菌苗。
(2)转基因侵染菌液制备：使用中美泰和公司的Seamless Assembly Cloning Kit构建35S-eGFP-pROK2载体。将构建好的载体用热激法转化发根农杆菌K599感受态细胞；挑取阳性克隆菌落，先以5ml YEP+20mg/L Rif+50mg/LKana液体培养基在28℃，180rpm的摇床中小摇过夜，再将5ml菌液加入50mlYEP+20mg/L Rif+50mg/LKana液体培养基进行大摇，扩增至菌液浓度OD600＝0.4后，将菌液在室温下以8,000rpm离心10分钟，去上清，沉淀重悬于MES缓冲液(10mM/L MES-KOH(pH 5.2)+10mM/L MgCl2+200Μm/L乙酰丁香酮)，静置2～5小时制成转基因侵染菌液。
(3)侵染与共培养：将湖南海棠无菌苗移至土壤中，用注射器吸取0.2ml菌液，注射到湖南海棠苗根部以上1cm的茎里。3天后，以同样的菌液和方法注射在同一位置。22～24℃培养20天左右，茎部注射口处出现愈伤，大约40～48天，愈伤中生出湖南海棠转基因毛状根(毛状根诱导率12～20％)。当毛状根生长到足够强壮(长度超过3cm且根数多于10根)时，剪断原始根，将毛状根伸入土壤。
经RNA和蛋白两种水平上检测，上述方法构建的山荆子转基因植株中，毛状根存在eGFP。具体检测方法同实施例1。
实施例6转eGFP基因山荆子毛状根的诱导
(1)无菌苗培养：取山荆子(Maluspallasiana)的无菌苗，将无菌苗在MS+0.3mg/LIBA+0.3mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8继代培养基中22～24℃生长10天后，转移至MS+0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8生根培养基，40天后得到生出根的山荆子无菌苗。
(2)转基因侵染菌液制备：使用中美泰和公司的Seamless Assembly Cloning Kit构建35S-eGFP-pROK2载体。将构建好的载体用热激法转化发根农杆菌K599感受态细胞；挑取阳性克隆菌落，先以5ml YEP+20mg/L Rif+50mg/LKana液体培养基在28℃，180rpm的摇床中小摇过夜，再将5ml菌液加入50mlYEP+20mg/L Rif+50mg/LKana液体培养基进行大摇，扩增至菌液浓度OD600＝0.4后，将菌液在室温下以8,000rpm离心10分钟，去上清，沉淀重悬于MES缓冲液(10mM/L MES-KOH(pH 5.2)+10mM/LMgCl2+200mM/L乙酰丁香酮)，静置2～5小时制成转基因侵染菌液。
(3)侵染与共培养：将山荆子无菌苗移至土壤中，用注射器吸取0.2ml菌液，注射到山荆子苗根部以上1cm的茎里。3天后，以同样的菌液和方法注射在同一位置。22～24℃培养20天左右，茎部注射口处出现愈伤，大约35～50天，愈伤中生出山荆子转基因毛状根(毛状根诱导率11～19％)。当毛状根生长到足够强壮(长度超过3cm且根数多于10根)时，剪断原始根，将毛状根伸入土壤。
经RNA和蛋白两种水平上检测，上述方法构建的山荆子转基因植株中，毛状根存在eGFP。具体检测方法同实施例1。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京林业大学
<120> 一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggtgagca agggcgagga gc 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttacttgtac agctcgtcca 20

Claims (7)

1.一种发根农杆菌介导的转基因植物的构建方法，包括以下步骤：
(1)将携带有目的基因的表达载体转化到发根农杆菌中，得到带有目的基因的发根农杆菌，所述发根农杆菌的种类为MSU440、C58C1或K599；
(2)将植物的无菌苗接种在生根培养基上，培养得到生根的植物无菌苗，栽植，所述植物为苹果Gala、湖北海棠或山荆子；
(3)当植物无菌苗的茎长距根部超过3cm时，将带有目的基因的发根农杆菌的菌液注射至所述植物无菌苗的茎内；
所述注射的位置为植物无菌苗的茎距根部0.5～3cm处；
(4)待茎部注射处生长出植物的转基因毛状根后，培养至转基因毛状根长度超过3cm且根数多于10根时，去除其非毛状根，并将毛状根伸入土壤，得到毛状根转基因植物；
所述步骤(1)和(2)之间无顺序上的限定。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，生根培养基包括：每升MS液体培养基中含有0.2～1mg IBA、20～45g蔗糖和4～12g琼脂，pH值为5.6～5.9。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述植物的无菌苗先在继代培养基中培养8～14d后，再接种于生根培养基中；
所述继代培养基包括：每升MS液体培养基中含有0.1～0.6mg IBA、0.1～0.5mg 6-BA、20～45g蔗糖和4～12g琼脂，pH值为5.6～5.9。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，带有目的基因的发根农杆菌的菌液的OD600值为0.2～0.6。
5.根据权利要求1或4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述带有目的基因的发根农杆菌的菌液的制备步骤包括：
S1、将转化后的发根农杆菌接入液体培养基中，26～30℃振荡培养10～16h，得到培养液；
所述液体培养基包括：每升YEP培养基中含有15～25mg利福平和40～60mg卡那霉素；
S2、将培养液接入液体培养基中，培养至菌液浓度OD600＝0.2～0.6后，离心，取沉淀用MES缓冲液重悬，静置，得到用于注射的带有目的基因的发根农杆菌菌液。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述注射的位置为植物无菌苗的茎距根部1～2cm处。
7.根据权利要求1、4或6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，注射后的2～3天后在相同位置进行一次再注射。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111454986A (zh) * 2020-04-13 2020-07-28 南京农业大学 一种梨遗传转化方法
CN111690678B (zh) * 2020-05-20 2023-04-07 山东农业大学 一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法
CN112544440A (zh) * 2020-12-23 2021-03-26 江苏师范大学 块根植物的转基因或基因编辑新苗的培育方法
US11299700B1 (en) 2021-02-19 2022-04-12 Acequia Biotechnology, Llc Bioreactor containers and methods of growing hairy roots using the same
CN113122569B (zh) * 2021-04-26 2022-07-08 北京林业大学 一种杜仲转基因植株再生体系的构建方法
CN112931227B (zh) * 2021-04-26 2022-07-08 北京林业大学 一种杜仲各部位全株诱导植物再生及构建转基因植株再生体系的方法
CN113234750B (zh) * 2021-04-26 2023-04-11 北京林业大学 快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法
CN113322274B (zh) * 2021-06-24 2023-03-31 中国科学院华南植物园 一种快速实现甘薯转基因的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6518486B1 (en) * 1998-06-12 2003-02-11 University Of Guelph Enhanced storage organ production in plants
US7078589B2 (en) * 2003-05-02 2006-07-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Isolated nematode regulated gene promoter and use thereof
CN103194487A (zh) * 2013-04-19 2013-07-10 上海师范大学 一种利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法
CN104593409A (zh) * 2015-01-05 2015-05-06 北京农学院 一种基于发根农杆菌介导的板栗转基因方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59161306A (ja) * 1983-03-01 1984-09-12 Sumitomo Chem Co Ltd 植物の生長促進方法
CN102181473B (zh) * 2011-02-17 2013-01-23 杭州师范大学 一种植物根系相关功能基因研究模型的构建方法
CN104017822A (zh) * 2013-05-22 2014-09-03 东北林业大学 一种高效的木豆毛状根培养体系建立方法
CN104054549B (zh) * 2014-07-14 2016-01-20 西北农林科技大学 一种苹果品种烟富6号组培快繁的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6518486B1 (en) * 1998-06-12 2003-02-11 University Of Guelph Enhanced storage organ production in plants
US7078589B2 (en) * 2003-05-02 2006-07-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Isolated nematode regulated gene promoter and use thereof
CN103194487A (zh) * 2013-04-19 2013-07-10 上海师范大学 一种利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法
CN104593409A (zh) * 2015-01-05 2015-05-06 北京农学院 一种基于发根农杆菌介导的板栗转基因方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Development of an efficient root transgenic system for pigeon pea and its application to other important economically plants;Dong Meng等;《Plant Biotechnology》;20190327;第17卷(第9期);第1804-1813页 *
大豆发根转化方法的建立及GmFRD3在大豆耐铝性中的作用;陈安乐;《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》;20140916;D047-112 *

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