CN102943091B - 一种利用RNAi技术培育抗多种病毒烟草的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用RNAi技术培育抗多种病毒烟草的方法，通过对GenBank中4种病毒（CMV、PVY、PVX、TMV）的多条基因组全长序列进行比对，筛选到4种病毒在基因组范围内的相对保守区域；最终选定各病毒序列，人工合成800bp的嵌合基因；依此构建了嵌合基因的RNAi植物表达载体，通过农杆菌转化普通烟草，获得转基因植株。本发明的特点是：以我国四种主要烟草病毒为对象，利用植物基因工程技术将人为构建的包含四种病毒序列的发夹状结构转入烟草中，使烟草转录出的发夹状双链RNA结构在植物自身机制下剪切成小RNA（siRNA），特异性地干扰、降解或沉默靶标病毒基因在烟草植株体内的正常复制和积累，筛选获得抗多种烟草病毒的烟草新材料。

Description

一种利用RNAi技术培育抗多种病毒烟草的方法

技术领域

本发明属于植物植物基因工程技术领域，具体是一种利用RNAi技术培育抗多种病毒烟草的方法，主要是针对烟草黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）、烟草马铃薯Y病毒（Potato Y virus, PVY）、烟草普通花叶病毒病（Tobacco mosaic virus, TMV）和烟草马铃薯X病毒病（Potato virus X, PVX）的RNA干涉载体构建方法、及其在烟草上应用。

背景技术

病毒病是烟草生产中不可忽视的病害，是造成烟草生产损失的重要原因。我国主要病毒病种类有TMV、CMV、PVY、PVX和烟草蚀纹病（Tobacco etch virus, TEV）等。20世纪60年代以前，全国烟区都以TMV危害最重；70年代以后，在黄淮烟区尤其是山东的CMV危害迅速上升，1974-1977年以CMV为主及CMV与TMV复合侵染，连续3年大流行，而在南方烟区和北方烟区仍以TMV为主要病害；20世纪80年代以后，不仅CMV在中、南部烟区危害继续上升，各类病毒病交替或同时流行危害，PVY开始发现，并逐年加重，已成为又一个主要病毒病害，与CMV、TMV混合发生、复合侵染。据统计，2008年我国病毒病造成的烟叶产值损失占病虫害总损失的23.4%。病毒侵染烟草后造成的花叶、坏死等症状对烟叶质量产生重大损害。

针对烟草病毒病发生的日趋严重，人们采用各种手段对其进行防治。然而，抗病品种的选育存在着培育时间长、容易出现抗性丧失等问题；农业措施往往只能减少或预防病毒初侵染源；化学药剂方面，目前还没有很好的方法能治疗烟草病毒病，主要也是以防治病毒传播介体为主要手段，化学农药存在着防效低、在作物上的残留多、对人畜有害及对环境造成污染等，目前用于防治病毒病害的农药制剂虽多，但是真正的有效成分和剂型很有限；生物防治方面在生产上的真正应用还很少。各种实践经验以及研究表明，通过育种或抗病毒基因工程方法使植物体本身具备病毒抗性是防治病毒最为有效的方法。

近年来，RNA干涉（RNA interference，RNAi）技术在抗病毒研究中倍受关注，RNAi是一种基因沉默新技术，即人为地将与病毒基因同源的双链RNA导入寄主，引起与其同源的病毒基因发生沉默，从而达到抑制病毒复制的目的。对动植物而言，RNA干扰是植物调控内源基因表达和防御外源核酸入侵的重要机制。

发明内容

本发明以我国四种主要烟草病毒（TMV、CMV、PVY和PVX）为对象，利用植物基因工程技术将人为构建的包含四种病毒序列的发夹状结构转入烟草中，使烟草转录出的发夹状双链RNA结构在植物自身机制下剪切成小RNA（siRNA），特异性地干扰、降解或沉默靶标病毒基因在烟草植株体内的正常复制和积累，筛选获得抗多种烟草病毒的烟草新材料，为利用RNAi介导的烟草抗病毒烟草育种工作提供了经验和实例。

基于上述目的，本发明提供了一种可供农杆菌遗传转化烟草、针对多种烟草病毒的RNAi载体构建方法，该载体包含致病病毒CMV的RNA2-2B基因、PVY的HC-Pro基因、PVX的CP基因和TMV的CP基因部分保守核苷酸序列，以及利用该载体遗传转化烟草获得抗病毒烟草。该技术方法的建立将为烟草抗病毒育种工作提供一种新的策略和思路。

本发明目的是通过以下技术方案来实现的：

一种利用RNAi技术培育抗多种病毒烟草的方法，通过对GenBank中4种病毒（CMV、PVY、PVX、TMV）的多条基因组全长序列进行比对，筛选到4种病毒在基因组范围内的相对保守区域；最终选定各病毒序列，连接成800bp的嵌合基因；依此构建了嵌合基因的RNAi植物表达载体，通过农杆菌转化普通烟草，获得转基因植株，经检测得到转化成功的植株。

具体步骤如下：

1）嵌合基因的设计与合成

通过对GenBank中4种病毒（CMV、PVY、PVX、TMV）的多条基因组全长序列进行比对，筛选4种病毒基因组范围内的多个相对保守区域，针对CMV的2B、PVY的HC-PRO、TMV和PVX的 CP基因（编码外壳蛋白coat protein）区域各筛选确定200bp片段。4段序列连接成总共800 bp的序列，排列顺序为TMV-PVX-CMV-PVY，人工合成全长嵌合基因。

）RNAi载体构建

（1）内含子的选取

人工构建发夹结构表达载体，需要在反向重复序列中间插入内含子来稳定转录形成的发夹结构，本发明克隆在烟草细胞内普遍表达较为稳定的细胞色素P450基因的内含子，设计引物5p450和3p450扩增得到内含子，连接至克隆载体，用于RNAi载体构建。

（2）构建发夹结构

根据已有的克隆载体pBlueScript KS II和植物表达载体pBIN219中多克隆位点（MCS）情况，选择引物上的酶切位点，同时避免涉及800 bp和内含子中包含的酶切位点，据此设计了含有不同酶切位点的引物用以扩增各个片段，引物序列见下表：

引物	序列	酶切位点
			5p450	G TACATATCAC TTTAATTCA	无
3p450	CTGA TTGTGCAATA CATATT	无
			ihp1	CG GGATCC GGTGTACAGG TACAATGCGG	BamHI
ihp2	CCG CTCGAG TCAAAAAGAA ATTATTCAGA A	XhoI
			ihp3	ACGC GTCGAC TCAAAAAGAA ATTATTCAGA A	SalI
ihp4	GG GAGCTC GGTGTACAGG TACAATGCGG	KpnI
			int1	CCG CTCGAG G TACATATCAC TTTAATTCA	XhoI
int2	ACGC GTCGAC CTGA TTGTGCAATA CATATT	SalI

在用于扩增800bp嵌合基因的引物中引入BamH I和EcoR V、Xho I和Kpn I位点，用于扩增内含子的引物中引入EcoR V和Xho I位点，通过双酶切，首先将正向800 bp连接至克隆载体，转化大肠杆菌DH5α；通过菌落PCR及质粒酶切鉴定得到已插入目的片段的阳性克隆，内含子和反向800 bp以同样的方式，将嵌合基因与内含子依次连接至克隆载体，构成载体pBS-ihp。通过双酶切能够得到大小约为2000 bp、具有反向重复结构的DNA片段；经过测序证实所得片段确为目的发夹结构，且方向无误，不存在突变位点。

（3）构建植物表达载体

为使发夹结构在植物细胞内具有较高的转录水平，本实验选择含有35S启动子和nos终止子的pBIN219作为表达载体，pBIN219含有的35S启动子能够在植物细胞能高水平转录，而NPTII基因使其具备卡那霉素筛选抗性，在NPTII基因和nos终止子两端的边界序列（LB和RB）能够使农杆菌在侵染植物细胞时，将该序列之间的T-DNA整合至植物基因组；将上一步骤中获得的2000 bp左右片段双酶切从克隆载体上切下，连入pBIN219的多克隆酶切位点，转化大肠杆菌DH5α，构建为pBIN-ihp。

）抗病毒转基因烟草的培育

将构建成功的表达载体pBIN-ihp利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404，挑取携带重组质粒的农杆菌单菌落培养至OD₆₀₀=0.6-0.8，使用叶盘法转化无菌苗烟草，经农杆菌浸泡的叶片于弱光下暗培养2天，然后转入含有卡那霉素的MS分化筛选培养基中培养，每隔7天更换一次培养基以保证养分供应，约10天后在叶片边缘开始有愈伤组织形成，一个月后，愈伤组织上分化出小芽，长至长约1cm，切下含有生长点的小芽至含有抗生素的生根培养基中诱导生根，根系发育完全后的植株经过温室炼苗，洗净培养基，移植土中待后续检测；以转化空载体pBIN219的植株为对照。

以CTAB法提取的转化植株基因组DNA为模板，使用嵌合基因两端引物（ihp1/ihp2）或者嵌合基因和内含子引物进行扩增，检测到部分植株基因组中已整合入上述构建的发夹结构；通过设置非转基因植株为空白对照，排除单引物扩增结果的干扰；另外，对扩增所得片段进行测序，确认结果的准确性；最终得到转化成功的植株共30株，转化成功率85.7%。

）抗病毒有益效果

使用经血清学和分子生物学方法检测携带相应CMV、PVY和TMV病毒的烟草叶片，将携带有不同病毒的叶片混合研磨，用研磨汁液接种转基因烟草。以转空表达载体pBIN219的转基因烟草和生长状态与转基因植株大体一致的非转基因烟草为对照，同样接种处理。

病毒挑战接种后10天内，空表达载体转化烟草和非转基因烟草与全部发病，成功转入pBIN-ihp的30株烟草有2株表现明显症状，相对于非转基因烟草植株，pBIN-ihp转化阳性植株表现出显症推迟特性，其余28株pBIN-ihp转化阳性植株未观察到明显病毒症状。接种植株上部叶ELISA结果显示，25株pBIN-ihp转化阳性植株具有TMV抗性，27株具有CMV抗性，23株具有PVY抗性（见表4）。接种后第20天，2株空表达载体转化烟草和3株非转基因烟草死亡，pBIN-ihp转化阳性植株未显症有20株，ELISA检测结果表明，仍然有18株抗TMV、22株抗CMV、19株抗PVY，抗病毒效果显著。

使用本发明构建的发卡状结构序列构建植物表达载体时，可在其转录起始位点前加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，从转基因植物安全性角度考虑，可不加任何选择性标记基因，而通过逆境筛选转化烟草植株。

携带本发明构建的发卡状结构序列的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电导及农杆菌介导等常规生物学方法转化烟草细胞或组织，并将转化的烟草组织培养成植株。

本发明相比现有技术的特点在于：以我国四种主要烟草病毒（TMV、CMV、PVY和PVX）为对象，利用植物基因工程技术将人为构建的包含四种病毒序列的发夹状结构转入烟草中，使烟草转录出的发夹状双链RNA结构在植物自身机制下剪切成小RNA（siRNA），特异性地干扰、降解或沉默靶标病毒基因在烟草植株体内的正常复制和积累，筛选获得抗多种烟草病毒的烟草新材料，为利用RNAi介导的烟草抗病毒烟草育种工作提供了经验和实例。

附图说明

图1  800 bp和内含子PCR产物琼脂糖凝胶电泳

M：DL2000 marker。泳道1：800 bp PCR产物。泳道2：P450内含子PCR产物。

图2  发夹结构示意图

图3  克隆载体双酶切后琼脂糖凝胶电泳

M：DL2000 marker。泳道1：P450内含子，pBS-int（EcoR V+Xho I）。泳道2：800bp嵌合基因，pBS-800（BamH I+ EcoR V）。泳道3：正向800+内含子，pBS-1180（Xho I+Kpn I）。

图4  植物表达载体pBIN219结构

NPTII：新霉素磷酸转移酶，产生卡那抗性。35S：35S启动子；MCS：多克隆位点（已标示内部酶切位点）；NOS：NOS终止子。LB，RB：T-DNA左、右边界

图5 植物表达载体pBIN-ihp结构

粉红色箭头部分示插入的发夹结构。

图6克隆载体和表达载体双酶切后电泳

M：DL2000 marker。泳道1：pBS-ihp（BamH I+Kpn I）。泳道2：pBIN-ihp（BamH I+Kpn I）

图7 普通烟抗性筛选过程及植株再生

A：无菌苗。B：愈伤组织。C：再分化出小芽。D：诱导生根植株。E：移栽至土中成苗。

具体实施方式

下面结合附图及实施实例对本发明做进一步说明。下述实施实例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

（一）嵌合基因的设计与合成

通过对GenBank中4种病毒（CMV、PVY、PVX、TMV）的多条基因组全长序列进行比对，在整个基因组范围内筛选到4种病毒的多个相对保守区域。另外，根据相关文献报道，CMV基因组编码的2b和PVY编码的Hc-Pro蛋白是RNAi抑制子（RNAi suppressor），它能够使寄主用于抵抗病毒的RNAi机制受到抑制。为防止病毒对RNAi作用产生潜在抑制，本发明设计针对CMV的2b、PVY的Hc-Pro基因选择了靶定区域。TMV和PVX均选择靶定CP基因（编码外壳蛋白coat protein）。最终选定的各病毒序列相关信息见表1。4段序列连接成总共800 bp的序列，排列顺序为TMV-PVX-CMV-PVY，由公司代为合成全长嵌合基因。800 bp PCR产物见图1左图。

（二）RNAi载体构建

1、内含子的选取

人工构建发夹结构表达载体，需要在反向重复序列中间插入内含子来稳定转录形成的发夹结构。本发明克隆在烟草细胞内普遍表达较为稳定的细胞色素P450基因的内含子。设计引物5p450和3p450（引物见表2）扩增得到内含子（图1右图），连接至克隆载体，用于RNAi载体构建。

2、构建发夹结构

根据已有的克隆载体pBlueScript KS II和植物表达载体pBIN219中多克隆位点（MCS）情况，选择引物上的酶切位点，同时避免涉及800 bp和内含子中包含的酶切位点，据此设计了含有不同酶切位点的引物用以扩增各个片段。（引物见表2）

表2   内含子克隆及转基因所用引物

引物	序列	酶切位点
			5p450	G TACATATCAC TTTAATTCA	无
3p450	CTGA TTGTGCAATA CATATT	无
			ihp1	CG GGATCC GGTGTACAGG TACAATGCGG	BamHI
ihp2	CCG CTCGAG TCAAAAAGAA ATTATTCAGA A	XhoI
			ihp3	ACGC GTCGAC TCAAAAAGAA ATTATTCAGA A	SalI
ihp4	GG GAGCTC GGTGTACAGG TACAATGCGG	KpnI
			int1	CCG CTCGAG G TACATATCAC TTTAATTCA	XhoI
int2	ACGC GTCGAC CTGA TTGTGCAATA CATATT	SalI

在用于扩增800bp嵌合基因的引物中引入BamH I和EcoR V、Xho I和Kpn I位点，用于扩增内含子的引物中引入EcoR V和Xho I位点（发夹结构酶切位点状况详见图2）。通过双酶切，首先将正向800 bp连接至克隆载体，转化大肠杆菌DH5α。通过菌落PCR及质粒酶切鉴定得到已插入目的片段的阳性克隆。内含子和反向800 bp以同样的方式，将嵌合基因与内含子依次连接至克隆载体，构成载体pBS-ihp。通过双酶切能够得到大小约为2000 bp、具有反向重复结构的DNA片段（各种酶切验证见图3）。经过测序证实所得片段确为目的发夹结构，且方向无误，不存在突变位点。

3、构建植物表达载体

为使发夹结构在植物细胞内具有较高的转录水平，本实验选择含有35S启动子和nos终止子的pBIN219作为表达载体（图4）。pBIN219含有的35S启动子能够在植物细胞能高水平转录，而NPTII基因使其具备卡那霉素筛选抗性。在NPTII基因和nos终止子两端的边界序列（LB和RB）能够使农杆菌在侵染植物细胞时，将该序列之间的T-DNA整合至植物基因组。将上一步骤中获得的2000 bp左右片段双酶切从克隆载体上切下，连入pBIN219的多克隆酶切位点，转化大肠杆菌DH5α，构建为pBIN-ihp（见图5，酶切检测见图6）。

（三）抗病毒转基因烟草的培育

将构建成功的表达载体pBIN-ihp利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404。挑取携带重组质粒的农杆菌单菌落培养至OD₆₀₀=0.6-0.8，使用叶盘法转化无菌苗中烟100。经农杆菌浸泡的叶片于弱光下暗培养2天，然后转入含有卡那霉素的MS分化筛选培养基中培养，每隔7天更换一次培养基以保证养分供应。约10天后在叶片边缘开始有愈伤组织形成，一个月后，愈伤组织上分化出小芽，长至长约1cm，切下含有生长点的小芽至含有抗生素的生根培养基中诱导生根。根系发育完全后的植株经过温室炼苗，洗净培养基，移植土中待后续检测（图7）。本实验以转化空载体pBIN219的植株为对照。

转化pBIN-ihp的植株一共获得35株成活植株，另有3株转化空白表达载体pBIN219的成活植株作为对照。以CTAB法提取的转化植株基因组DNA为模板，使用嵌合基因两端引物（ihp1/ihp2）或者嵌合基因和内含子引物进行扩增，检测到部分植株基因组中已整合入上述构建的发夹结构。由于植物基因组的复杂性，嵌合基因两端的单引物扩增可以得到非特异产物。通过设置非转基因植株为空白对照，则可以排除单引物扩增结果的干扰。另外，对扩增所得片段进行测序，确认了结果的准确性。最终得到转化成功的植株共30株，转化成功率85.7%（图7，图中未显示所有阳性结果）。

（四）抗病毒有益效果检测

使用经血清学和分子生物学方法检测携带相应CMV、PVY和TMV病毒的烟草叶片，将携带有不同病毒的叶片混合研磨，用研磨汁液接种转基因烟草。同时，在3株转空表达载体pBIN219的转基因烟草和3株生长状态与转基因植株大体一致的非转基因中烟100上作同样接种处理，作为对照。接种后植株发病过程统计结果见表3。

表3  pBIN-ihp转化阳性植株和对照接种病毒后症状观察结果

表4  pBIN-ihp转化阳性植株和对照接种病毒后ELISA结果

病毒挑战接种后10天内，空表达载体转化烟草和非转基因烟草与全部发病，成功转入pBIN-ihp的30株烟草有2株表现明显症状，相对于非转基因烟草植株，pBIN-ihp转化阳性植株表现出显症推迟特性，其余28株pBIN-ihp转化阳性植株未观察到明显病毒症状。接种植株上部叶ELISA结果显示，25株pBIN-ihp转化阳性植株具有TMV抗性，27株具有CMV抗性，23株具有PVY抗性（见表4）。接种后第20天，2株空表达载体转化烟草和3株非转基因烟草死亡，pBIN-ihp转化阳性植株未显症有20株，ELISA检测结果表明，仍然有18株抗TMV、22株抗CMV、19株抗PVY，抗病毒效果显著。

序列表

<110>中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120>一种利用RNAi技术培育抗多种病毒烟草的方法

 

<210>1

<211>200

<212>DNA

<213>人工序列

<221> TMV-CP200bp序列

<222>（1）..(200)

<400>1

GGTGTACAGG TACAATGCGG TATTAGACCC GCTAGTCACA GCACTGTTAG GTGCATTTGA  60     

CACTAGAAAT AGAATAATAG AAGTTGAAAA TCAGGCGAAC CCCACGACTG CCGAAACGTT 120 

AGACGCTACT CGTAGAGTAG ACGACGCAAC GGTGGCCATA AGGAGCGCTA TAAATAATTT 180   

AGTAGTAGAA TTGATCAGAG                                                      200

 

<210>2

<211>200

<212>DNA

<213>人工序列

<221> PVX-CP200bp序列

<222>（1）..(200)

<400>2

AGGTTTCAAG CCTGAGCACA AATTCGCTGC ATTCGACTTC TTCAATGGAG TCACCAACCC  60

AGCTGCCATC ATGCCCAAAG AGGGGCTCAT CCGGCCACCG TCCGAAGCTG AAATGAATGC 120  

TGCCCAAACT GCTGCTTTTG TGAAGATTAC GAAAGCCAGG GCACAATCCA ACGACTTTGC 180

 CAGCCTAGAT GCGGCTGTCA                                                      200   

 

<210>3

<211>200

<212>DNA

<213>人工序列

<221> CMV-2b200bp序列

<222>（1）..(200)

<400>3

ATGGAATTGA ACGAAGGCGC AATGACAAAC GTCGAACTCC AACTGGCCCG CATGGTGGAG  60

GCGAAGAGAC AGAGACGAAG GTCTCACAAG AAGAATCGAC GGGAACGATG TTACAAAAGT 120

CCCAGCGAGA GGGCGCGTTC AAATCTCAGA CTGTTCCGCT TCCCACCGTT CTATCAAGTA 180

GATGGTTCGG AACTGATAGA                                                      200

 

<210>4

<211>200

<212>DNA

<213>人工序列

<221> PVY-Hc-Pro200bp序列

<222>（1）..(200)

<400>4

GCACGCAAGT GATGGTCTAA ATCGATTGGG GGCAGACAAA GATCGCTTTG TGCATGTCAA  60

AAAGTTCTTG ACAATCTTAG AGCACTTGAC TGAACCGGTT GATCTGAGTC TAGAAATTTT 120  

CAATGAAGTA TTCAAGTCTA TAGGGGAGAA GCAACAATCA CCTTTCAAAA ACCTGAATAT  180

TCTGAATAAT TTCTTTTTGA                                                      200

 

<210>5

<211>800

<212>DNA

<213>人工序列

<221> 嵌合基因800bp序列

<222>（1）..(800)

<400>5

GGTGTACAGG TACAATGCGG TATTAGACCC GCTAGTCACA GCACTGTTAG GTGCATTTGA   60     

CACTAGAAAT AGAATAATAG AAGTTGAAAA TCAGGCGAAC CCCACGACTG CCGAAACGTT  120 

AGACGCTACT CGTAGAGTAG ACGACGCAAC GGTGGCCATA AGGAGCGCTA TAAATAATTT  180   

AGTAGTAGAA TTGATCAGAG AGGTTTCAAG CCTGAGCACA AATTCGCTGC ATTCGACTTC  240

TTCAATGGAG TCACCAACCC AGCTGCCATC ATGCCCAAAG AGGGGCTCAT CCGGCCACCG  300

TCCGAAGCTG AAATGAATGC TGCCCAAACT GCTGCTTTTG TGAAGATTAC GAAAGCCAGG  360

GCACAATCCA ACGACTTTGC CAGCCTAGAT GCGGCTGTCA ATGGAATTGA ACGAAGGCGC  420

AATGACAAAC GTCGAACTCC AACTGGCCCG CATGGTGGAG GCGAAGAGAC AGAGACGAAG  480

GTCTCACAAG AAGAATCGAC GGGAACGATG TTACAAAAGT CCCAGCGAGA GGGCGCGTTC  540

AAATCTCAGA CTGTTCCGCT TCCCACCGTT CTATCAAGTA GATGGTTCGG AACTGATAGA  600

GCACGCAAGT GATGGTCTAA ATCGATTGGG GGCAGACAAA GATCGCTTTG TGCATGTCAA  660

AAAGTTCTTG ACAATCTTAG AGCACTTGAC TGAACCGGTT GATCTGAGTC TAGAAATTTT  720  

CAATGAAGTA TTCAAGTCTA TAGGGGAGAA GCAACAATCA CCTTTCAAAA ACCTGAATAT  780

TCTGAATAAT TTCTTTTTGA                                                      800

 

<210>6

<211>1986

<212>DNA

<213>人工序列

<221> 发卡结构序列

<222>（1）..(1986)

<400>6

GGTGTACAGG TACAATGCGG TATTAGACCC GCTAGTCACA GCACTGTTAG GTGCATTTGA   60 

  

CACTAGAAAT AGAATAATAG AAGTTGAAAA TCAGGCGAAC CCCACGACTG CCGAAACGTT  120 

 

AGACGCTACT CGTAGAGTAG ACGACGCAAC GGTGGCCATA AGGAGCGCTA TAAATAATTT  180   

AGTAGTAGAA TTGATCAGAG AGGTTTCAAG CCTGAGCACA AATTCGCTGC ATTCGACTTC  240

TTCAATGGAG TCACCAACCC AGCTGCCATC ATGCCCAAAG AGGGGCTCAT CCGGCCACCG  300

TCCGAAGCTG AAATGAATGC TGCCCAAACT GCTGCTTTTG TGAAGATTAC GAAAGCCAGG  360

GCACAATCCA ACGACTTTGC CAGCCTAGAT GCGGCTGTCA ATGGAATTGA ACGAAGGCGC  420

AATGACAAAC GTCGAACTCC AACTGGCCCG CATGGTGGAG GCGAAGAGAC AGAGACGAAG  480

GTCTCACAAG AAGAATCGAC GGGAACGATG TTACAAAAGT CCCAGCGAGA GGGCGCGTTC  540

AAATCTCAGA CTGTTCCGCT TCCCACCGTT CTATCAAGTA GATGGTTCGG AACTGATAGA  600

GCACGCAAGT GATGGTCTAA ATCGATTGGG GGCAGACAAA GATCGCTTTG TGCATGTCAA  660

AAAGTTCTTG ACAATCTTAG AGCACTTGAC TGAACCGGTT GATCTGAGTC TAGAAATTTT  720  

CAATGAAGTA TTCAAGTCTA TAGGGGAGAA GCAACAATCA CCTTTCAAAA ACCTGAATAT  780

TCTGAATAAT TTCTTTTTGA GTACATATCA CTTTAATTCA CAACTCGTGG TGTCTTATCA  840

ATTTAAGACA AAAGAAAAAT AATAGCACAC AAAAATTAAA GTACTACTCT AGTATTTATG  900

AATAATCTTA TTAACCGCGT ACTAGATCCT TTATTGCTTC TACCACTTGG GTGCCACTAC  960

TGATGATTTC TTCACTAGGA CTAAAGGAAA ATTTGCTAAG AAAAGTTTGG AACTTTATGG 1020

TTGACCGAGA TATAGTTGGT TCCAATGTCT ATCCGCACGT TAAAACATAT AATAATTAAC 1080

GAAATCGAAC TTTTTCTATG AAAGTTGGAG GGCTACGTAC GGGTCAAGTA TTTCTTTATT 1140

TTTTTGGCGC TTGATGATAA GACTTAAATA TGTATTGCAC AATCAGTCAA AAAGAAATTA 1200

TTCAGAATAT TCAGGTTTTT GAAAGGTGAT TGTTGCTTCT CCCCTATAGA CTTGAATACT 1260

TCATTGAAAA TTTCTAGACT CAGATCAACC GGTTCAGTCA AGTGCTCTAA GATTGTCAAG 1320

AACTTTTTGA CATGCACAAA GCGATCTTTG TCTGCCCCCA ATCGATTTAG ACCATCACTT 1380  

GCGTGCTCTA TCAGTTCCGA ACCATCTACT TGATAGAACG GTGGGAAGCG GAACAGTCTG 1440

AGATTTGAAC GCGCCCTCTC GCTGGGACTT TTGTAACATC GTTCCCGTCG ATTCTTCTTG 1500

TGAGACCTTC GTCTCTGTCT CTTCGCCTCC ACCATGCGGG CCAGTTGGAG TTCGACGTTT 1560

GTCATTGCGC CTTCGTTCAA TTCCATTGAC AGCCGCATCT AGGCTGGCAA AGTCGTTGGA 1620

TTGTGCCCTG GCTTTCGTAA TCTTCACAAA AGCAGCAGTT TGGGCAGCAT TCATTTCAGC 1680

TTCGGACGGT GGCCGGATGA GCCCCTCTTT GGGCATGATG GCAGCTGGGT TGGTGACTCC 1740

ATTGAAGAAG TCGAATGCAG CGAATTTGTG CTCAGGCTTG AAACCTCTCT GATCAATTCT 1800

ACTACTAAAT TATTTATAGC GCTCCTTATG GCCACCGTTG CGTCGTCTAC TCTACGAGTA 1860

GCGTCTAACG TTTCGGCAGT CGTGGGGTTC GCCTGATTTT CAACTTCTAT TATTCTATTT 1920

CTAGTGTCAA ATGCACCTAA CAGTGCTGTG ACTAGCGGGT CTAATACCGC ATTGTACCTG 1980

TACACC                                                                       1986

 

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<221>内含子克隆正向引物

<222>（1）..(21)

<400>7

G TACATATCAC TTTAATTCA                                                      21

 

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<221>内含子克隆反向引物

<222>（1）..(20)

<400>8

CTGA TTGTGCAATA CATATT                                                     20

 

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<221>嵌合基因扩增正向引物1

<222>（1）..(28)

<400>9

CG GGATCC GGTGTACAGG TACAATGCGG                                          28

 

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<221>嵌合基因扩增反向引物1

<222>（1）..(30)

<400>10

CCG CTCGAG TCAAAAAGAA ATTATTCAGA A                                      30

 

<210>11

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<221>嵌合基因扩增正向引物2

<222>（1）..(31)

<400>11

ACGC GTCGAC TCAAAAAGAA ATTATTCAGA A                                    31

 

<210>12

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<221>嵌合基因扩增反向引物2

<222>（1）..(28)

<400>12

GG GAGCTC GGTGTACAGG TACAATGCGG                                         28

 

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<221>内含子检测正向引物

<222>（1）..(29)

<400>13

CCG CTCGAG G TACATATCAC TTTAATTCA                                       29

 

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<221>内含子检测反向引物

<222>（1）..(30)

<400>14

ACGC GTCGAC CTGA TTGTGCAATA CATATT                                      30

 

Claims (2)

1.一种利用RNAi技术培育抗多种病毒烟草的方法，其特征在于：通过对GenBank中4种病毒CMV、PVY、PVX、TMV的多条基因组全长序列进行比对，筛选到4种病毒在基因组范围内的相对保守区域；最终选定各病毒序列，连接成800bp的嵌合基因；依此构建了嵌合基因的RNAi植物表达载体，通过农杆菌转化普通烟草，获得转基因植株，经检测得到转化成功的植株，具体步骤如下：

1）嵌合基因的设计与合成

通过对GenBank中4种病毒CMV、PVY、PVX、TMV的多条基因组全长序列进行比对，筛选4种病毒基因组范围内的多个相对保守区域，分别针对CMV的2B、PVY的HC-PRO、TMV和PVX的 CP基因区域各筛选确定200bp片段，具体序列如下：

TMV-CP 200bp序列

GGTGTACAGG TACAATGCGG TATTAGACCC GCTAGTCACA GCACTGTTAG GTGCATTTGA  60    

CACTAGAAAT AGAATAATAG AAGTTGAAAA TCAGGCGAAC CCCACGACTG CCGAAACGTT 120  

AGACGCTACT CGTAGAGTAG ACGACGCAAC GGTGGCCATA AGGAGCGCTA TAAATAATTT 180   

AGTAGTAGAA TTGATCAGAG                                             200

PVX-CP 200bp序列

AGGTTTCAAG CCTGAGCACA AATTCGCTGC ATTCGACTTC TTCAATGGAG TCACCAACCC  60 

AGCTGCCATC ATGCCCAAAG AGGGGCTCAT CCGGCCACCG TCCGAAGCTG AAATGAATGC 120   

TGCCCAAACT GCTGCTTTTG TGAAGATTAC GAAAGCCAGG GCACAATCCA ACGACTTTGC 180 

CAGCCTAGAT GCGGCTGTCA                                             200    

CMV-2B 200bp序列

ATGGAATTGA ACGAAGGCGC AATGACAAAC GTCGAACTCC AACTGGCCCG CATGGTGGAG  60 

GCGAAGAGAC AGAGACGAAG GTCTCACAAG AAGAATCGAC GGGAACGATG TTACAAAAGT 120 

CCCAGCGAGA GGGCGCGTTC AAATCTCAGA CTGTTCCGCT TCCCACCGTT CTATCAAGTA 180 

GATGGTTCGG AACTGATAGA                                             200

PVY-Hc-Pro 200bp序列

GCACGCAAGT GATGGTCTAA ATCGATTGGG GGCAGACAAA GATCGCTTTG TGCATGTCAA  60 

AAAGTTCTTG ACAATCTTAG AGCACTTGAC TGAACCGGTT GATCTGAGTC TAGAAATTTT 120   

CAATGAAGTA TTCAAGTCTA TAGGGGAGAA GCAACAATCA CCTTTCAAAA ACCTGAATAT  180 

TCTGAATAAT TTCTTTTTGA                                              200

4段序列连接成总共800 bp的序列，排列顺序为TMV-PVX-CMV-PVY，人工合成全长嵌合基因；

2）RNAi载体构建

（1）内含子的选取

人工构建发夹结构表达载体，需要在反向重复序列中间插入内含子来稳定转录形成的发夹结构，克隆在烟草细胞内普遍表达较为稳定的细胞色素P450基因的内含子，设计引物5p450和3p450扩增得到内含子，连接至克隆载体，用于RNAi载体构建；

（2）构建发夹结构

根据已有的克隆载体pBlueScript KS II和植物表达载体pBIN219中多克隆位点（MCS）情况，选择引物上的酶切位点，同时避免涉及800 bp和内含子中包含的酶切位点，据此设计了含有不同酶切位点的引物用以扩增各个片段，引物序列见下表：

引物 序列 酶切位点 5p450 G TACATATCAC TTTAATTCA 无 3p450 CTGA TTGTGCAATA CATATT 无 ihp1 CG GGATCC GGTGTACAGG TACAATGCGG BamHI ihp2 CCG CTCGAG TCAAAAAGAA ATTATTCAGA A XhoI ihp3 ACGC GTCGAC TCAAAAAGAA ATTATTCAGA A SalI ihp4 GG GAGCTC GGTGTACAGG TACAATGCGG KpnI int1 CCG CTCGAG G TACATATCAC TTTAATTCA XhoI int2 ACGC GTCGAC CTGA TTGTGCAATA CATATT SalI

在用于扩增800bp嵌合基因的引物中引入BamH I和EcoR V、Xho I和Kpn I位点，用于扩增内含子的引物中引入EcoR V和Xho I位点，通过双酶切，首先将正向800 bp连接至克隆载体，转化大肠杆菌DH5α；通过菌落PCR及质粒酶切鉴定得到已插入目的片段的阳性克隆，内含子和反向800 bp以同样的方式，将嵌合基因与内含子依次连接至克隆载体，构成载体pBS-ihp；

通过双酶切能够得到大小约为2000 bp、具有反向重复结构的DNA片段；经过测序证实所得片段确为目的发夹结构，且方向无误，不存在突变位点；

（3）构建植物表达载体

选择含有35S启动子和nos终止子的pBIN219作为表达载体，pBIN219含有的35S启动子能够在植物细胞高水平转录，而NPTII基因使其具备卡那霉素筛选抗性，在NPTII基因和nos终止子两端的边界序列（LB和RB）能够使农杆菌在侵染植物细胞时，将该序列之间的T-DNA整合至植物基因组；将上一步骤中获得的2000 bp左右片段双酶切从克隆载体上切下，连入pBIN219的多克隆酶切位点，转化大肠杆菌DH5α，构建为pBIN-ihp；

3）抗病毒转基因烟草的培育

将构建成功的表达载体pBIN-ihp利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404，使用叶盘法转化无菌苗烟草，经农杆菌浸泡的叶片于弱光下暗培养2天，然后转入含有卡那霉素的MS分化筛选培养基中培养，每隔7天更换一次培养基以保证养分供应，约10天后在叶片边缘开始有愈伤组织形成，一个月后，愈伤组织上分化出小芽，长至长约1cm，切下含有生长点的小芽至含有抗生素的生根培养基中诱导生根，根系发育完全后的植株经过温室炼苗，洗净培养基，移植土中待后续检测；以转化空载体pBIN219的植株为对照；

以CTAB法提取的转化植株基因组DNA为模板，使用嵌合基因两端引物ihp1/ihp2或者嵌合基因和内含子引物进行扩增，检测到部分植株基因组中已整合入上述构建的发夹结构；通过设置非转基因植株为空白对照，排除单引物扩增结果的干扰；另外，对扩增所得片段进行测序，确认结果的准确性，最终得到转化成功的植株，转化成功率85.7%。

2.根据权利要求1所述的利用RNAi技术培育抗多种病毒烟草的方法，其特征在于：携带构建的发夹结构序列的植物表达载体通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电导及农杆菌介导常规生物学方法转化烟草细胞或组织，并将转化的烟草组织培养成植株。

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