CN103667475B - 一种转Cry1Ab抗虫基因水稻品系mfb-MH86的检测方法 - Google Patents

一种转Cry1Ab抗虫基因水稻品系mfb-MH86的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种转Cry1Ab抗虫基因水稻品系mfb-MH86的检测方法。所述方法是转化体mfb-MH86中外源基因Cry1Ab表达框在水稻染色体上插入片段及其5’端旁侧特异序列SEQIDNO:1和3’端旁侧特异序列SEQIDNO:2，以及基于这2段序列建立的特异性PCR扩增鉴定技术。PCR所用LB端正向引物依据SEQIDNO:1中1-390位序列设计，反向引物依据SEQIDNO:1中391-2000位序列设计；PCR所用RB端正向引物依据SEQIDNO:2中1-1300位序列设计，反向引物依据SEQIDNO:2中1301-2000位序列设计。该PCR方法可作为特异性鉴定转基因水稻品系mfb-MH86及该品系的衍生系的有效手段。

Description

一种转Cry1Ab抗虫基因水稻品系mfb-MH86的检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种转Cry1Ab抗虫基因水稻品系mfb-MH86的检测方法及其所依赖的转化体特异序列。
背景技术
水稻是我国乃至世界最主要的粮食作物之一。水稻也是虫害发生较为严重的作物之一。我国水稻田间害虫有600多种上，其中分布广泛且为害较为严重的是二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫。据统计，每年我国由虫害造成的损失占水稻总产量的5％以上，高达一千万吨，每年用于水稻害虫防治的费用都在135亿元人民币以上。而在水稻品种及野生稻中没有抗鳞翅目害虫的种质资源可以利用。以转基因技术为核心的品种设计技术则可以将远缘物种的抗性基因导入水稻中，从而使现有品种获得高抗虫特性。目前已经有多个转基因水稻品系获准进入环境释放和生产性试验。对转基因作物的有效监管是转基因作物安全利用的前提和保障。转基因作物外源序列插入片段旁侧序列是转基因植物品系的最重要的分子身份证。因此，外源插入片段的旁侧序列是建立转基因作物品系特异性检测方法的重要技术资料。
mfb-MH86是福建省农业科学院生物技术研究所和中国科学院遗传与发育生物学研究所共同研发的抗二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟以及大螟的具有广泛应用前景的转基因水稻品系。利用插入位点旁侧序列特异性地鉴定转基因品种（品系）是目前鉴定转基因作物最可靠最特异的检测方法，是准确鉴别区分同一转化体及其衍生品系的方法。
利用插入位点旁侧序列鉴定转基因品系，该方法已在鉴定克螟稻、Bt汕优63、科丰6号和科丰8号品系中建立。mfb-MH86是最新研发的抗虫转基因水稻品系，尚无任何相关转基因水稻mfb-MH86外源基因插入片段的旁侧序列文章报道和专利。
发明内容
本发明的目的在于提供一种转Cry1Ab抗虫基因水稻品系mfb-MH86的检测方法，利用插入位点旁侧序列特异性地鉴定转基因品种（品系），根据转基因水稻品系mfb-MH86外源基因插入片段的旁侧序列特征提供了该转基因品系的特异性PCR检测方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
所述方法是转化体mfb-MH86中外源基因Cry1Ab表达框在水稻染色体上插入片段及其5’端旁侧特异序列SEQIDNO:1和3’端旁侧特异序列SEQIDNO:2，以及基于这2段序列建立的特异性PCR扩增鉴定技术。
所述的5’端旁侧特异序列为LB端旁侧序列，其序列如SEQIDNO:1所示；所述的3’端旁侧特异序列为RB端旁侧序列，其序列如SEQIDNO:2所示。
依据LB端旁侧序列设计的一对特异性引物为：
正向引物为B70-1F：5’-ATTGAAAGATGGGTGAAGGG-3’，
反向引物为Bb86-L3：5’-TCTTCATCTGAGCAAACATAAAC-3’。
所述的特异性引物：正向引物为依据SEQIDNO:1中1-390位序列设计，反向引物依据SEQIDNO:1中391-2000位序列设计。
依据RB端旁侧序列设计的一对特异性引物为：
正向引物为Bb86-R4：5’-TGTCTAACTACATCGTCTCTGCC-3’，
反向引物为B70-7R：5’-AAGACGAAGTTAGAAGACCA-3’。
所述的特异性引物：正向引物为依据SEQIDNO:2中1-1300位序列设计，反向引物依据SEQIDNO:2中1301-2000位序列设计。
一种转基因水稻品系mfb-MH86外源基因插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为载体LB旁侧序列及其插入水稻基因组中的一段序列，LB端旁侧序列如SEQIDNO:1所示，其中水稻基因组序列为1-390bp，载体LB序列为391-2000bp，该特异性序列为转Cry1Ab基因水稻品系mfb-MH86所特有。
一种转基因水稻品系mfb-MH86外源基因插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为载体RB旁侧序列及其插入水稻基因组中的一段序列，RB端旁侧序列如SEQIDNO:2所示，其中水稻基因组序列为1-1300bp，载体RB序列为1301-2000bp，该特异性序列为转Cry1Ab基因水稻品系mfb-MH86所特有。
PCR反应产物中含有SEQIDNO:1序列或SEQIDNO:2序列。
依赖于外源基因插入片段旁侧序列的转Cry1Ab基因水稻品系mfb-MH86的PCR检测方法，可依据LB旁侧序列或者RB旁侧序列检测1个插入在水稻5号染色体上的位置。上述2对引物可单独用于转基因水稻mfb-MH86及其衍生品系的定性PCR检测，也可组合同时用于转基因水稻mfb-MH86及其衍生品系的定性PCR检测。
转基因水稻mfb-MH86所用载体见图1，用于转化目的基因Cry1Ab和选择标记基因hpt分别位于不同的二个独立T-DNA区域，其中一个T-DNA区域含有35S启动子和选择标记基因hpt；另一个T-DNA区域含有核基质结合区MAR序列、Ubi启动子和目的基因Cry1Ab。
本发明采用常规方法提取转基因水稻mfb-MH86DNA，利用Tail-PCR方法分离得到LB旁侧序列2000bp，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，该序列包括水稻基因组序列，位于水稻第5号染色体（GeneBankID:NC-008398.2）的18342980-18343369位，其核苷酸序列与SEQIDNO:1中1-390位的核苷酸序列完全相同；该序列还包括转化载体pCDMARUBb-Hyg部分序列，其核苷酸序列与SEQIDNO:1中391-2000位的核苷酸序列完全相同。
本发明采用常规方法提取转基因水稻mfb-MH86DNA，利用Tail-PCR方法分离得到RB旁侧序列2000bp，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，该序列包括水稻基因组序列，位于水稻第5号染色体（GeneBankID:NC-008398.2）的18342980-18343369位，其核苷酸序列与SEQIDNO:2中1-1300位的核苷酸序列完全相同；该序列还包括转化载体pCDMARUBb-Hyg部分序列，其核苷酸序列与SEQIDNO:2中1301-2000位的核苷酸序列完全相同。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了转基因水稻mfb-MH86外源基因插入位点的左右边界旁侧序列，以及基于这二段序列的转化事件特异检测方法，为转基因mfb-MH86水稻及其衍生品系的鉴定提供了分子特征和特异的检测手段。
附图说明
图1：转化载体pCDMARUBb-Hyg的T-DNA区域结构示意图。
图2：LB端旁侧序列Tail-PCR电泳图。1-3泳道：特异性引物Bb86-L1、Bb86-L2、Bb86-L3与简并引物AD6的扩增产物。M：λ-EcoT14Marker。
图3：RB端旁侧序列Tail-PCR电泳图。1-3泳道：特异性引物Bb86-R1、Bb86-R2、Bb86-R3与简并引物AD6的扩增产物。M：λ-EcoT14Marker。
图4：PCR方法检测验证图。泳道1：mfb-MH86DNA经一对特异性引物Bb86-L3与B70-1F可扩增出1045bp片段；泳道2：明恢86用一对特异性引物Bb86-L3与B70-1F未扩增出特异条带，M：λ-EcoT14Marker。
图5：PCR方法检测验证图。泳道1：mfb-MH86DNA经一对特异性引物Bb86-R4与B70-7R可扩增出741bp片段；泳道2：明恢86用一对特异性引物Bb86-R3和B70-7R未扩增出特异条带.M：λ-EcoT14Marker。
具体实施方式
实施例1.转基因水稻mfb-MH86外源基因插入位点旁侧序列克隆
一、实验材料与仪器
1.植物材料：转基因水稻mfb-MH86
2.试剂：
1)TaqDNAPloymerase：天根(TIANGEN)生化科技(北京)有限公司提供
2)PCR扩增引物：生工生物工程(Sangon)(上海)有限公司合成
3)上样缓冲液：10×LoadingBuffer，宝生物工程(大连)有限公司提供
4)Agarose：西班牙琼脂糖，BIOWEST公司提供
3．实验仪器
1)高速/冷冻高速离心机：EppenddorfCentrifuge5415D、EppenddorfCentrifuge5424、EppenddorfCentrifuge5804R
2)PCR仪：GeneAmpPCRSystemPerkin-Elmer9600、GeneAmpPCRSystem2700、BIO-RADDyadDiscipleThermalCyclerPTC-0221、EppendorfMastercyclerproS
3)电泳仪系统：BIO-RADPowerPacBasic电源、BIO-RADPowerPacUniversal电源、BIO-RADsub-cellGT水平电泳槽、BIO-RADWideMini-subcell水平电泳槽
4)凝胶成像系统：AlphaInnotechFluorChemSP(荧光/化学光/可见光凝胶成像系统)
5)移液器：EppendorfResearch可调量程移液器
二、实验方法
1．水稻基因组DNA提取
1)将2×CTAB溶液置于65℃水浴中预热。
2)摘取新鲜的水稻叶片100-200mg，置于1.5mLEP管中，加入适量液氮，用洗净晾干的尖头玻璃棒研磨至粉末状。
3)向EP管中加入600μL预热的2×CTAB溶液，混匀。
4)将EP管置于65℃水浴中温育20分钟，期间颠倒1次。
5)从水浴中取出EP管，加入等量氯仿：异戊醇（24:1），用力上下颠倒或涡旋混匀，至下层液相呈现深绿色。
6)于室温条件静置10分钟，10000rpm，离心10分钟。
7)将上层水相上清液转移至新的1.5mLEP管中，加入2倍体积预冻的无水乙醇，轻轻颠倒混匀后置于－20℃冰箱沉淀30-60分钟。
8)沉淀结束后，10000rpm，离心10分钟，小心弃上清。
9)加入1mL75％乙醇，涡旋洗涤沉淀。
10)5,000rpm,离心3分钟，收集DNA，小心弃液体，剩余少量液体短暂离心，然后用枪头吸出。
11)室温自然干燥，或置于通风处吹干。
12)加入ddH2O或TE(pH8.0)，充分溶解，置4℃备用。
2．旁侧序列的扩增
采用热不对称交错PCR（ThermalAsymmetricInterlacedPCR，Tail-PCR）扩增与已知DNA序列邻接的未知旁侧序列。根据已知载体pCDMARUBb-Hyg序列，在左边界设计了3条嵌套的特异引物分别命名为：Bb86-L1、Bb86-L2和Bb86-L3；在右边界设计了3条嵌套的特异引物分别命名为：Bb86-R1、Bb86-R2、Bb86-R3.详见表1，将左边界嵌套的特异引物依次与简并引物AD6组合进行三轮扩增；右边界嵌套的特异引物依次与简并引物AD6组合进行三轮扩增。
左边界TaiL-PCR包括3个反应：第一轮反应：25μl反应体系，包含1×PCRbuffer，100μmol/LdNTPs，0.5μmol/L引物1Bb86-L1，50μmol/LAD6，1.0单位TaqDNA聚合酶，50-100ngDNA模板。第二轮（25μl反应体系）和第三轮（100μl反应体系）反应混合物分别含有0.5μmol/L引物2Bb86-L2、引物3Bb86-L3和其前一轮产物稀释物(50×)2μl、8μl，其它反应物同第一轮，具体反应程序见表2。
右边界TaiL-PCR反应与左边界TaiL-PCR反应体系和程序相同，只是三轮扩增的特异性引物分别改为Bb86-R1、Bb86-R2和Bb86-R3。
3．PCR产物电泳和回收
LB边界嵌套的特异引物依次与简并引物AD6组合进行三轮扩增，扩增产物电泳图见图2；RB边界嵌套的特异引物依次与简并引物AD6组合进行三轮扩增，扩增产物电泳图见图3。用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收第三次扩增产物，用于序列测定。
表1.用于旁侧序列分离和鉴定mfb-MH86品系的特异性扩增引物及简并引物
4．旁侧序列的测序及同源比较
第三次TAIL-PCR扩增产物回收后测序，测序结果在RiceGenomeDatabaseofChineseSuperHybridRice(http://btn.genomics.org.cn:8080/rice/index.php)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行blast比较序列的同源性。旁侧序列之间以及旁侧序列与载体骨架序列之间的比较使用Dnastar软件中MegAlign。结果显示T-DNA插入位置为水稻基因组中5号染色体，T-DNA断裂位置在LB序列内侧第3个碱基处。右边界的T-DNA完全缺失。
表2.Tail－PCR反应体系
实施例2基于转基因水稻mfb-MH86品系外源基因插入旁侧序列特异性定性PCR检测
一、实验材料
1．植物材料
1)转基因水稻品系mfb-MH86
2)常规水稻：明恢86
2．试剂
1)TaqDNAPloymerase：天根(TIANGEN)生化科技(北京)有限公司提供
2)PCR扩增引物：生工生物工程(Sangon)(上海)有限公司合成、英潍捷基(Invitrogen)(上海)贸易有限公司合成
3)上样缓冲液：10×LoadingBuffer，宝生物工程(TaKaRa)(大连)有限公司提供
4)Agarose：西班牙琼脂糖，BIOWEST公司提供
3.实验仪器
1)高速/冷冻高速离心机：EppenddorfCentrifuge5415D、EppenddorfCentrifuge5424、EppenddorfCentrifuge5804R
2)PCR仪：GeneAmpPCRSystemPerkin-Elmer9600、GeneAmpPCRSystem2700、EppendorfMastercyclerproS
3)电泳仪系统：BIO-RADPowerPacBasic电源、BIO-RADPowerPacUniversal电源、BIO-RADsub-cellGT水平电泳槽、BIO-RADWideMini-subcell水平电泳槽
4)凝胶成像系统：AlphaInnotechFluorChemSP(荧光/化学光/可见光凝胶成像系统)
5)移液器：EppendorfResearch可调量程移液器
二、实验方法
1．植物基因组DNA提取
同实施例1中“水稻基因组DNA提取”；
2．基于转基因水稻品系mfb-MH86外源基因插入旁侧序列的PCR检测
根据实施例1中测定的LB和RB端旁侧序列，分别在水稻基因组序列部分和转化载体部分设计引物，详见表1。
3.采用常规PCR方法扩增基因组DNA。
以Bb86-L3和B70-1F为一对特异性引物，按表2.所述PCR反应体系中“第三轮”反应体系，将退火温度改为56℃扩增，扩增产物电泳检测。
4.采用常规PCR方法扩增基因组DNA。
以Bb86-R4和B70-7R为一对特异性引物，按表2所述PCR反应体系中“第三轮”反应体系，将退火温度改为56℃扩增，扩增产物电泳检测。
三．实验结果
用表1中Bb86-L3和B70-1F这对特异性引物扩增mfb-MH86DNA得到片段为1045bp的片段，而相同引物扩增非转基因对照明恢86的DNA则没有相应的扩增条带。
用表1中Bb86-R4和B70-7R这对特异性引物扩增mfb-MH86DNA得到片段为741bp的片段，而相同引物扩增非转基因对照明恢86的DNA则没有相应的扩增条带。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCELISTING
<110>福建省农业科学院生物技术研究所
<120>一种转Cry1Ab抗虫基因水稻品系mfb-MH86的检测方法
<130>16
<160>16
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>2000
<212>DNA
<213>LB端旁侧序列
<400>1
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gtcatcgtcgtagcccaacatccccttgttcccggccgcctgcagccacagcagcacgtc1440
caatgcgaccgccaccgcaccgctgcgggcccgctgcccggccgccgcgaggaggcgccg1500
tgtcacgcccagaaatttagccctaaatttccagactattttgtatattaaatccctatc1560
caggaccagccagggtacacaaaacgacaagtaatatacagttccaaacgtaaataaagc1620
gtaaaatacttacagaagaggcacttagctctcacactaaaagagaacgacagtagcgga1680
aaaaggcgatcctagcggggcttcagctccactccacaggcaaaactcaactggggtctg1740
agcattggtcttctaacttcgtcttcagctcagaagcactaccgtactcagcaagccaca1800
ccaatgatgcagacgtgcaaggggatacaaaaaggggtttgaggctatttgcataaaggc1860
agttgtaaaatattttattgagcaaaacagtaaaacagttgagtaattaaagtaacatta1920
aatctccactgatcaacgctacaccacgttgaacaggcccaaccaacccacctgaactac1980
agtgcattgggtcaatttat2000
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
attgaaagatgggtgaaggg20
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
tcttcatctgagcaaacataaac23
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
tgtctaactacatcgtctctgcc23
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
aagacgaagttagaagacca20
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>Bb86-L1
<400>7
cgagacataactgacagaggagg23
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>Bb86-L2
<400>8
ctactctatcgttgtttttgac22
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>Bb86-L3
<400>9
tcttcatctgagcaaacataaac23
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>B70-1F
<400>10
attgaaagatgggtgaaggg20
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>Bb86-R1
<400>11
taatgtactaccaatggagggc22
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>Bb86-R2
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atgtttgctcagatgaagatt21
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>Bb86-R3
<400>13
gtcaagaacaacgatagagtagc23
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>Bb86-R4
<400>14
tgtctaactacatcgtctctgcc23
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>B70-7R
<400>15
aagacgaagttagaagacca20
<210>16
<211>18
<212>DNA
<213>AD6
<400>16
ngtcgaxxganaxgaa16

Claims (3)

1.一种转Cry1Ab抗虫基因水稻品系mfb-MH86的检测引物，其特征在于：依据LB端旁侧序列设计的一对特异性引物为：
正向引物为B70-1F：5’-ATTGAAAGATGGGTGAAGGG-3’，
反向引物为Bb86-L3：5’-TCTTCATCTGAGCAAACATAAAC-3’；
所述的特异性引物：正向引物为依据SEQIDNO:1中1-390位序列设计，反向引物依据SEQIDNO:1中391-2000位序列设计；
所述LB端旁侧序列，其序列如SEQIDNO:1所示。
2.一种转Cry1Ab抗虫基因水稻品系mfb-MH86的检测引物，其特征在于：依据RB端旁侧序列设计的一对特异性引物为：
正向引物为Bb86-R4：5’-TGTCTAACTACATCGTCTCTGCC-3’，
反向引物为B70-7R：5’-AAGACGAAGTTAGAAGACCA-3’；
所述引物单独用于转基因水稻mfb-MH86及其衍生品系的定性PCR检测或与权利要求1中的引物组合同时用于转基因水稻mfb-MH86及其衍生品系的定性PCR检测；所述RB端旁侧序列，其序列如SEQIDNO:2所示。
3.根据权利要求2所述转Cry1Ab抗虫基因水稻品系mfb-MH86的检测引物，其特征在于：所述的特异性引物：正向引物为依据SEQIDNO:2中1-1300位序列设计，反向引物依据SEQIDNO:2中1301-2000位序列设计。
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