CN111172308A - 一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1‑US6‑11‑5的检测方法，属于生物技术领域。本发明是利用转化体WLJ1‑US6‑11‑5中含外源基因S6RNAi的T‑DNA表达框在水稻染色体上插入片段序列和插入片段RB端旁侧特异序列SEQ ID NO:1，并基于SEQ ID NO:1序列，建立的特异性PCR扩增鉴定技术。PCR所用正向载体引物US‑W1依据SEQ ID NO:1中1‑1178位序列设计，反向基因组引物US‑W2依据SEQ ID NO:1中1179‑2000位序列设计，正向基因组引物US‑W3依据T‑DNA插入位置上游528bp处设计。根据是否扩增得到US‑W1 US‑W2引物组合M、US‑W3 US‑W2引物组合N的目标片段判断株系中是否含外源S6RNAi基因，该PCR方法可作为鉴定转基因水稻品系WLJ1‑US6‑11‑5及该品系的衍生系的有效手段。

Description

一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5的 检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及鉴定S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5及其衍生品系的检测方法及其所依赖的转化体特异序列。

背景技术

水稻是世界主要粮食作物之一，是世界上近一半以稻米为主食的人口的主要粮食作物。水稻也是我国最为重要的粮食作物之一，水稻在生产上的安全与否对于保障我国粮食生产安全起着非常重要的作用。水稻病害是影响我国实现水稻稳产、高产、优产目标的重要因素之一。水稻黑条矮缩病是通过灰飞虱作为其主要传播媒介的一种水稻病毒病，它是由水稻黑条矮缩病毒引起。水稻一旦受该病毒侵染后，基本无法防治，因此黑条矮缩病也被称为水稻上的“癌症”，严重发生时可造成巨大的产量损失。由于缺乏高抗资源和高效的抗病鉴定方法，使得通过传统育种手段难以培育高抗病品种。以转基因技术为核心的分子育种设计技术可以将水稻自身携带的抗性基因以及其他物种的抗性基因导入水稻中，在水稻中过量表达，从而使现有品种获得高抗病特性。目前已经有多个转基因水稻品系获准进入环境释放或生产试验。对转基因作物的有效监管是转基因作物安全利用的重要保障。转基因作物外源序列插入片段旁侧序列是转基因植物品系的最重要的分子身份证。因此，依据外源插入片段的旁侧序列是建立转基因作物品系特异性检测方法的重要技术资料。

WLJ1-US6-11-5是江苏省扬州大学研发的抗水稻黑条矮缩病的具有广泛应用前景的转基因水稻品系[邹捷，抗黑条矮缩病转基因水稻育种新材料的创制(D)，扬州大学，2016]。利用插入位点旁侧序列特异性地鉴定转基因品种(品系)是目前鉴定转基因作物最可靠最特异的检测方法，是准确鉴别区分同一转化体及其衍生品系的方法。

利用插入位点旁侧序列鉴定转基因品系，该方法己在鉴定Bt汕优63、克螟稻、科丰8号和科丰6号品系中建立。WLJ1-US6-11-5是最新研发的抗黑条矮缩病转基因水稻品系，尚无任何相关转基因水稻WLJ1-US6-11-5外源基因插入片段的旁侧序列文章报道和专利。

发明内容

针对现有问题的不足，本发明的目的是提供一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5的检测方法，以提高区分同一转化体及其衍生品系的鉴别准确度。

为实现以上技术目的，本发明利用插入位点旁侧序列特异性地鉴定转基因品种(品系)是目前鉴定转基因作物最可靠最特异的检测方法，采用的具体技术方案如下。

一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5的检测方法，利用转化体WLJ1-US6-11-5中含外源基因S6RNAi的T-DNA表达框在水稻染色体上插入片段序列和插入片段RB端旁侧序列SEQ ID NO:1，并基于SEQ ID NO:1序列，建立特异性PCR扩增引物；再利用特异性PCR扩增引物进行检测。

所述特异性PCR扩增引物包括：

正向载体引物US-W1:5'-CTTAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTT-3'；

反向基因组引物US-W2:5'-GGTCGAACGAATCAAACATTTTAATAGC-3'；

正向基因组引物US-W3:5'-CAGCAGGTTTCAGCCTTGGTTCT-3'，

所述的水稻品系为WLJ1-US6-11-5。

所述正向载体引物US-W1为依据SEQ ID NO:1中1-1178位序列设计的正向载体引物；

所述反向基因组引物US-W2为依据SEQ ID NO:1中1179-2000位序列设计的反向基因组引物；

所述正向基因组引物US-W3为依据T-DNA插入位置上游528bp处设计的正向基因组引物；

所述正向载体引物US-W1和反向基因组引物US-W2组合得引物组合M，扩增出的条带大小为405bp的405bp条带；正向基因组引物US-W3和反向基因组引物US-W2组合得引物组合N，扩增出的条带大小为903bp的903bp条带；

用引物组合M和引物组合N分别扩增水稻基因组DNA：如果只扩增出所述405bp条带，则表示该植株为含外源S6RNAi基因的纯合体；如果同时能扩增出所述405bp条带和所述903bp条带，则表示该植株为含外源S6RNAi基因的杂合体；如果只扩增出所述903bp条带，则表示该植株不含外源S6RNAi基因。

作为本申请的优选技术方案，所述水稻品系WLJ1-US6-11-5包括亲本、衍生品系或品种。

作为本申请的优选技术方案，所述PCR反应体系为：模板DNA 2.0μL、10×PCRBuffer 2.0μL、dNTP 0.4μL、正向引物0.4μL、反向引物0.4μL、Taq酶0.2μL、加ddH₂O至20μL。

作为本申请的优选技术方案，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性45S，58℃退火45S，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸5min。

本领域技术人员熟知，上述特异性PCR引物可通过人工序列合成制备得到，存在状态可以是粉状、或溶液状的。

本发明还保护用于水稻品系WLJ1-US6-11-5纯杂合鉴定的试剂盒，包括上述的特异性PCR扩增引物。

其中，所述试剂盒包括用于进行PCR扩增的常规试剂，和/或用于进行电泳检测的常规试剂。

有益效果

本发明提供了转基因水稻WLJ1-US6-11-5外源基因插入位点的右边界旁侧序列，以及基于这段序列的转化事件特异检测方法。本发明证实，通过本发明的方法/特异性PCR引物组能够获知WLJ1-US6-11-5的纯杂合类型、是否含有外源S6RNAi基因，为转基因水稻品系WLJ1-US6-11-5及其衍生系提供了分子特征和特异的检测手段。

附图说明

图1：转化载体pMF-Ubi-S6-35SpolyA的T-DNA区域结构示意图。

图2：不同限制性内切酶条件下水稻WLJ1-US6-11-5RB边界反向PCR扩增结果图；US-11-5：WLJ1-US6-11-5；M:DL2000Marker。

图3：水稻WLJ1-US6-11-5外源基因插入位点右边界旁侧序列的特异PCR检测引物设计示意图；US-W1、US-W2和US-W3表示用于基因分型的引物；RB和LB分别表示T-DNA的右边界和左边界。

图4：水稻WLJ1-US6-11-5外源基因插入旁侧序列特异性定性PCR检测电泳图，正向载体引物US-W1和反向基因组引物US-W2组合得引物组合M，扩增得到405bp条带；正向基因组引物US-W3和反向基因组引物US-W2组合得引物组合N，扩增得到903bp条带，分别采用引物组合M和引物组合N对WLJ1-US6-11-5、非转基因对照WYJ24以及WLJ1-US6-11-5/武陵粳1号的F₂代分离群体进行的PCR鉴定，WLJ1-US6-11-5只扩增出405bp条带，非转基因对照WYJ24只扩增出903bp条带，WLJ1-US6-11-5/武陵粳1号的F₂分离群体出现只扩增出405bp条带的含外源S6RNAi基因的纯合体、同时扩增出405bp和903bp条带的含外源基因的杂合体，以及只扩增出903bp条带的不含外源基因的单株；泳道1：WLJ1-US6-11-5；泳道2：武陵粳1号；泳道3-12：从WLJ1-US6-11-5/武陵粳1号的F₂代分离群体中随机抽取的10个F₂单株；M:DL1000Marker。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。

转基因水稻WLJ1-US6-11-5所用载体T-DNA区域结构示意图见图1，用于转化目的基因S6RNAi基因和选择标记基因HPT分别位于不同的二个独立T-DNA区域，其中一个T-DNA区含有35S启动子和选择标记基因HPT；另一个T-DNA区含有Ubi启动子P-Ubi，以及目的基因S6RNAi。

本发明采用常规方法提取转基因水稻WLJ1-US6-11-5 DNA，利用反向PCR方法扩增得到RB旁侧序列2000bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列包括了转化载体pMF-Ubi-S6-35SpolyA的部分序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO:1中1-1178位的核苷酸序列完全相同，该序列还包括水稻基因组序列，位于水稻第6号染色体(GeneBank ID:CP018162.1)的7692364-7693185位，其核苷酸序列与SEQ ID NO:1中1179-2000位的核苷酸序列完全相同。

试验材料

1.植物材料：转基因水稻品系WLJ1-US6-11-5、武陵粳1号为常规水稻

2.试剂：限制性内切酶(Takara)，Taq DNA Ploymerase(TIANGEN)，PCR扩增引物(南京擎科生物科技有限公司)，10X Loading Buffer(TaKaRa)，西班牙琼脂槽(BIOWEST)。

3.实验仪器：高速离心机(Eppenddorf 5424R)，PCR仪(Thermo FisherScientific 2720)，电泳仪(北京市六一仪器厂DYY-10C)，凝胶成像系统(Tanon 2500)，水平电泳槽(Bio-Rad)，移液器(Eppendorf)。

实施例1转基因水稻WLJ1-US6-11-5外源基因插入位点旁侧序列克隆

反向PCR方法是克隆T-DNA插入片段侧翼序列非常有效的方法，我们采用反向PCR方法克隆转基因水稻WLJ1-US6-11-5的外源基因插入位点旁侧序列。包括如下具体步骤：

一、水稻DNA的提取

采用CTAB法提取水稻叶片总DNA，具体步骤如下：

1.取1-2g新鲜水稻叶片，剪入2mL离心管中，加入钢珠，将离心管放入液氮中冷冻后再用震荡粉碎机将叶片打成粉末状，迅速将钢珠倒出。

2.加65℃预热的1.5％CTAB 600μL，65℃水浴，每5分钟摇晃一次，30min后取出冷却，加三氯甲烷溶液600μL。

3.摇匀30min，12000rpm离心8min。

4.取约500μL上清，加同体积预冷异丙醇，在-20℃放置1-3h(放前需摇晃)。

5. 12000rpm离心8min。

6.弃上清，加入75％500μL乙醇进行清洗。

7. 12000rmp离心4min，弃上清。

8.晾干后加50μL ddH₂O充分溶解，放置4℃备用。

二、限制性内切酶消化基因组DNA

根据T-DNA的右边界序列选择合适的酶切位点EcoRI、BamHI和XhoI，然后用这些内切酶分别消化基因组DNA，酶切体系：DNA样品1μg，1倍缓冲液Buffer 2μL，限制性内切酶1μL，补灭菌ddH₂O到20μL；37℃酶切4小时，之后80℃10分钟终止反应，电泳检测酶切效果。

三、回收酶切后DNA

利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN)从琼脂糖凝胶中回收酶切产物，回收步骤参考试剂盒说明书。

四、连接

连接体系及反应条件：DNA 2μL，T4 DNA连接酶1μL，10倍T4连接酶buffer 4μL，补灭菌ddH₂O到20μL；16℃水浴9-12个小时，65℃水浴10min灭活T4连接酶活性。

五、旁侧序列扩增

在T-DNA的右边界设计正向引物US-W1，并分别在EcoRI，BamHI和XhoI酶切位点下游附近设计反向引物US-Z1、US-Z2和US-Z3，引物序列见表1，用US-W1分别与US-Z1、US-Z2和US-Z3配对扩增上述3中连接片段，PCR反应体系见表2。

PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性45S，58℃退火45S，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸5min。

表1.用于反向PCR和WLJ1-US6-11-5特异性鉴定的引物

表2. PCR反应体系(20μL)

六、PCR产物电泳及回收

用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN)从琼脂糖凝胶中回收PCR扩增产物，用于序列测定，电泳图详见附图2。

七、PCR产物测序及分析

对上述6中回收的PCR扩增产物送南京擎科生物科技有限公司测序，测序结果在NCBI(http://www.ncbi.n1m.nih.gov/)上进行b1ast比较序列的同源性。旁侧序列之间以及旁侧序列与载体骨架序列之间的比较使用Dnastar软件中MegAlign。结果显示T-DNA插入位置为水稻基因组中第6条染色体(GeneBank ID:CP018162.1)的7692364-7693185位。

实施例2基于转基因水稻品系WLJ1-US6-11-5外源基因插入旁侧序列特异性PCR检测

为了验证引物US-W1、US-W2和US-W3在转基因水稻WLJ1-US6-11-5品系及其衍生系的检测效果，我们对WLJ1-US6-11-5/武陵粳1号的F₂代分离群体材料中随机选择的10个单株，采用US-W1 US-W2引物组合M和US-W3、US-W2引物组合N进行PCR扩增和电泳检测。包括如下具体步骤：

一、分离群体的获得

以转基因水稻WLJ1-US6-11-5品系，江苏省粳稻品种武陵粳1号，经杂交获得F₂群体，从F₂群体中随机挑选10株，以WLJ1-US6-11-5和武陵粳1号作为对照进行以下操作。

二、植物基因组DNA提取，同实施例1中"水稻DNA提取"。

三、基于转基因水稻品系WLJ1-US6-11-5外源基因插入旁侧序列的PCR检测

根据实施例1中测定的RB端旁侧序列及T-DNA插入位置上游基因组序列，分别在转化载体部分和水稻基因组序列部分设计引物US-W1、US-W2和US-W3，引物设计示意图见图3，引物命名及具体序列详见表1。

四、采用常规PCR方法扩增基因组DNA

以US-W1和US-W2组合得引物组合M，扩增出的条带大小为405bp的405bp条带；US-W3和US-W2组合得引物组合N，扩增出的条带大小为903bp的903bp条带；PCR反应体系见表2，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性45S，58℃退火45S，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸5min。扩增产物电泳检测。

五、扩增鉴定结果

分别采用引物组合M和引物组合N对WLJ1-US6-11-5、非转基因对照WYJ24以及WLJ1-US6-11-5/武陵粳1号的F₂代分离群体进行的PCR鉴定，WLJ1-US6-11-5只扩增出405bp条带，非转基因对照WYJ24只扩增出903bp条带，WLJ1-US6-11-5/武陵粳1号的F₂分离群体出现只扩增出405bp条带的含外源S6RNAi基因的纯合体、同时扩增出405bp和903bp条带的含外源基因的杂合体，以及只扩增出903bp条带的不含外源基因的单株。电泳图见附图4，表明本发明的鉴定方法是可靠的。

实施例3

本组实施例提供一种用于转基因水稻品系WLJ1-US6-11-5纯杂合鉴定的试剂盒。所述试剂盒包括实施例1所述的US-W1、US-W2和US-W3引物。

所述试剂盒还包括用于进行PCR扩增的常规试剂，和/或用于电泳检测的常规试剂。本领域技术人员根据本申请的记载，出于“转基因水稻品系WLJ1-US6-11-5纯杂合鉴定”的目的，合理选择本领域常规的用于PCR扩增的试剂，和/或电泳试剂。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5的检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2000

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtcgcatcc gtgtacgaac gctagcagca cggatctaac acaaacacgg atctaacaca 60

aacatgaaca gaagtagaac taccgggccc taaccatgga ccggaacgcc gatctagaga 120

aggtagagag gggggggggg ggaggacgag cggcgtacct tgaagcggag gtgccgacgg 180

gtggatttgg ggagatctgg ttgtgtgtgt gtgcgctccg aacaacacga ggttggggaa 240

agagggtgtg gagggggtgt ctatttatta cggcgggcga ggaagggaaa gcgaaggagc 300

ggtgggaaag gaatcccccg tagctgccgt gccgtgagag gaggaggagg ccgcctgccg 360

tgccggctca cgtctgccgc tccgccacgc aatttctgga tgccgacagc ggagcaagtc 420

caacggtgga gcggaactct cgagaggggt ccagaggcag cgacagagat gccgtgccgt 480

ctgcttcgct tggcccgacg cgacgctgct ggttcgctgg ttggtgtccg ttagactcgt 540

cgacggcgtt taacaggctg gcattatcta ctcgaaacaa gaaaaatgtt tccttagttt 600

ttttaatttc ttaaagggta tttgtttaat ttttagtcac tttattttat tctattttat 660

atctaaatta ttaaataaaa aaactaaaat agagttttag ttttcttaat ttagaggcta 720

aaatagaata aaatagatgt actaaaaaaa ttagtctata aaaaccatta accctaaacc 780

ctaaatggat gtactaataa aatggatgaa gtattatata ggtgaagcta tttgcaaaaa 840

aaaaggagaa cacatgcaca ctaaaaagat aaaactgtag agtcctgttg tcaaaatact 900

caattgtcct ttagaccatg tctaactgtt catttatatg attctctaaa acactgatat 960

tattgtagta ctatagatta tattattcgt agagtaaagt ttaaatatat gtataaagat 1020

agataaactg cacttcaaac aagtgtgaca aaaaaaatat gtggtaattt tttataactt 1080

agacatgcaa tgctcattat ctctagagag gggcacgacc gggtcacgct gcactgcagg 1140

catgcaagct tagattgtcg tttcccgcct tcagtttacg ttagtgcgtg cgcttatacg 1200

aacgtttcaa aaaggaatat ataatcgcaa ataaaataag atttacctgc tgatttttaa 1260

tcaccaatta aattcacaga ttaaagaaaa agtcatttaa gcgttagcgt ggttgacctg 1320

taagttagca taagctagaa accttctccg gttaaaaaaa agtatgttat tcattgtctt 1380

gccccaggtt caaatttcaa actgaatata tacgatctcc ataattataa gctgtgcgag 1440

gaagaagcgt ataatcaaat taaatcagat agtagctgta atatgactta gctgatattc 1500

taagtagtct tcttgtttca attaagctat taaaatgttt gattcgttcg accagcagtc 1560

tgtaataatt gaatatatct tctttgaaaa aaaatgctag aatgaattcc aaaatctatt 1620

tttcttaaaa aaaaaacctg gcgttccatt ttgtgcaggc tctgatttcc tcgaattctc 1680

gtgggccaac ttccatattg tgtttcaatc gatggtagca atccaattct tgtggattca 1740

tccagcccac tttacctgac ggactaacgg gcccaaaatt tctagataga aacggaccaa 1800

tacgcacccg tctcggagtc ggagtccgcg ccctgctcac gccaccgcca ccgcaattgg 1860

actccgagtc ggagcccgac tccgagtgcg gaaaggagga tcgcctcgat aaatgggccg 1920

ggcccgatgc ccgcgagcca tccatctccc gctccgcgcg cgcgttgcga atctccgcca 1980

tctcttctag acttctctcc 2000

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttagattgt cgtttcccgc cttcagtt 28

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtcgaacga atcaaacatt ttaatagc 28

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagcaggttt cagccttggt tct 23

Claims (6)

1.一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5的检测方法，其特征在于，利用转化体WLJ1-US6-11-5中含外源基因S6RNAi的T-DNA表达框在水稻染色体上插入片段序列和插入片段RB端旁侧序列SEQ ID NO: 1，并基于SEQ ID NO: 1序列，建立特异性PCR扩增引物；再利用特异性PCR扩增引物进行检测。

2.根据权利要求1所述的一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5的检测方法，其特征在于，所述特异性PCR扩增引物包括：

正向载体引物US-W1: 5'-CTTAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTT-3'；

反向基因组引物US-W2: 5'-GGTCGAACGAATCAAACATTTTAATAGC-3'；

正向基因组引物US-W3: 5'-CAGCAGGTTTCAGCCTTGGTTCT-3'。

3.根据权利要求2所述的一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5的检测方法，其特征在于，

所述正向载体引物US-W1为依据SEQ ID NO: 1中1-1178位序列设计的正向载体引物；

所述反向基因组引物US-W2为依据SEQ ID NO: 1中1179-2000位序列设计的反向基因组引物；

所述正向基因组引物US-W3为依据T-DNA插入位置上游528bp处设计的正向基因组引物；

所述正向载体引物US-W1和反向基因组引物US-W2组合得引物组合M，扩增出的条带大小为405bp的405bp条带；正向基因组引物US-W3 和反向基因组引物US-W2组合得引物组合N，扩增出的条带大小为903bp的903bp条带；

用引物组合M和引物组合N分别扩增水稻基因组DNA：如果只扩增出所述405bp条带，则表示该植株为含外源S6RNAi基因的纯合体；如果同时能扩增出所述405bp条带和所述903bp条带，则表示该植株为含外源S6RNAi基因的杂合体；如果只扩增出所述903bp条带，则表示该植株不含外源S6RNAi基因。

4.根据权利要求2所述的一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5的检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：模板DNA 2.0μL、10×PCR Buffer 2.0μL、dNTP0.4μL、正向引物 0.4μL、反向引物 0.4μL、Taq酶0.2μL、加ddH₂O至20μL。

5.根据权利要求2所述的一种转S6RNAi基因抗黑条矮缩病水稻品系WLJ1-US6-11-5的检测方法，其特征在于，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性45S，58℃退火45S，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸5min。

6.一种用于水稻品系WLJ1-US6-11-5纯杂合鉴定的试剂盒，包括权利要求2所述的特异性PCR扩增引物。

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