CN103194487A - 一种利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，是提高喜树碱新型药源植物短小蛇根草毛状根中喜树碱含量的方法。从长春花中克隆异胡豆苷合成酶和香叶醇-10-羟化酶基因的编码框序列，构建含上述基因的植物双价高效表达载体，以发根农杆菌介导法遗传转化短小蛇根草获得转CrSTR和CrG10H基因的短小蛇根草毛状根；利用植物激素诱导处理高产喜树碱株系，获得了喜树碱含量为4.703mg/g DW的高产毛状根。MTT检测证明，通过转基因方式获得的喜树碱粗提物具有良好的生物活性，肿瘤细胞杀伤力达35.9%。本发明为获取喜树碱提供了一种新型药源，也为生产具重要临床需求的抗癌药物喜树碱提供了一种新方法。

Description

一种利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是一种利用基因共转化策略获提高短小蛇根草毛状根中喜树碱含量的方法，为商业化生产抗癌药物喜树碱提供一种新型药源原料制备方法。

背景技术

喜树碱（Comptothecin,CPT）是一种喹啉类生物碱，是一类最初从喜树（Camptotheca acuminata）中提取出的天然抗癌药物，喜树碱类药物具有高效低毒和广谱抗癌等诸多优点，是目前最有效的天然抗癌药物之一，并且其抗癌机理非常独特，是迄今为止发现的唯一一种通过抑制拓扑异构酶Ⅰ发挥细胞毒性的天然植物活性成分，喜树碱及衍生物与紫杉醇、维生素甲类化合物抗肿瘤作用的发现被誉为“20世纪90年代抗癌药物的三大发现”。目前已有多种喜树碱衍生物类药物如依立替康（Irinotecan）和拓扑替康（Topotecan）获得了美国食品药物管理局（FDA）认证，在临床上被广泛用于治疗卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌以及白血病等多种恶性肿瘤，全球市场需求十分巨大。目前世界上喜树碱类药物的生产主要是从喜树等植株中提取，然而由于喜树天然资源数量有限，生长十分缓慢，喜树碱及其类似物在植物体内含量又非常低，且提取环节多、费时费力,所以从天然喜树中提取喜树碱的方法已远远不能满足人们对喜树碱日益增长的需求。人们十分渴望能寻找到产喜树碱的新资源，如生长快速的草本植物，来作为研究喜树碱生物合成及其分子调控机制的模式系统和生药替代来源。

短小蛇根草（Ophiorrhiza pumila）为茜草科蛇根草属植物，全草药用，性味苦寒，有清热解毒之功效，民间常用全草治疗外伤感染及肿毒等症。更重要的是，早在1976年人们就发现了这种草本植物能产生天然抗癌物质喜树碱及其衍生物（Tafur et al.,1976）。但令人遗憾的是，直到最近几年人们才开始意识到蛇根草属植物所具有的巨大药用价值和商业开发潜力。由于短小蛇根草作为一种产喜树碱的草本植物比木本植物喜树具有更多的研究优势如生长快周期短，易于遗传转化及植株再生等，所以，短小蛇根草是一种开展喜树碱生物合成的分子调控和代谢工程研究的优良材料。

多年来，国内外学者围绕着扩大喜树碱药源问题进行了诸多领域的研究如化学全合成，半合成及细胞培养等，并取得了一定的进展。喜树碱的化学全合成虽然已经成功，但因成本太高、产量太低、周期太长且易造成环境污染等因素而限制了其商业化生产；半合成方法虽然是目前最有效的途径之一，但其前体的提取分离仍然依赖于天然资源的供应；细胞悬浮培养则存在喜树碱含量低微及稳定性较差等问题同样难以实现工业化生产(Hengel et al1992)。相比之下，利用基因工程技术将喜树碱生物合成途径中的关键酶基因导入产喜树碱的资源植物中，继而获得转基因的发根系或再生植株等，并进行大规模的培养是实现从根本上提高喜树碱含量的最佳途径之一(Lorence and Nessler2004，Lu et al2008)。

研究表明喜树碱生物合成途径中的两个前体物质色胺(tryptamine)和裂环马钱子苷(secologanin)分别由上游途径：莽草酸途径(Shikimate Pathway)/吲哚途径(Indole Pathway)和MEP(2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸)途径提供（Yamazaki etal2004、Carolis et al1994、唐中华et al2003）。在吲哚途径中分支酸(chorismate)在邻氨基苯甲酸合成酶(anthranilate synthase,AS)催化下形成邻氨基苯甲酸(anthranilate)。邻氨基苯甲酸再经多步反应得到色氨酸(tryptophan)，色氨酸在色氨酸脱羧酶(tryptophan decarbosylase,TDC)的催化作用下形成色胺。在MEP途径中的香叶醇-10-羟化酶(G10H)是关键限速酶，该酶催化香叶醇形成10-羟基香叶醇，再经多步反应形成下游产物——裂环马钱子苷；异胡豆苷合成酶(STR)是催化色胺和裂环马钱子苷合成吲哚类生物碱共同前体——异胡豆苷(Strictosidine)的关键酶。来自莽草酸途径的色胺和裂环马钱子苷在STR的催化下形成异胡豆苷，该步反应是整个萜类吲哚生物碱合成的中心反应。异胡豆苷在异胡豆苷β-D-糖苷酶(Strictosidine β-D-glucosidase，SGD)作用下转化成直夹竹桃啶苷(Strictosamide)后，再经过多步反应最终生成喜树碱。目前，由直夹竹桃啶苷到喜树碱的下游合成途径尚未明了，仅检测到个别中间产物如山松醇苷/短小蛇根草苷(3-S-Pumiloside)和脱氧山松醇苷(3-S-Deoxypumiloside)（关水et al2004、王磊et al2008）。采用基因工程手段将上述的两个关键酶基因STR和G10H来共同转化产喜树碱的植物短小蛇根草，将有可能打破喜树碱生物合成途径的瓶颈效应，获得高产喜树碱的短小蛇根草毛状根或者再生植株，为商业化生产喜树碱和羟基喜树碱提供新型优质药源。

发明内容

本发明的目的在于克服常规技术中的不足，提供一种有效提高产喜树碱的新型草本药源植物短小蛇根草毛状根中喜树碱含量的方法。

本发明利用已克隆的长春花CrSTR和CrG10H基因，构建含上述基因的植物双价高效表达载体，以发根农杆菌（如C58C1等）为介导，将CrSTR和CrG10H基因同时导入短小蛇根草茎段中并再生出毛状根；PCR和荧光定量PCR检测目的基因CrSTR和CrG10H的整合和表达情况，高效液相色谱测定短小蛇根草转基因毛状根中喜树碱含量。

技术方案为：一种用于提高喜树碱含量的重组载体，含有异胡豆苷合成酶基因CrSTR和香叶醇-10-羟化酶基因CrG10H。

关键酶基因CrSTR和G10H双基因共转化提高喜树碱含量的方法，包括如下具体步骤：

（1）将异胡豆苷合成酶基因（CrSTR基因，SEQ ID NO.1，GenBank:X53602.1）和香叶醇-10-羟化酶基因（CrG10H基因，SEQ ID NO.2，GenBank:AJ251269.1）插入植物表达载体，构建重组载体；

以长春花幼苗RNA为模板PCR获得CrSTR和CrG10H基因片段；

植物表达载体可选用pCAMBIA质粒或pBI质粒，尤其是pCAMBIAl304质粒；

（2）将步骤（1）所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；

发根农杆菌可选用发根农杆菌菌株C58C1、发根农杆菌菌株A4或发根农杆菌菌株L BA9402；

（3）利用所构建的含有重组载体的发根农杆菌菌株遗传转化短小蛇根草，优选为短小蛇根草茎段，获得毛状根；

（4）检测步骤（3）毛状根中的CrSTR和CrG10H基因，取筛选结果为阳性的转基因毛状根克隆；

（5）利用植物激素对获得的转基因毛状根进行诱导，使其喜树碱含量进一步提高。所述的植物激素为茉莉酸、脱落酸、水杨酸或二甲基亚砜。将步骤（4）筛选得到的毛状根液体培养35～45天后，用浓度为80～200μM水杨酸或二甲基亚砜诱导转基因毛状根3～7天，或者用浓度为80～200μM的茉莉酸或脱落酸诱导转基因毛状根7天。毛状根的液体培养液中，喜树碱含量有很大提高。

优选的，步骤（4）中的检测方法为PCR及Southern blotting检测；

PCR阳性的转基因毛状根克隆进行Southern blot检测，证明目的基因CrSTR和CrG10H已整合到短小蛇根草毛状根基因组中；

荧光定量PCR测定CrSTR和CrG10H在短小蛇根草转基因毛状根中的表达情况；高效液相色谱法测定短小蛇根草转基因毛状根中喜树碱含量，进一步筛选喜树碱和羟基喜树碱含量显著提高的短小蛇根草转基因毛状根株系。

所述的PCR检测中，分别在植物表达载体上启动插入基因（CrSTR，CrG10H）表达的组成型表达启动子CaMV35S的内部及插入基因的内部设计上游及下游特异性引物进行DNA的PCR扩增，紫外线下观察到目的条带的株系即为阳性转基因毛状根株系。

所述的荧光定量PCR检测CrSTR和CrG10H基因的表达情况，具体方法为：对经PCR鉴定为阳性的毛状根克隆进行总RNA的提取并反转成cDNA第一条链，分别设计插入目的基因及看家基因18S rRNA的引物，进行荧光定量PCR扩增，用相对定量法分析CrSTR和CrG10H基因的相对表达量。

本发明的双关键酶基因共转化策略提高短小蛇根草毛状根中喜树碱含量的方法，采用基因工程方法，将双关键酶基因（CrSTR，CrG10H）导入短小蛇根草茎段中，获得了高产喜树碱的短小蛇根草毛状根株系。并对共转CrSTR及CrG10H基因的高产喜树碱毛状根利用植物激素MJ，ABA，SA进行诱导，检测其中的喜树碱含量相比于对照组显著提高，是非转基因毛状根的4.5倍；野生型短小蛇根草根的6.9倍。用MTT法检测所获得的喜树碱的抗肿瘤活性，结果显示其对肿瘤细胞的杀伤力为35.9%。

本发明还提供了一种用于提高喜树碱含量的重组载体，含有异胡豆苷合成酶基因CrSTR和香叶醇-10-羟化酶基因CrG10H。

本发明将关键酶基因STR及G10H利用一些常规生物学实验方法如载体构建、遗传转化、分子检测、荧光定量PCR分析、激素诱导、喜树碱提取及含量测定等应用于本发明，建立了一种有效提高短小蛇根草毛状根中喜树碱含量的方法，筛选出喜树碱含量大幅度提高的转基因短小蛇根草发根系，为生产具重要临床需求的喜树碱提供了一种新型优质药源，为今后应用生物技术大量生产喜树碱及最终解决喜树碱的药源短缺问题提供一条新途径，也为短小蛇根草毛状根商业化生产奠定基础。

目前尚未发现与本发明主题所提及的双关键酶基因共转化策略提高短小蛇根草毛状根中喜树碱含量的相关报道。因此，本发明在为抗癌药物喜树碱提供一种新型药源原料制备方法方面及实际解决喜树碱药源紧缺性的问题上具有重要意义。

附图说明

图1为实施例2中，重组载体pCAMBIA1304++CrSTR+CrG10H示意图。

图2为实施例3中，发根农杆菌介导CrSTR、CrG10H基因遗传转化短小蛇根草获得毛状根的流程；A：短小蛇根草植株；B：预培养2d的短小蛇根草茎段；C：农杆菌侵染后，自愈伤组织长出毛状根；D：液体培养的短小蛇根草毛状根；E：剪下的毛状根在2周内增殖生长。

图3为实施例3中，转基因短小蛇根草毛状根PCR检测结果，其中，图A为SG克隆的CrSTR基因鉴定；图B为SG克隆的CrG10H基因鉴定；图C为SG克隆的rolC鉴定。M：DL2000标准分子量；PC：质粒作阳性对照；NC：非转基因作阴性对照；BC：水作空白对照。

图4为实施例4中，双转基因短小蛇根草毛状根的Real-time PCR分析相对基因表达量，其中，NC：阴性对照；SG：双转基因株系。

图5为实施例5中，各株系中喜树碱的平均含量。其中，SG Lines为双转基因株系，S Lines为单转CrSTR基因株系，G Lines为单转CrG10H基因株系，NC为非转基因毛状根，WT为野生型短小蛇根草。

图6为实施例6中，MJ、ABA、SA诱导后SG28毛状根中的喜树碱含量分析，其中，NC：非转基因的阴性对照；DMSO：MJ的溶剂对照；H2O：ABA的溶剂对照。

图7为实施例7中，转基因毛状根的喜树碱提取物对K562细胞的MTT检测分析，其中，Sample1：CPT浓度为71.7μg/ml的粗提液；Sample2：CPT浓度为16.013μg/ml的粗提液；CPT：浓度为100μg/ml的喜树碱标准品的甲醇溶液；5-FU：100μg/ml的5-氟尿嘧啶甲醇溶液。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细阐述本发明。应理解为：这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆（Sambrook等），或按照制造厂商所提供的试剂或试剂盒所附带的说明书建议的条件。

实施例1长春花CrSTR及CrG10H基因编码序列的获得

1.1．长春花总RNA的提取及cDNA第一链的合成

使用TIANGEN公司提供的RNA prep pure plant kit从长春花幼苗中提取总RNA（提取步骤参照试剂盒内的说明书）。用于提取总RNA的长春花幼苗的鲜重量为0.1g左右，在提取过程中样品中的DNA已用DNase工作液清除。将提取的RNA在分光光度计上测定相关的吸光值，计算所提取RNA的纯度及浓度。根据不同RNA样品的浓度通过计算后，分别以0.5μg RNA为起始量，用反转录酶XL(AMV)进行第一链cDNA的合成（操作步骤参照Promega公司提供的相关说明书）。

1.2．CrSTR和CrG10H编码序列特异引物的设计及目的基因片段的获得

根据从NCBI获得的所述CrSTR基因的编码序列（SEQ ID NO.1）和CrG10H基因的编码序列（SEQ ID NO.2）,分别设计扩增出完整编码框的上下游特异引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点（这可视选用的载体而定），以便构建植物表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank上登录的长春花CrSTR基因(SEQ ID NO.1)和CrG10H基因(SEQ IDNO.2)的编码序列完全一致。

实施例2含长春花CrSTR及CrG10H基因的植物表达载体的构建

2.1．中间载体pCAMBIAl304⁺的构建

以pBIl21和pCAMBIAl304为材料，构建植物表达载体pCAMBIAl304⁺。具体地，HindIII／EcoRI双酶切pBI121和pCAMBIAl304；回收pBIl21-GUS表达盒及pCAMBIAl304大片段；连接转化，挑取单克隆菌落抽提质粒酶切验证。结果表明，植物表达载体pCAMBIAl304⁺构建成功。

2.2．植物表达载体pCAMBIAl304⁺-CrG10H的构建

在上述构建成功的pCAMBIAl304⁺基础上，用从长春花中克隆到的CrG10H基因替换其上的GUS基因。具体地，BamHI／SacI双酶切pMD18T-CrG10H和pCAMBIAl304⁺；回收CrG10H基因和pCAMBIAl304⁺大片段；连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，CrG10H基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIAl304⁺中，从而获得含CrG10H基因的植物表达载体pCAMBIAl304⁺-CrG10H。

2.3．植物表达载体pCAMBIAl304⁺-CrSTR-CrG10H的构建

以上述的pCAMBIAl304⁺-CrG10H为基础，用从长春花中克隆的CrSTR基因替换pCAMBIAl304⁺-CrG10H上的GFP+GUS基因。具体地，BglII／BstEII双酶切pMD18T-CrSTR和pCAMBIAl304⁺-CrG10H；回收CrSTR基因及pCAMBIAl304⁺-CrG10H大片段；连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，CrSTR基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIAl304⁺-CrG10H中，从而获得含CrSTR和CrG10H的植物表达载体pCAMBIAl304⁺-CrSTR-CrG10H。载体示意图如图(1)所示。

本实施例将喜树碱合成途径关键酶基因CrSTR和CrG10H可操作性地连于表达调控序列，形成含CrSTR和CrG10H基因的植物表达载体pCAMBIAl304⁺-CrSTR-CrG10H，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高短小蛇根草中喜树碱含量。

实施例3发根农杆菌介导CrSTR和CrG10H基因遗传转化短小蛇根草获得转基因毛状根

3.1．含植物表达载体pCAMBIAl304⁺-CrSTR-CrG10H的发根农杆菌工程菌的获得

将实施例2中含CrSTR和CrG10H基因的植物双价表达载体pCAMBIAl304⁺-CrSTR-CrG10H转入发根农杆菌C58C1中，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含CrSTR和CrG10H基因的植物表达载体已成功构建到发根农杆菌菌株C58C1中。

3.2．发根农杆菌介导CrSTR，CrG10H基因遗传转化短小蛇根草

3.2.1．外植体的预培养

剪取无菌短小蛇根草茎段(1-3cm)，接种到预培养培养基(B₅)上，28℃暗培养2d。

3.2.2．农杆菌与外植体的共培养

将上述经预培养的短小蛇根草茎段外植体，放入含活化好的上述发根农杆菌工程菌的1／2MS悬液中浸泡10分钟(轻轻摇晃使外植体与菌液充分接触)后，取出浸染后的短小蛇根草茎段用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基B₅中，暗培养2d。

3.2.3．毛状根的诱导和继代培养

将上述的共培养2d的短小蛇根草外植体转接到除菌固体培养基(B₅+cb300mg／L)中，28℃暗培养2-3周左右，可从外植体伤口处长出毛状根。剪下(大约1-3cm)的毛状根，接种于B5+Cef500mg/L培养基中暗培养3周。转入B5+Cef250mg/L培养基中继代筛选，每2周继代培养一次。经过数次继代后即可完全脱菌。再将良好的短小蛇根草毛状根转入无抗生素的B5培养基上继续暗培养20d左右。

发根农杆菌介导CrSTR，CrG10H基因遗传转化短小蛇根草获得毛状根的流程如图2所示：A为短小蛇根草植株；B为预培养2d的短小蛇根草茎段；C为农杆菌侵染后，自愈伤组织长出毛状根；D为液体培养的短小蛇根草毛状根；E为剪下的毛状根在2周内增殖生长。

3.3．转基因短小蛇根草毛状根的PCR检测

3.3.1．转基因毛状根基因组DNA的提取

本发明采用CTAB法提取转基因毛状根基因组DNA。剪取3.2.3中除菌完毕的转基因毛状根5cm左右放入1.5ml离心管中，加入适量的石英砂及600μlCTAB裂解液（65℃预热，含1%β巯基乙醇），用研磨棒将材料充分磨碎。置于65℃水浴锅中40-50分钟，其间多次混匀样品（次/10min），冷却至室温后加入等入体积的苯酚，轻轻颠倒混匀乳化10min，12000rpm离心20min，小心吸取上清于新EP管中，加入等体积苯酚/氯仿（1:1），轻轻混匀，12000rpm离心20min，缓慢吸取上清于新EP管中，加等体积的氯仿混匀，12000rpm离心20min，缓慢吸取上清于新EP管中，加2倍体积预冷的无水乙醇，析出沉淀。用枪头将沉淀挑到新EP管中，加入75%乙醇4℃洗涤过夜。次日用75%乙醇再洗涤两次，吸出上清，室温晾干，加入30-50μl水溶解沉淀，用RNA酶处理后于-80℃超低温冰箱冻存，备用。

3.3.2．引物设计及PCR检测

在pCAMBIAl304⁺-CrSTR-CrG10H上启动插入目的基因表达的组成型表达启动子CaMV35S及插入基因上分别设计特异性上游及下游引物，用PCR方法对上述毛状根的总DNA进行分子检测，紫外线下观察到目的条带的株系即为阳性转基因短小蛇根草毛状根株系。引物序列为：

结果表明，利用上述特异引物，在一部分转基因毛状根中能检测到和阳性对照（pCAMBIAl304⁺-CrSTR-CrG10H质粒为模板）大小相当的PCR产物。而以pCAMBIAl304⁺空载体遗传转化短小蛇根草所发出的毛状根及野生型短小蛇根草植株根的基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。结果说明CrSTR，CrG10H基因已经整合到喜树基因组中。如图3所示：A为双转基因毛状根中的CrSTR基因鉴定；B为CrG10H基因鉴定；C为rolC鉴定；M：DL2000标准分子量；PC：质粒作阳性对照；NC：非转基因作阴性对照；BC：水作空白对照；SG：双转基因株系。

本实施例将所述的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化短小蛇根草的含CrSTR和CrG10H基因植物表达载体的发根农杆菌菌株C58C1，利用所构建的发根农杆菌菌株遗传转化短小蛇根草细胞，获得经PCR检测为阳性克隆的转基因毛状根。转基因短小蛇根草毛状根的获得为筛选获得高产喜树碱的毛状根提供了直接素材。

3.4．转基因短小蛇根草毛状根的Southern blot检测

首先分别提取PCR阳性的转基因短小蛇根草毛状根和携带pCAMBIAl304⁺质粒的农杆菌诱导出的短小蛇根草毛状根（阴性对照）的基因组DNA，分别取30μg DNA用BamHI内切酶过夜酶切，酶切产物和未酶切的pCAMBIAl304⁺-CrORCA3-CrG10H质粒（阳性对照）上样于0.8%琼脂糖凝胶，电泳分离后转移到尼龙膜上。然后将膜与地高辛标记的CrSTR和CrG10H基因探针分别在杂交炉内42℃杂交过夜，之后先用2×SSC,0.1%SDS溶液在15-25℃洗膜2×5min，再用0.5×SSC,0.1%SDS溶液在65℃洗膜2×15min。最后，将膜与胶片共同曝光6h（详细操作参照分子克隆手册）。

利用Southern blot分析了PCR阳性的10个独立的转基因短小蛇根草毛状根克隆，结果显示，10个毛状根克隆中有9个克隆有一个或多个杂交信号。而携带1304+质粒的农杆菌诱导出的对照组短小蛇根草毛状根则没有显示出杂交信号。表明CrSTR和CrG10H已经整合到短小蛇根草毛状根的基因组中。

实施例4Real-time PCR检测转基因短小蛇根草毛状根中CrSTR和CrG10H基因的表达

4.1．毛状根液体培养

选择实施例3中生长快且分子检测为阳性的毛状根，在超净工作台上剪取2-3cm用无菌水蒸馏水冲洗掉其表面上的琼脂后接入装有100ml B₅液体培养基的培养瓶中100rpm，25℃黑暗下培养，40天后收获，取适量新鲜毛状根用吸水纸吸干表面水分后，用锡箔纸包好浸入液氮中冷冻后保存于-80℃用于RNA提取，其余毛状根烘干后用于喜树碱含量提取。

4.2．引物的设计和合成

根据关键酶基因CrSTR和CrG10H的编码序列分别设计引物用于检测短小蛇根草毛状根中的CrSTR和CrG10H基因的表达情况，看家基因18S rRNA用来作为内参。所用引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列为：

4.3．转基因短小蛇根草毛状根的RNA提取

按照植物RNA提取试剂盒(康为世纪)说明书操作：

（1）准备工作：将实验中使用到的不锈钢小勺、研钵、研杵等实验材料用铝箔纸包裹后于200℃高温灭活RNase，2～3h后冷却备用；移液器吸头盒用0.1%DEPCH2O处理过夜后121℃灭菌20min以灭活DEPC，烘干备用。将实验过程中所使用的微量移液器及通风橱用酒精擦拭，准备好Rnase free的移液枪吸头及不同规格的Eppendorf离心管等；取出待提Op毛状根用铝箔纸包好后放入液氮待用。将RNA提取试剂盒中的Buffer RL分装一定数量后加入1%的β-巯基乙醇。

（2）提取：本实验采用北京康为世纪生物科技有限公司生产的植物总RNA提取试剂盒(Cat.CW0588)来提取Op毛状根总RNA，具体操作方法如下：

1)50～100mg Op毛状根在研钵中加入液氮迅速磨成粉末，迅速转移到1.5mlRNase-free的离心管中，加入含1%β-巯基乙醇的Buffer RL600μl，涡旋震荡混使其充分裂解；

2)将1）所得全部液体转移至已装入RNase-free2ml收集管的Shredder-spinColumn中，12000rpm离心2min，将收集管中的上清液转移到一个新的RNase-free的1.5ml离心管中；

3)将2）所得干净的裂解液中加入0.5倍体积的无水乙醇迅速混匀；

4)将3）溶液转移到吸附柱(Spin Column RM)中10000rpm离心15s，弃废液，再将吸附柱重新放回收集管中；

5)向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1，10000rpm离心1min，弃废液，再将吸附柱重新放回收集管中；

6)配制DNase I混合液：取52μl RNase-free water，向其中加入8μl10×Reaction Buffer 和20 μl DNase I(1U/ μl)混匀，制成总体积为80μl的反应液；

7)向吸附柱中直接加入80μl DNase I混合液，20～30℃孵育15min；

8)向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，10000rpm离心1min，弃废液，再将吸附柱重新放回收集管中；

9)向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(预加无水乙醇)，10000rpm离心15s，弃废液；

10)重复步骤9）；

11)将吸附柱重新放回收集管中，12000rpm离心1min；

12)将吸附柱装入新的RNase-free 的1.5ml离心管中，向吸附柱中的膜中央部位悬空滴加30～50μl RNase-free ddH2O，室温静置1分钟，10000rpm离心1min，得到RNA的水溶液。将样品分装成多管保存于-80℃超低温冰箱中待用。

4.4．RNA反转录成cDNA第一链

具体操作参照Takara公司生产的RT-PCR试剂盒说明书：

（1）在200μl离心管中将模板RNA及引物混合体系如下：

模板RNA                          1.5μg

AuAP(50μM,通用引物)             3μl

RNase free dH₂O                  up to 18μl

（2）70℃保温10min后迅速在冰上冷却2-5min。

（3）将上述离心管体系使用手掌式离心机离心数秒使变性的混合溶液聚集于离心管底部。

（4）接着在离心管中继续添加以下试剂：

（5）42℃保温1.5h。

（6）70℃保温15min使酶失活后迅速在冰上冷却，将所得cDNA第一链溶液分装成3管，-80℃保存备用。

4.5．Real-time PCR

以第一链cDNA扩增产物为模板，分别用靶基因(CrSTR,CrG10H)和内参(18SrRNA)引物（实施例4.2所示）进行Real-time PCR检测，体系如下：

PCR反应扩增条件为：94℃ 30s,55℃ 30s，72℃ 30s，40个循环。采用比较CT法进行基因表达分析。双转基因短小蛇根草毛状根的Real-time PCR分析相对基因表达量如图4所示：NC为阴性对照；SG为双转基因株系。

实施例5利用HPLC测定转基因短小蛇根草毛状根中喜树碱含量

5.1．色谱条件及标准品贮备液的配制

高效液相色谱测定喜树碱含量的条件：色谱柱AlltechEconosi C18不锈钢柱，流动相为乙腈：水（35：65），检测波长254nm，柱温30℃，流速1ml／min，进样量20μl。

精密称取2.00mg喜树碱和羟基喜树碱标准品,置于50mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,得质量浓度为40.00μg/mL的标准品贮备液，保存于-20℃备用。

本发明中流动相乙腈：水在35：65时，喜树碱和的羟基喜树碱保留时间分别为5.208min和8.675min，峰型良好，且可保证良好分离。

5.2．标准曲线的制作

将上述标准品贮备液品分别取5ul，10ul，15ul，20ul，30ul在相应色谱条件下进样，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品浓度(X，μg/ml)进行回归分析。结果表明，本发明中喜树碱标准曲线的R²为0.9997，表明线性关系良好。

5.3．转基因毛状根喜树碱含量的提取及测定

将实施例4中收获并烘干的转基因短小蛇根草毛状根放入研钵中充分研磨，取100mg毛状根干粉加入甲醇10ml，超声提取30min，50℃放置过夜，次日拿出离心(12000rpm，10min)，吸取上清萃取液后，再加入甲醇10ml，超声30min，离心(12000rpm，10min)，收集两次的上请萃取液减压蒸发，残余物重新用1ml的色谱甲醇溶解，样品用0.22μM的有机相滤膜过滤后各取20μl，注入高效液相色谱仪，记录各组分峰面积，代入线性回归方程，计算即得样品喜树碱含量。短小蛇根草毛状根株系的CPT含量均高于野生短小蛇根草，提高了2倍以上；共转化CrSTR+CrG10H的毛状根株系中的喜树碱含量总体水平大于单转CrG10H或单转CrSTR株系，达到了1.64‰，是野生短小蛇根草的2.4倍。各株系中喜树碱的平均含量如图5所示：NC为非转基因阴性对照，WT为野生型对照。

本实施例采用HPLC法测定了转基因短小蛇根草毛状根中喜树碱含量。结果表明共转CrSTR和CrG10H基因的短小蛇根草毛状根中喜树碱含量比对照组显著提高，为规模化生产喜树碱并解决喜树碱匮乏提供了一种可能的解决方法。

实施例6利用植物激素ABA（脱落酸）、SA（水杨酸）、MJ（茉莉酸）诱导转基因短小蛇根草毛状根

选取实施例5中毛状根生长和喜树碱产量均较优的的共转pCAMBIA1304++CrSTR+CrG10H基因短小蛇根草毛状根，液体培养6周后对其进行MJ(100μM)，ABA(100μM)，SA(100μM)诱导处理。观察诱导处理0d，1d，3d，7d和14d后毛状根中CPT产量，毛状根生长状态和喜树碱外排率的影响。经过100μM的ABA/SA/MJ诱导之后，每50ml培养体系中喜树碱的含量得到了明显的提升。喜树碱产量在7d时达到高峰，14d时明显回落。在诱导0d，1d和14d时诱导和未诱导毛状根的喜树碱产量没有明显差异。但在诱导3d时，当MJ和ABA诱导的毛状根和溶剂对照处理的毛状根中CPT产量均无明显差异的同时，经SA诱导毛状根的喜树碱产量发生了明显的变化。当诱导时间为7d时，各诱导子处理的喜树碱产量都得到了不同程度的提升。诱导作用的总体趋势为MJ>SA>DMSO>ABA>H₂O>NC。其中诱导效果尤为突出的是MJ和SA，经过这二者诱导的毛状根株系，其喜树碱产量分别是NC的3倍和2.9倍。同时，经过ABA诱导的毛状根株系其喜树产量则是NC的2倍。值得指出的是诱导子MJ的溶剂DMSO作为溶剂对照处理7d的毛状根，其喜树碱产量也得到了很大程度的提高，每50ml毛状根的喜树碱产量是NC的2.7倍，仅次于MJ和SA的诱导作用。由此可以推测，MJ的诱导作用在很大程度上借助于溶剂DMSO。此外，诱导子ABA的溶剂对照H₂O处理7d的毛状根，其喜树碱产量也得到了一定程度的提高，每瓶毛状根的喜树碱产量是NC的1.7倍。MJ、ABA、SA诱导14d后SG28毛状根中的喜树碱含量分析如图6所示：NC为非转基因的阴性对照；DMSO为MJ的溶剂对照；H₂O为ABA的溶剂对照。

本实施例采用植物激素诱导的方法对获得的高产转基因短小蛇根草毛状根株系进行进一步的诱导，结果表明在经过植物激素MJ、SA、ABA诱导后转基因毛状根株系的喜树碱含量得到了大幅度的提高，为进一步提高喜树碱的产量提供了一种便捷的途径。

实施例7喜树碱的抗肿瘤活性测定

7.1.对肿瘤细胞的MTT检测

选取实施例6中经MJ、DMSO、SA等诱导7天的高产CPT的转基因短小蛇根草毛状根粗提液，以CPT、标准品溶液为对照，甲醇为溶剂对照，5-FU为阳性对照，细胞培养液为阴性对照，对人慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞进行MTT检测。

MTT检测的原理是：以活细胞代谢物还原剂MTT即四甲基偶氮噻唑蓝【3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromid】为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可用10%SDS（十二烷基磺酸钠）溶解，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。

具体操作步骤如下：

(1）收集处于指数生长期的K562细胞，1000rpm离心5min，弃上清，加入2ml培养基重悬细胞，吸取10μL细胞悬液至血细胞计数板，在倒置显微镜下计数。调整细胞密度至1×104/ml，以1×104/孔密度接种于细胞96空孔培养板，每孔100μL，37℃，5%CO2饱和湿度培养4小时。

(2）加入一定浓度的药物溶液，每个药物考察点设6～8个复孔，37℃，5%CO2饱和湿度培养48小时。

(3）每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，37℃，5%CO2饱和湿度条件下反应4小时。若药物溶液会与MTT发生反应，则先吸去培养液再加MTT。

(4）终止反应：小心地吸去96空板每孔的反应液，加入100μL浓度为10%的SDS溶液，37℃，5%CO2饱和湿度条件下溶解formazan结晶过夜。利用酶标仪测定每个反应孔在490nm处的光密度OD值。

7.2.统计学分析

所有实验数据均经过三次实验重复确认。平均值的标准偏差用以衡量平均值的精确性。SPSS12.0（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）T检验用以检测实验组与对照组的显著性差异，p<0.05为差异显著。经过MTT检测结果发现，转基因短小蛇根草毛状根的粗提物在较低浓度下即可对人慢性粒细胞白血病细胞系K562具有良好的细胞杀伤作用，且杀伤力（35.9%）高于较高浓度的喜树碱标准品溶液。表明了通过转基因手段获得的喜树碱同样具有生物学活性。转基因毛状根对肿瘤细胞的杀伤力如图7所示：Sample1为CPT浓度为71.7μg/ml的粗提液；Sample2为CPT浓度为16.013μg/ml的粗提液；CPT为浓度为100μg/ml的喜树碱标准品的甲醇溶液；5-FU为100μg/ml的5-氟尿嘧啶甲醇溶液。

本实施例利用MTT法检测了利用转基因和又到手段获得的抗癌药物喜树碱的抗肿瘤活性，表明利用本发明所获得的喜树碱具有良好的杀伤肿瘤细胞的效果。

上述各实施例中的植物表达载体pCAMBIAl304还可以用pCAMBIA系列其他种类及pBI系列替代，或者发根农杆菌菌株C58C1用A4或LBA9402菌株代替，效果相同。

在本发明中共转CrSTR及CrG10H基因显著提高短小蛇根草毛状根中喜树碱含量。共转CrSTR及CrG10H基因的毛状根经诱导后所检测的喜树碱含量是非转基因毛状根的4.5倍，是野生型短小蛇根草根的6.9倍。

Claims (10)

1.一种利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将异胡豆苷合成酶基因CrSTR和香叶醇-10-羟化酶基因CrG10H插入植物表达载体，构建重组载体；

(2)将步骤（1）所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；

(3)利用所构建的含有重组载体的发根农杆菌菌株遗传转化短小蛇根草，获得毛状根；

(4)检测步骤（3）毛状根中的CrSTR和CrG10H基因，取筛选结果为阳性的转基因毛状根克隆；

(5)利用植物激素对获得的转基因毛状根进行诱导，使其喜树碱含量进一步提高。

2.权利要求1所述利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，步骤（1）中的CrSTR和CrG10H基因片段以长春花幼苗RNA为模板PCR获得。

3.权利要求1所述利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，步骤（1）中的植物表达载体为pCAMBIA质粒或pBI质粒。

4.权利要求1所述利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，步骤（2）所述的发根农杆菌为发根农杆菌菌株C58C1、发根农杆菌菌株A4或发根农杆菌菌株L BA9402。

5.权利要求1所述利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，步骤（3）中用含有重组植物表达载体的发根农杆菌菌株遗传转化短小蛇根草茎段，获得毛状根。

6.权利要求1所述利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，步骤（4）所述的检测方法为PCR及Southern blotting检测。

7.权利要求1所述利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，步骤（5）所述的植物激素为茉莉酸、脱落酸、水杨酸或二甲基亚砜。

8.权利要求1所述利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，步骤（5）中，将所获得的毛状根液体培养35～45天后用植物激素诱导。

9.权利要求1所述利用基因共转化策略获取喜树碱新型药源的方法，其特征在于，将步骤（5）获得的高产转基因毛状根粗提物进行抗肿瘤活性分析；所述抗肿瘤活性分析方法为MTT法。

10.一种用于提高喜树碱含量的重组载体，其特征在于，含有异胡豆苷合成酶基因CrSTR和香叶醇-10-羟化酶基因CrG10H。

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