CN102220374A - 一种利用RNAi技术培育抗黑条矮缩病水稻的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用RNAi技术培育抗黑条矮缩病水稻的方法，适用于水稻防治水稻黑条矮缩病，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。本发明通过构建含有水稻黑条矮缩病病毒S8部分片段的RNAi表达载体，利用农杆菌介导的转基因方法将RNAi载体转入水稻的胚性愈伤组织，通过潮霉素抗性基因筛选、分化、生根壮苗，获得再生转基因植株和株系。该方法利用RNAi技术，可培育出对黑条矮缩病表现抗性的水稻转基因株系，从根本上解决水稻黑条矮缩病问题，显著增强水稻对该病的抗性，提高经济效益，同时为绿色环保农业提供有力的技术支持。

Description

一种利用RNAi技术培育抗黑条矮缩病水稻的方法

技术领域

本发明属于转基因植物的培育技术领域，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。

背景技术

水稻黑条矮缩病是一种由水稻黑条矮缩病毒(Rice Black-Streaked Dwarf Virus，RBSDV)引起的病毒病，主要以灰飞虱为传播介体。该病曾于20世纪60 年代广泛发生在我国华东诸省市，此后3年，由于麦田翻耕和早稻移栽等耕作方式的兴起，灭杀了第一代灰飞虱若虫，病害的初侵染受阻，发病面积逐年下降。80年代后，由于扩种小麦，又给本病初侵染创造了有利的寄主条件，致使本病在90年代中期回升流行，在浙江、上海、江苏、安徽、江西和福建省北部等长江中下游地区广泛发生，造成严重的经济损失。近年来，随着耕作制度和栽培方式的变化、冬季气候变暖和感病品种的大面积推广，水稻黑条矮缩病在江苏、浙江、江西和福建大规模发生。目前，对水稻黑条矮缩病的防治主要是使用农药防治传毒介体灰飞虱，但由于介体昆虫种群数量大，防治效果不佳。

众所周知，培育抗病品种是减轻农作物病虫害最为经济、有效、环保的途径。但目前尚没有筛选出对黑条矮缩病具有较好抗性的水稻品种，一旦黑条矮缩病大规模爆发，在没有抗黑条矮缩病新品种迅速推出的情况下，将会对水稻生产造成巨大经济损失。因此，筛选或创制抗黑条矮缩病种质资源是目前水稻黑条矮缩病品种改良最为迫切的课题。

RNA干扰(RNAi，RNA interference)是指在进化过程中高度保守的、有双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，是真核生物中一种普遍存在且非常保守的机制。由dsRNA介导的干扰现象作为细胞的一种防御机制可针对性地降解细胞内与之具有同源性的核酸(如病毒的核酸)，达到对病毒的抵抗，同时还调节细胞内编码基因的表达，为利用RNA介导的病毒抗性进行抗病毒基因工程的研究奠定了基础。目前，RNAi已经广泛用于农作物抗病抗虫种质资源的创制。

目前还未见利用RNAi技术培育抗黑条矮缩病水稻的报道。

发明内容

本发明的主要目的就是针对上述水稻黑条矮缩病的研究现状，提供一种利用RNAi技术培育抗黑条矮缩病水稻的方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种利用RNAi技术培育抗黑条矮缩病水稻的方法：

以SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列作为抗水稻黑条矮缩病的目的基因序列，分别以下述1对引物F1/R1进行PCR扩增，扩增得到黑条矮缩病病毒S8部分片段序列，设计上下游引物5’端引入限制性内切酶位点BamH I和Spe I，酶切位点外侧添加4个保护碱基以保证酶切完全，引物序列如下：

F1: aaaaGGATCCACCTGTTTGGGCTTCTCA;（SEQ ID NO.2）

R1: aaaaACTAGTAACCTGCCATAATCATCAC; （SEQ ID NO.3）

将得到的目的基因序列经限制性内切酶BamH I和Spe I酶切形成粘性末端，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体p1022，于1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，连接克隆入p1022载体中，形成含正反向重复目的片段的中间载体p1022-S8-2；

用限制性内切酶分别酶切中间载体 p1022-S8-2，以及植物表达载体p1301UbiNos，电泳回收目的条带后将含正反向重复序列的目的片段连接到p1301UbiNos载体中，即为构建成功的植物表达载体p1301UbiNos-S8；

将植物表达载体 p1301UbiNos-S8，利用农杆菌介导法分别转入水稻品种的胚性愈伤组织，通过潮霉素筛选、分化、生根壮苗，获得转基因植株。

本发明所说的方法，具体步骤如下：

(1) 水稻黑条矮缩病毒S8部分片段RNAi载体的构建

1) 分别以下述F1/R1为引物，水稻黑条矮缩病病毒总RNA为模板，进行PCR扩增获得序列如SEQ ID NO.1所示的述的S8部分片段序列，再将S8部分片段分别克隆到pMD18-T，得pMD-S8；

2) 构建含反向重复序列的中间载体p1022-S8-2

① 构建含正向序列的中间载体p1022-S8-1

将pMD-S8和p1022经BamH I和Spe I酶切获得的片段进行连接，分别得到p1022-S8-1；

② 构建含反向重复序列的中间载体p1022-S8-2

将①中得到的含正向序列的中间载体 p1022-S8-1用限制性内切酶酶Bgl II和Xba I进行酶切，回收酶切的目的条带，将其与BamH I和Spe I酶切pMD-S8获得的S8基因序列进行连接，得到含反向重复目的片段的中间载体，命名为p1022-S8-2；

③ 构建含反向重复序列的表达载体p1301UbiNos-S8

BamH I和Sac I双酶切含反向重复目的片段的中间载体p1022-S8-2，用同样的限制性内切酶酶切植物表达载体p1301UbiNos，分别回收反向重复序列和植物表达载体片段， T4 DNA连接酶连接，得到的阳性克隆分别为p1301UbiNos-S8；

(2) 将植物表达载体p1301UbiNos-S8，利用农杆菌介导法分别转入水稻胚性愈伤组织，通过潮霉素筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。

经过多代自交、分子检测和抗性鉴定，表明所获得的转基因株系对水稻黑条矮缩病具有较好抗性。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明方法利用RNAi技术，可培育出具有优良抗黑条矮缩病的转基因水稻株系，显著增强水稻对黑条矮缩病的抗性，提高其产量和经济效益。

附图说明

图1 为植物表达载体p1301UbiNos。酶切位点依次为BamH I，Spe I，Kpn I和Sac I。

图2 为中间载体p1022，其多克隆位点区插入了一段内含子，酶切位点依次为BamH I，Kpn I，Xba I，Bgl II和Sac I。

图3 为PCR扩增S8基因目的片段的电泳检测结果图：1，DL,2000分子量标记；2-4，以表现黑条矮缩病症状的感病水稻植株mRNA为模板扩增的S8基因片段。

图4 为含S8基因片段正向序列中间载体p1022-S8-1用BamH I和Spe I双酶切鉴定电泳检测结果图：1，DL,2000分子量标记；2-4，p1022-S8-1用BamH I和Spe I双酶切，其中，2为阴性，3-4为阳性。

图5 为含S8基因片段反向重复序列中间载体p1022-S8-2用BamH I和Sac I双酶切鉴定电泳检测结果图：1-2，p1022-S8-2用BamH I和Sac I双酶切；3，DL,2000分子量标记。

图6 为含S8基因片段反向重复序列表达载体p1301UbiNos-S8用BamH I和Sac I双酶切鉴定电泳检测结果图：1-3，p1301UbiNos-S8用BamH I和Sac I双酶切；4，DL,2000分子量标记。

图7 为转基因植株的潮霉素基因PCR鉴定：1-6，部分转基因植株；7-8，阴性对照；9，阳性对照；10，DL,2000分子量标记。

图8 为实施例3中，转基因株系和对照接毒后黑条矮缩病的发病率。发病率为3次重复的平均值。不同平均数后的星号表示差异显著水平，**表示0.01水平差异显著。

图9 为实施例4中，半定量RT-PCR检测接毒鉴定的转基因株系及对照中目标基因表达水平：1，DL,2000分子量标记；2，未接种武运粳7号植株；3-4，接种武运粳7号植株；5-8，分别为RNAi1-RNAi4转基因株系。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。

质粒p1022和p1301UbiNos申请人保存，自申请日起向公众发放20年。

实施例1

本实施例利用RNAi技术培育抗黑条矮缩病水稻的方法，包括下述主要步骤：

(1)、水稻黑条矮缩病毒S8基因片段RNAi载体的构建

1) 利用PCR扩增获得如SEQ ID NO.1所述的目的基因序列

根据NCBI数据库中的水稻黑条矮缩病毒基因组序列信息，选取条纹病毒S8基因522bp碱基序列作为水稻抗黑条矮缩病的目的基因序列，分别命名为S8-522，其核苷酸序列从左至右从5’端至3’端碱基组成分别如SEQ ID NO.1所述。

具体步骤如下：

① 病毒总RNA的提取

选取水稻黑条矮缩病病株的叶片约200mg剪成碎片放入研钵中，在液氮冷却条件下研磨至细粉，转入1.5ml离心管，加入0.5ml预冷的Trizol提取液震荡摇匀，5 min后加入0.5ml氯仿，再剧烈震荡离心管5min，在8℃，12000g条件下，离心15min，离心后的溶液分为两层，将上层液体转移入1.5ml的干净离心管，加入0.5ml异丙醇摇匀，沉淀10min，然后在8℃，12000g条件下离心10min。

② 利用PCR扩增S8基因片段

扩增体系为，每50μL中含有：

2×RT-PCR mix	25 μL；
		AMV/Taq	1.5 μL；
RNase抑制剂(40u/μL)	0.5μL；
		1μg RNA	2 μL；
F1/R1	2 μL；
		无核酸酶的双蒸水至总体积	50 μL。

扩增程序为：

50℃，30min；

94℃，2min；

94℃，30sec；52℃，30sec；72℃，2min；30个循环；

72℃，10min。

扩增得到目的基因序列；

将扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离(图3)、回收和纯化，得到纯化的回收产物。

③ 连接转化

A. 回收产物连接到pMD18-T

反应体系如下：pMD18-T(Takara，大连) 载体1μL，10×连接酶缓冲液1μL，T₄ DNA连接酶350U，回收PCR产物加至终反应体积10μL；16℃连接16小时，得到连接产物；

B. 转化大肠杆菌DH5α

大肠杆菌感受态细胞的制备：

a. 挑取无抗生素平板上的大肠杆菌单菌落接种于2ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；

b. 按1%的接种量接种于10ml新鲜LB培养液中，37℃剧烈振荡培养至OD600=0.4~0.6；

c. 将菌株移到无菌的50ml离心管中，置冰上10min，4℃下4,000g离心10min，倒出培养液，

用无菌滤纸尽量吸干；

d. 加入10ml预冷的无菌0.1mol/L CaCl₂悬浮沉淀，置冰上30min。同法离心，弃尽上清；

e. 沉淀以1ml预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬，分装成小份，4℃保存备用。

转化步骤如下：

a. 在50μL感受态细胞中加入上述步骤A中获得的连接产物2μL，轻轻旋转以混匀内溶物，冰浴30 min;

b. 将离心管放至42℃的水浴中90 sec。快速将管转移到冰浴中;

c. 每管加800μL LB液体培养基，37℃培养箱中45 min;

d. 取200μL转化的感受态细胞，转移到含对应选择抗生素的LB固体培养基上，将菌液涂满整个平板表面;

e. 封好培养皿倒置于37℃培养12~16h。

④ 阳性克隆筛选

以前述步骤③中获得的克隆为模板，以下述引物扩增目的基因序列：

D1F: ACCTGTTTGGGCTTCTCA; （SEQ ID NO.4）

D1R: AACCTGCCATAATCATCAC; （SEQ ID NO.5）

A. 挑取培养基平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB 液体培养基中37℃、

220r/min 振荡培养12小时；

B. 以菌液为模板进行PCR 扩增，反应体系如下：

扩增体系为，每25μL 中含有：

10×PCR buffer	25 μL；
		dNTPs	2 μL；
Mg2+	2 μL；
		模板DNA	2 μL；
D1F/D1R	1 μL；
		双蒸水至总体积	25 μL。

C. PCR 反应扩增程序为：

94℃，5min ；

94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s；30个循环；

72℃，5min；10℃保温；

将得到的扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，观察条带有无，若没有目的条带，则为阴性克隆，反之则为阳性，阳性克隆命名为pMD-S8；

D. 测序：通过测序确定扩增得到的序列与目的基因序列相一致。

2) 构建含反向重复序列的中间载体p1022-S8-2

① 构建含正向序列的中间载体p1022-S8-1

以上述步骤1)中获得的阳性克隆pMD-S8及中间载体p1022（Planta；The WRKY transcription factor OsWRKY78 regulates stem elongation and seed development in rice，06 May 2011）(图2)为模板，以限制性内切酶BamH I和Spe I进行酶切，酶切体系为：

质粒DNA	10 μL；
		10×Buffer	3 μL；
BamH I	2.5 U/1μL；
		Spe I	2.5 U/1μL；
双蒸水至总体积	3μL。

37℃反应4小时。

将pMD-S8经BamH I和Spe I酶切获得目的基因序列(SEQ ID NO.1)，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体p1022，于1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带。进行连接反应，反应体系如下：

p1022中间载体1μL，10×连接酶缓冲液1μL，T4 DNA连接酶350U，回收S8基因产物7μL，加至终反应体积10μL；16℃连接12小时，得到连接产物，转化大肠杆菌DH5α。

阳性克隆筛选：

挑取培养基平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB 液体培养基中37℃、220r/min 振荡培养16小时；抽取质粒进行酶切鉴定(图4)，酶切反应体系如下：

质粒DNA	10 μL；
		10×Buffer	3 μL；
BamH I	2.5 U/1μL；
		Spe I	2.5 U/1μL；
双蒸水至总体积	30μL。

37℃反应4小时。

将得到的酶切产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，观察条带有无，若有目的条带，则为阳性克隆，命名为p1022-S8-1；

② 构建含反向重复序列的中间载体p1022-S8-2

将①中得到的含正向序列的中间载体 p1022-S8-1用限制性内切酶酶Bgl II和Xba I进行酶切，酶切反应体系如下：

质粒DNA	10 μL；
		10×Buffer	3 μL；
Bgl II	2.5 U/1μL；
		Xba I	2.5 U/1μL；
双蒸水至总体积	30μL。

37℃反应4小时。

于1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，将其与BamH I和Spe I酶切pMD-S8获得的S8基因序列(SEQ ID NO.1)进行连接。产物的回收、纯化、连接和转化与pMD-S8获得过程相同。

阳性克隆筛选：

挑取培养基平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB 液体培养基中37℃、220r/min 振荡培养16小时；抽取质粒进行酶切鉴定，酶切反应体系如下：

质粒DNA	10 μL；
		10×Buffer	3 μL；
BamH I	2.5 U/1μL；
		Sac I	2.5 U/1μL
双蒸水至总体积	30μL。

37℃反应4小时。

对酶切鉴定为阳性的克隆进行测序，完全正确的即为含反向重复目的片段的中间载体，命名为p1022-S8-2(图5)。

③ 构建含反向重复序列的表达载体p1301UbiNos-S8

BamH I和Sac I双酶切含反向重复目的片段的中间载体p1022-S8-2，30μL 酶切体系为：

质粒DNA	15 μL；
		10×Buffer	3 μL；
BamH I	2.5 U/1μL；
		Sac I	2.5 U/1μL；
双蒸水至总体积	30μL。

37℃温育3小时。

BamH I和Sac I双酶切植物表达载体p1301UbiNos (图1) （Yong Zhou et al,Deletion in a Quantitative Trait Gene qPE9-1 Associated With Panicle Erectness Improves Plant Architecture During Rice Domestication; the Genetics Society of America, 315–324 (September 2009)）(Fine mapping and cloning of MT1, a novel allele of D10, Natural Science 19 (2009) 1683–1689)，30μL 酶切体系如下：

质粒DNA	15 μL；
		10×Buffer	3 μL；
BamH I	2.5 U/1μL；
		Sac I	2.5 U/1μ；
双蒸水至总体积	30μL。

37℃温育3小时。

酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后分别回收反向重复序列和植物表达载体片段，所有操作按说明书进行；T4 DNA连接酶连接，10μL 连接体系为：10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL，正反向重复序列5μL，植物表达载体的大片段2μL，T4 DNA连接酶350U，ddH₂O加至终反应体积10μL；16℃连接12h。

阳性克隆筛选：

挑取培养基平板上生长良好的单菌落，在含有卡那霉素的LB 液体培养基中37℃、220r/min 振荡培养12小时；抽取质粒进行酶切鉴定(图6)，酶切反应体系如下：

质粒DNA	10 μL；
		10×Buffer	3 μL；
BamH I	2.5 U/1μL；
		Sac I	2.5 U/1μL；
双蒸水至总体积	30μL。

37℃温育3小时。

经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测含有目的片段大小的条带，即为构建成功的植物表达载体，在本发明中命名为p1301UbiNos-S8。

(2)、农杆菌介导法转化水稻胚性愈伤组织及植株的再生

1)植物表达载体p1301UbiNos-S8转化农杆菌：

① 农杆菌感受态的制备

A. 接种农杆菌EHA105单菌落于50ml液体YEB培养基中，28℃，220-250rpm震荡培养至OD600为0.5左右，冰浴30min，5,000rpm离心5min，收集菌体并用10ml 0.5mol/L CaCl2悬浮；

B. 再次离心(同上)，菌体悬浮于1ml 20mmol/L CaCl2溶液；

C. 取50ul菌液分装到1.5ml离心管中，用液氮迅速冷冻，并保存于-70℃冰箱中备用。

② 植物表达载体p1301UbiNos-S8转化农杆菌：

A.取0.5-1.0ug的DNA加入到50ul冰上解冻的菌液中，轻轻混合冰浴30min，并在液氮中迅速冷冻1min；

B. 在37℃水浴中融化，加1mlYEB液体培养基，28℃轻轻摇动培养2-4h；

C. 6,000rpm离心，倒去大部分上清液，剩50ul左右，悬浮菌体；

D. 涂布在含有50 ug/ml卡那霉素(Kan)的YEB培养基上，28℃培养到形成菌落。

③ 阳性克隆的鉴定：

挑取培养基平板上生长良好的单菌落，在含有卡那霉素的LB 液体培养基中37℃、220r/min 振荡培养12小时，以菌液为模板进行PCR 扩增，反应体系及扩增程序同上述实施例1中(1)1)⑷。

2)水稻胚性愈伤组织的诱导

选取饱满无虫害的水稻(武运粳7号)成熟种子去壳后，用70%乙醇处理1min，蒸馏水冲洗3次，再用1.5%NaClO浸泡20min，重复一次，蒸馏水冲洗多次，取出放在滤纸的培养皿上凉干。将成熟种子接种于诱导培养基诱导愈伤组织。25℃黑暗条件下培养2周，取盾片来源的愈伤组织接种在继代培养基上，在经几次继代后，选取1-2mm致密的颗粒性好颜色鲜艳的愈伤组织作为农杆菌的转化材料。

3)农杆菌侵染

将含有目标载体p1301UbiNos-S8的农杆菌接种到含50mg/L卡那霉素的YEB培养基，于28℃培养2天；挑取单个菌落于含相应抗生素的1mL YEB培养基中，28℃、225r/min 振荡培养12h，再将其加入含相应抗生素的50mL培养基扩大培养至OD600＝0.5；4℃、4000r/min 离心5min收集菌体，用等体积的液体浸染培养基悬浮；将待转化水稻的愈伤组织分别浸入含AS的浸染培养基，浸染20min；

4)共培养：

取出愈伤组织，铺于放有无菌纸的培养皿上吸干菌液后转移到共培养培养基上(培养基表面铺一张无菌滤纸)，适当风干后于25℃，暗培养2～3天。

5)抗性愈伤组织的筛选

将共培养后的愈伤组织取出放在滤纸上干燥20min，经干燥处理过的愈伤组织转移到含有50mg/L 潮霉素和400mg/L头孢霉素的培养基上，进行选择培养。10天后挑选出幼胚盾片处新长出的愈伤组织，转到新鲜筛选培养基上继续筛选10天。

6)转基因植株的再生

MS盐分和维生素，0.3g/L酪蛋白水解物，30g/L蔗糖，2mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA，0.2mg/L玉米素(Zeatin)，0.5mg/L KT，2.5g/L植物胶，pH5.8，50mg/L 潮霉素，200mg/L头孢霉素，25℃光照培养16小时/d，即得到T₀代转基因植株。

经分子检测和田间接种鉴定，确定将干扰载体转入到水稻品种武运粳7号中。

实施例2

本实施例为转基因植株的分子检测

(1)、水稻基因组DNA的提取

取T₀代转化植株幼嫩叶片，用2×CTAB法(2％CTAB，1.4mol/L NaCl，100mmol/L Tris-Cl，20mmol/L EDTA，pH 8.0)提取水稻基因组DNA。

将约0.1g的水稻叶片放置于2 mL的小离心管中，液氮冷冻后用竹签捣成粉末；加入700μL经65℃预热的2×CTAB提取缓冲溶液，充分混匀后置于65℃水浴30min，每隔5 min混匀一次；水浴完毕后，在每个离心管中加入700μL氯仿，上下颠倒充分混匀，抽提5 min；10000 rpm，离心8 min，取上清液500μL转移入1.5 mL的小离心管中；加入500μL预先冷冻的异丙醇，混匀后冰上静置30 min；12000 rpm，离心5 min；弃尽上清，DNA沉淀用70%的酒精洗涤2次；弃尽洗涤液，DNA沉淀风干后溶于50μL的灭菌双蒸水中，于-20℃保存备用。

(2)、转基因植株的PCR检测

利用p1301UbiNos载体携带的潮霉素抗性基因的特异性引物，对T₀代植株DNA进行PCR扩增。引物序列如下：

D2F: GCTGTTATGCGGCCATTGTC; （SEQ ID NO.6）

D2R: GACGTCTGTCGAGAAGTTTC; （SEQ ID NO.7）

扩增体系为，每25μL 中含有：

10×PCR buffer	25 μL；
		dNTPs	2 μL；
Mg2+	2 μL；
		模板DNA	2 μL；
D2F/D2R	1 μL；
		双蒸水至总体积	25 μL。

PCR 反应扩增程序为：

94℃，5min ；

94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s ；30 个循环；

72℃，5min ；10℃保温；

将得到的扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测扩增结果(图7)。PCR检测结果表明，干扰载体已成功导入水稻中。

实施例3

本实施例为阳性株系抗病性鉴定

具体步骤为：

(1)、传毒介体昆虫灰飞虱的饲养

在秧池中播种感病品种武运粳7号，并罩上白色纱网。4月下旬从小麦、大麦试验田及田埂杂草丛中收集灰飞虱成虫放至秧池纱网中喂养。每天赶虫3次，以增加灰飞虱后代的带毒率。

(2)、转基因及对照株系的种植与接种

经过2代自交，获得T₂代转基因纯合系。将转基因株系与未转基因对照种子点播于秧板上，并用纱网隔离，株距为3cm，三次重复。三叶期时接入带毒灰飞虱，同时设不接虫对照。期间，注意水肥管理，杜绝喷洒任何杀虫剂，每天赶虫3次，使尽可能多的秧苗得到感染机会，25天后移栽至大田。

(3)、转基因及对照株系发病情况调查

本发明采用株系发病率(Infection Rate, IR)，即发生病症的株数与总株数之比，为抗性评价指标。水稻分蘖盛期统计发病率，以3次重复的发病百分率平均值作为表型进行统计。结果表明，转基因株系的发病率极显著低于对照(图8)。

实施例4

本实施例为半定量RT-PCR检测接病毒转基因株系及对照S8基因表达水平

(1)、引物设计

以水稻黑条矮缩病毒S8基因为模板，Actin为内参基因设计引物，引物序列如下：

D1F	ACCTGTTTGGGCTTCTCA（SEQ ID NO.2）
		D1R	AACCTGCCATAATCATCAC（SEQ ID NO.3）
ActinF	GATGACCCAGATCATGTTTG（SEQ ID NO.8）
		ActinR	GGGCGATGTAGGAAAGC（SEQ ID NO.9）

(2)、叶片总RNA的提取和反转录

选取转基因和对照植株的叶片约250mg剪成碎片放入研钵中，在液氮冷却条件下研磨至细粉，转入1.5ml离心管，加入0.5ml预冷的Trizol提取液震荡摇匀，5 min后加入0.5ml氯仿，再剧烈震荡离心管5min，在8℃，12000g条件下，离心15min，离心后的溶液分为两层，将上层液体转移入1.5ml的干净离心管，加入0.5ml异丙醇摇匀，沉淀10min，然后在8℃，12000g条件下离心10min。

反转录体系为，每20μL 中含有：

5×PrimeScript buffer	4 μL；
		PrimeScript® RT Enzyme Mix I	1 μL；
Oligo dT Primer(50 μM)	1 μL；
		Random 6 mers(100 μM)	1μL；
Total RNA	1 μL；
		RNase Free水至总体积	20 μL。

反转录反应条件如下：

37℃ 20 min；85℃ 5 sec。

(3)、接毒鉴定的转基因株系和对照S8基因的表达量

利用半定量RT-PCR 检测接毒鉴定的转基因植株及对照S8目的基因表达量，结果表明，在接种14天后，在对照植株中检测出病毒RNA，但在转基因植株没有检测到病毒RNA的积累(图9)。说明转基因株系能够通过RNAi的作用降解病毒的mRNA，从而减轻黑条矮缩病毒对水稻的危害。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一种利用RNAi技术培育抗黑条矮缩病水稻的方法

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 522

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 1

acctgtttgg gcttctcatt taatagctcg tatgaacgtt gaaaatgttt ctttaccatt 60

ggaaattagt tgtagtgcaa tcaatcccac tcaacatttt gcagttatag ttcttaaaaa 120

tgctaaaacc aatgtgacaa gaggtagatt ctggaccgtg ttagacgatg aacgcgactt 180

tttatctgtt aaaaccgaca ttcaagcgat tgaatttgaa cgtaattccg taaccactgc 240

tggcaattta agacatgttt taaacaattg cttaacatta ggcgaaccct tcgccttcga 300

cccacttgat tattctttta aacttaactt acttgaaaca gggttatctc cattagatga 360

cgttgtgact attagattga aagatttgct gcgtgtgttt aaagaaggac aggatgttca 420

aattattggt aataaaggag taggtaagtc tgaaattggc gcaatgttag cagaacgata 480

tcctcatctt ttagttgttg atagtgatga ttatggtagg tt 522

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acctgtttgg gcttctca 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aacctgccat aatcatcac 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acctgtttgg gcttctca 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aacctgccat aatcatcac 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctgttatgc ggccattgtc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gacgtctgtc gagaagtttc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gatgacccag atcatgtttg 20

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gggcgatgta ggaaagc 17

Claims (2)

1.一种利用RNAi技术培育抗黑条矮缩病水稻的方法，其特征在于：

分别以下述1对引物F1/R1进行PCR扩增，从水稻基因中扩增得到黑条矮缩病病毒S8部分片段，其序列如SEQ ID NO.1所示：

F1: aaaaGGATCCACCTGTTTGGGCTTCTCA;

R1: aaaaACTAGTAACCTGCCATAATCATCAC;

将得到的目的基因序列经不同限制性内切酶酶切形成粘性末端，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体p1022，于1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，连接克隆入p1022载体中，形成含反向重复目的片段的中间载体p1022-S8；

用限制性内切酶分别酶切中间载体 p1022-S8，以及植物表达载体p1301UbiNos，电泳回收目的条带后将含正反向重复序列的目的片段连接到p1301UbiNos载体中，即为构建成功的植物表达载体p1301UbiNos-S8；

将植物表达载体p1301UbiNos-S8导入农杆菌，利用农杆菌介导法分别转入水稻的胚性愈伤组织，通过潮霉素筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。

2.根据权利要求1所述的利用RNAi技术培育抗黑条矮缩病水稻的方法，其特征在于其步骤如下：

(1) 包含水稻黑条矮缩病病毒S8部分片段RNAi载体的构建

1) 分别以下述F1/R1为引物，水稻黑条矮缩病病毒总RNA为模板，进行PCR扩增获得序列如SEQ ID NO.1所示的述的S8部分序列，再将目的序列分别克隆到pMD18-T，得pMD-S8；

2) 构建含反向重复序列的中间载体p1022-S8-2

① 构建含正向序列的中间载体p1022-S8-1

将pMD-S8和p1022经BamH I和Spe I酶切获得的片段进行连接，分别得到p1022-S8-1；

② 构建含反向重复序列的中间载体p1022-S8-2

将①中得到的含正向序列的中间载体 p1022-S8-1用限制性内切酶酶BglII和Xba I进行酶切，回收酶切的目的条带，将其与BamH I和Spe I酶切pMD-S8获得的S8部分片段进行连接，得到含反向重复目的片段的中间载体，命名为p1022-S8-2；

③ 构建含反向重复序列的表达载体p1301UbiNos-S8

BamH I和Sac I双酶切含反向重复目的片段的中间载体p1022-S8-2，BamH I和Sac I双酶切植物表达载体p1301UbiNos，分别回收反向重复序列和植物表达载体片段，T4 DNA连接酶连接，得到的阳性克隆命名为p1301UbiNos-S8；

(2) 将植物表达载体p p1301UbiNos-S8，利用农杆菌介导法分别转入水稻胚性愈伤组织，通过潮霉素筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。

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