CN101760555A

CN101760555A - 一种基于pcr技术鉴定单拷贝转基因烟草的方法

Info

Publication number: CN101760555A
Application number: CN200910191038A
Authority: CN
Inventors: 罗克明; 宋峰; 孙敏
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2010-06-30
Anticipated expiration: 2029-09-30
Also published as: CN101760555B

Abstract

本发明提供了一种在烟草转基因过程中快速鉴定单拷贝转基因植株的方法，其利用烟草核基因组上已知的单拷贝内源基因为内标，提取转基因烟草植株总DNA为模板，同时PCR扩增内源和外源目的基因；反应产物在琼脂糖凝胶上电泳检测，呈现出大小相近的两条特异性扩增条带；经ImageJ软件捕捉分析两条目的条带的亮度比，对于T2代烟草转基因植株，当外源基因与内源基因的目的条带灰度比为1时，所检测植株就为含有单拷贝外源基因的转基因烟草纯合体植株。上述方法仅需要提取转基因烟草基因组DNA样品和一步聚合酶链式反应，就可以在短时间内检测大量样品，寻找到携带单拷贝外源基因的转基因烟草植株，简单高效，成本低廉，适宜做单拷贝转基因烟草的大规模筛选。

Description

一种基于PCR技术鉴定单拷贝转基因烟草的方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域中的植物基因工程学科，涉及在根癌农杆菌介导的烟草遗传转化过程中，鉴定单拷贝转基因植株的方法。

背景技术

近年来，转基因技术作为一种常规技术已广泛应用于植物学各个研究领域。同时，该技术目前也成为了世界上增加作物产量、改善作物品质最重要的手段之一。在植物转基因过程中，根癌农杆菌介导的遗传转化是最常见的转化方法，但农杆菌携带含目的基因的T-DNA片段是随机插入受体植物的核基因组中的，因此获得的转基因植株往往含有一个至多个拷贝的外源基因(Spielmann et al.，Mol.Gen.Genet.1986，205：34-41.)。现已证明，多拷贝数的外源基因在转录翻译过程中存在基因沉默的现象，导致其表达不稳定(Lechtenberg et al.，Plant J.2003，34：507-517.)。因此，在获得转基因植株的过程中，鉴别出只含有单个拷贝外源基因的转基因植株是非常必要的，这是开展后续研究工作的基础。

鉴定转基因植物外源基因拷贝数的方法比较多，主要有以下几种：(1)Southern杂交分析，该方法是一种经典的鉴定转基因拷贝数的分子生物学技术，但是它需要花费昂贵的反应试剂，以及消耗大量的人力和时间，而且存在多拷贝插入鉴定不准确的缺点(Chen et al.，1992；Plant Cell Physiol.，33：577-583；Aldemital and Hodges，1996，Planta，199：612-617)；(2)基因分离试验，在鉴定单拷贝外源基因的转基因植株中也是一种很有用的方法，但是其存在实验周期长和工作量大的弊端。为了克服上述问题，最近出现的利用实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR)能比较快速地鉴定转基因植株中外源基因的拷贝数(Honda et al.，J Exp.Bot.2002，53(373)：1515-1520；Mason et al.，BMC Biotech.，2002，2，20)。由于此方法需要昂贵的仪器和复杂的数据分析，这限制了该方法的广泛应用。最近，Kihara等人报道了一个简单的PCR方法快速有效地检测转基因拟南芥中外源基因拷贝数(Kihara et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，2006，70(7)，1780-1783)。该方法合成两套退火温度相同的PCR引物，一套引物特异性扩增外源目的基因，一套引物扩增作为对照的内源单拷贝基因。在同一个反应中，如果两套引物扩增的产物量之比为1，表明外源基因为单拷贝插入。利用该技术可快速地鉴定出单拷贝的转基因拟南芥植株。

烟草(Nicotiana tabacum)为茄科植物，是一种重要的经济作物，同时也做为一种双子叶模式植物，在植物基因工程领域中广泛应用。然而，如何快速有效地鉴定出转基因烟草中外源基因的拷贝数，获得单拷贝转基因植株，目前还未见相关方法的报道。

发明内容

为了克服以往鉴定单拷贝转基因烟草方法成本高、耗时长、效率低等问题，本发明基于聚合酶链式反应(PCR)，设计了一种简单、高效、低成本鉴定转基因烟草中单拷贝植株的新方法。

本方法解决其技术问题所采用的方案是：

一种基于PCR技术鉴定单拷贝转基因植株的方法，其包括以下步骤：

(1)转基因烟草植株DNA的提取

(2)外源基因和内源基因PCR引物的设计，所述内源基因选择在NCBI公布的烟草核基因组上且已被证明为单拷贝的内源基因RNR₂；外源基因为新霉素磷酸转移酶II基因NPTII。

两对引物应满足以下条件：

(A)能在相同或相似的退火温度下指数扩增

(B)不能相互结合

(C)扩增的目的片段之间不能相互结合

(D)目的片段大小应具一定差别

(E)证明外源基因和内源基因两对特异性引物具有相同的扩增效率。

(4)寻找最佳循环数：需要寻找到反应的最佳循环数，既满足目的条带信号清晰可辨的目的，又不至反应达到饱和。

(5)检测出携带单拷贝外源基因的转基因烟草植株：

以烟草核基因组上已知单拷贝内源基因RNR₂为内标，以提取的转基因烟草植株基因组DNA为模板，在相同退火温度下，置于单一PCR管中同时进行聚合酶链式反应；反应产物琼脂糖电泳，染色后，在凝胶成像系统下外源基因和内源基因两条目的片段呈现出大小不同的条带，照相保存；将图片置于ImageJ软件(http://rsb.info.nih.gov/)下，捕捉分析两条目的条带的灰度比；当内源基因与外源基因的目的条带灰度比为1时，所检测的T2代转基因植株即为含有单拷贝外源基因的植株。

本方法首先需要确定一个烟草的单拷贝内源基因作为内标。前人的报道已经证实(Chaboute et al.，Plant Mol.Biol.，1998，38(5)，797-806)，烟草的核糖核酸还原酶(Ribonucleotide reductase)RNR₂是一个单拷贝基因，而且在植物中为组成性表达，因此RNR₂基因是合适的内标基因。RNR₂基因的特异性引物，上游引物为：5’-AGAAGAGCCTTTGCTGGCC-3’(p1)，下游引物为：5’-CCAACAATCTATCAGCCACG-3’(p2)，目的片段791bp。

本方法的外源基因为新霉素磷酸转移酶II基因，NPTII基因的特异性引物，上游引物为：5’-ACAATCGGCTGCTCTGATG-3’(P1)，下游引物为：5’-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3’(P2)，目的基因片段741bp。

采用上述方法，仅需要提取转基因烟草基因组DNA样品和一步聚合酶链式反应(PCR)，就可以在短时间内检测大量样品，寻找到携带单拷贝外源基因的转基因烟草植株。因此，本方法简单高效，成本低廉，适宜做单拷贝转基因烟草的大规模筛选。

附图说明

图1：经ImageJ软件分析，核基因组上单拷贝内源基因(RNR₂)与外源基因(NPTII)不同循环数下(16-34循环)，PCR扩增结果的Word平滑直线图；图中，横坐标表示循环数，纵坐标表示经ImageJ软件分析后条带灰度值。

图2：一烟草模板在不同循环数下(16-28循环)，单一PCR同时扩增核基因组上单拷贝内源基因(RNR₂)与外源基因(NPTII)的琼脂糖凝胶电泳结果。

图3：以7株转基因烟草总DNA样品为模板，循环数为24，单一PCR同时扩增核基因组上单拷贝内源基因(RNR₂)与外源基因(NPTII)的琼脂糖凝胶电泳结果图。其中：

C₁为扩增模板为水的对照组；

C₂为扩增模板为带目的基因质粒的对照组；

C₃为扩增模板为野生型植株总DNA的对照组；

1-7为扩增模板分别为1-7号转基因烟草植株总DNA的实验组；

Ratio(RNR₂/NP T II)表示经ImageJ软件捕捉分析后，内源基因(RNR₂)与外源基因(NPT II)电泳条带灰度比值。

具体实施方式

本方法包括：转基因烟草植株DNA的提取和目的基因PCR引物的设计；证明外源基因和内源基因两对特异性引物具有相同的扩增效率；寻找最佳循环数；检测出携带单拷贝外源基因的转基因烟草植株。

以下结合实施例详细说明本发明内容：

【实施例1】转基因烟草植株DNA的提取和PCR引物的设计

1转基因烟草植株DNA的提取

本发明所采用的转基因植株含有表达载体pLF，该载体中包括CaMV 35S启动子控制的GUS::NPTII融合基因，其中GUS作为报告基因，NPTII作为筛选基因(Luo et al.，Plant Biotech.J.2007，5：263-374)。

以CTAB法(Li et al.，Dev.Biol.1992，153：385-396)从T2代转基因烟草植株中快速提取少量基因组DNA，具体方法如下：

(1)混合CTAB抽提液及其相应3％体积的β-巯基乙醇，65℃预热；

(2)取约0.6g转基因烟草幼叶材料于10mL离心管，浸入液氮片刻，快速用玻璃棒充分研磨至粉末状，吸取3mL预热的混合液入此离心管中，涡旋混匀；

(3)于65℃水浴45min，中途间隔10min轻柔震荡三次以充分混匀；

(4)冷至室温后加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻柔颠倒混匀乳化10min；

(5)室温下，10000转/分离心10min；

(6)吸取3mL上清于另一干净的10mL离心管中；

(7)重复4至5步后，吸取2mL上清于另一只10mL离心管中；

(8)加入与上清液等体积(约1mL)且已于-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置至白色絮状沉淀出现；

(9)用200μL枪头吸出絮状沉淀，放入盛有500μL 75％乙醇的1.5mLEppendorf管中，漂洗DNA沉淀；

(10)用500μL 75％乙醇再漂洗一次；

(11)用无水乙醇再漂洗一次；

(12)沉淀于60℃以下恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明；

(13)加入200μL无菌水溶解DNA沉淀，同时加入RNaseA酶解RNA，于37℃放置1h；

(14)取1μL DNA电泳检查DNA质量完好。稀释后于分光光度计上测定OD₂₆₀及OD₂₈₀，定量DNA浓度；

(15)短期使用，4℃下保存。

2PCR引物的设计

登陆NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)，查询到ChaboutéME等已证明烟草核糖核酸还原酶基因(RNR₂，GeneBank No.：X92443)为其核基因组上单拷贝内源基因(Chaboutéet al，Plant Mol.Biol.1998 38：797-806.)。用DNA Star和Vector NTI8引物设计软件，分别设计了单拷贝内源基因RNR₂特异性引物，上游引物为：5’-AGAAGAGCCTTTGCTGGCC-3’(p1)，下游引物为：5’-CCAACAATCTATCAGCCACG-3’(p2)(目的片段791bp)；外源基因NPT II(新霉素磷酸转移酶II基因，GeneBank No.：EU215434)的特异性引物，上游引物为：5’-ACAATCGGCTGCTCTGATG-3’(P1)，下游引物为：5’-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3’(P2)(目的片段741bp)。由金思特科技有限公司(南京)代为合成。PCR所用反应试剂均为TaKaRa公司产品，dNTPMixture(各2.5mM)，Taq DNA聚合酶(5U/μL)附10×PCRBuffer(0.1MTris-HCl[pH 8.3]，0.5M KCl)和MgCl₂(25mM)。

【实施例2】证明外源基因和内源基因两对特异性引物具有相同的扩增效率

DNA样品的纯度和完整性对于借助PCR来完成外源基因的拷贝数的鉴定非常重要。通常这步可以通过扩增一个单拷贝的内源基因作为对照来完成。与以往不同的是，这里将外源基因与此内源基因放在同一PCR反应中进行扩增。这样不仅降低了成本，节省了人力，更重要的是与分别扩增内源和外源基因相比，将PCR反应间的误差降低到最小。但是如果分别扩增内源基因和外源基因的两对特异性引物的PCR扩增效率差距巨大，那么在鉴定试验中就会出现差错。因此，需要在鉴定试验前鉴定此两对特异性引物是否具有相似的扩增效率。

1PCR反应

这里选取已证明为单拷贝纯合体的转基因烟草植株DNA样品作为模板，分别单独扩增内源基因和外源基因。使用PCR管按以下标准分别加样：

加完样后，短暂离心混匀，并保证液体聚于管底。外源基因和内源基因各加样10管。快速置于PCR仪中，设置以下循环参数：94℃3min，1个循环；94℃30s，56℃30s，72℃1min，34个循环。反应过程中，从第16循环开始，以后每隔两个循环各拿出一管，至34循环反应结束为止。

取5μL反应产物，按16，18，20，22，24，26，28，30，32，34循环的循环数顺序，点样在质量分数为1.5％的琼脂糖凝胶，120V，90mA下电泳30min。溴化乙锭(EB)染色后，在凝胶成像系统下呈现出亮度逐渐增强的条带，照相保存。将图片置于ImageJ软件下，捕捉定量各个目的条带的亮度。

2结果分析

将定量两个基因第16至34循环各个阶段的条带亮度值，在Microsoftoffice Word 2003软件中制成平滑直线图，结果内源基因和外源基因的具有相似的增长趋势(如图1)。表明两对特异性引物具有相同的扩增效率。

【实施例3】寻找最佳循环数

不同的PCR循环数对内源基因与外源基因的目的条带灰度比存在显著影响。这是因为反应循环数较少时，不能检测到明显信号。当反应循环数过多时，反应已达饱和，检测结果不可靠。因此需要寻找到反应的最佳循环数，既满足目的条带信号清晰可辨的目的，又不使反应达到饱和。

1PCR反应：

随机提取一转基因烟草植株的基因组DNA做模板，进行PCR检测。使用PCR管按下列标准进行加样和操作：

加完样后，短暂离心混匀，并保证液体聚于管底。加样7管。快速置于PCR仪中，设置以下循环参数：94℃3min，1个循环；94℃30s，56℃30s，72℃1min，28个循环。

反应过程中，从16循环开始，每两个循环拿出一管，至28循环反应结束为止。取5μL反应产物，按16，18，20，22，24，26，28的循环数顺序，点样在质量分数为1.5％的琼脂糖凝胶，120V，90mA下电泳30min。溴化乙锭(EB)染色后，在凝胶成像系统下呈现出亮度逐渐增强的条带，照相保存。

2结果分析

发现当循环数为24循环时，两个目的片段清晰可辨，且反应未达饱和(如图2)。

【实施例4】检测携带单拷贝外源基因的转基因烟草植株

以烟草核基因组上单拷贝内源基因(RNR₂)为内标，与核基因组上插入的外源基因一起以提取的转基因烟草植株DNA为模板，在相同退火温度下，置于单一PCR管中同时进行聚合酶链式反应(PCR)。5μL反应产物经质量分数为1.5％的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色后，在凝胶成像系统下呈现出外源基因和内源基因两条目的片段大小不同的条带，照相保存。将图片置于ImageJ软件下，捕捉分析两条目的条带的灰度比。当内源基因与外源基因的目的条带灰度比为1时，所检测的T2代转基因植株就为含有单拷贝外源基因的纯合体植株。

1PCR反应

使用PCR管按下列标准进行加样和操作：

加完样后，短暂离心混匀，并保证液体聚于管底。快速置于PCR仪中，设置以下循环参数：94℃3min，1个循环；94℃30s，56℃30s，72℃1min，24个循环。反应产物经质量分数为1.5％的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色后，在凝胶成像系统下外源基因和内源基因呈现出两条目的片段大小不同的条带，照相保存。将图片置于ImageJ软件下，捕捉分析两条目的条带的灰度比。

2结果分析

植株1和植株7的内源基因与外源基因的目的条带灰度比约为1(如图3)，表明这2个转基因植株含有单拷贝外源基因。

【实施例5】经典遗传学方法验证单拷贝转基因植株

为了验证通过此方法获得的单拷贝烟草转基因植株的可靠性，收集已鉴定的2株单拷贝转基因烟草T3代种子。经75％乙醇浸泡30s，5％NaClO溶液表面消毒10min，无菌水冲洗3次后，播种于高温灭菌的MS固体培养基，25±1℃下光照培养，5天左右露白。由于转基因植株中均含有GUS报告基因，对幼苗进行GUS组织染色，统计蓝白幼苗的数量。

1GUS组织染色方法

GUS染液配方及组织染色方法按照《植物基因工程》(王关林，方宏筠等，第二版，831-832)进行。操作过程：将露白的种子，浸入新鲜配制的X-Gluc染色液中，37℃过夜保温，以充分染色，然后统计GUS组织染色结果。

2结果分析

通过此方法鉴定的2株单拷贝纯合体转基因烟草植株，T3代种子未出现明显基因分离现象，与预期结果一致(如下表1)。因此，通过根癌农杆菌介导获得的转基因烟草，借助本方法来鉴定单拷贝植株方面具有可信度。

表1：GUS组织染色结果

Claims

1.一种基于PCR技术鉴定单拷贝转基因植株的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)转基因烟草植株基因组DNA的提取

(2)外源基因和内源基因PCR引物的设计，所述内源基因选择在NCBI公布的烟草核基因组上且已被证明为单拷贝的内源基因；

(3)证明外源基因和内源基因两对特异性引物具有相同的扩增效率；

(4)寻找最佳循环数；

(5)检测出携带单拷贝外源基因的转基因烟草植株：

以烟草核基因组上已知单拷贝内源基因RNR₂为内标，以提取的转基因烟草植株基因组DNA为模板，在相同退火温度下，置于单一PCR管中同时进行聚合酶链式反应；反应产物琼脂糖电泳，染色后，在凝胶成像系统下外源基因和内源基因两条目的片段呈现出大小不同的条带，照相保存；将图片置于ImageJ软件下，捕捉分析两条目的条带的灰度比；当内源基因与外源基因的目的条带灰度比为1时，所检测的T2代转基因植株即为含有单拷贝外源基因的植株。

2.根据权利要求1所述的基于PCR技术鉴定单拷贝转基因植株的方法，其特征在于：所述内源基因为烟草的核糖核酸酸还原酶RNR₂基因，RNR₂基因的特异性引物，上游引物为：5’-AGAAGAGCCTTTGCTGGCC-3’(p1)，下游引物为：5’-CCAACAATCTATCAGCCACG-3’(p2)，目的片段791bp。

3.根据权利要求1所述的基于PCR技术鉴定单拷贝转基因植株的方法，其特征在于：所述外源基因为新霉素磷酸转移酶II基因，NPT II基因的特异性引物，上游引物为：5’-ACAATCGGCTGCTCTGATG-3’(P1)，下游引物为：5’-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3’(P2)，目的基因片段741bp。