CN104561333B - 一种快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法 - Google Patents

一种快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测领域，公开了对绿潮爆发主要浒苔类藻类：浒苔、扁浒苔、曲浒苔、缘管浒苔的进行鉴定的方法。用待测绿潮浒苔类藻类的总DNA为模板，进行以下荧光PCR检测：检测体系A中加入相应的特异性引物及TaqMan探针进行qPCR扩增和荧光检测；根据相应荧光信号和特异性扩增曲线，确定样品是否为扁浒苔或曲浒苔，或者是缘管浒苔和浒苔中的一种；检测体系B中加入缘管浒苔的特异性引物，用SYBR？Green体系进行扩增并荧光检测；在检测体系A中鉴定为缘管浒苔或浒苔，并在检测体系B中出现特异性扩增曲线的为缘管浒苔，未出现特异性扩增曲线的为浒苔。本方法对样本低要求，高效率，精确检测，省时省力省费用，效果显著。

Description

一种快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体为一种基于荧光PCR技术对绿潮爆发主要石莼属藻种：浒苔、扁浒苔、曲浒苔、缘管浒苔的鉴定方法。
背景技术
“绿潮”(Greentide)是由于水体的富营养化，适宜的环境因子等因素引发的由石莼属、硬毛藻属和刚毛藻属等大型海洋绿藻过度增殖、暴发性飘浮生长导致海水表面呈现一片绿带的有害生态异常现象。近年来，绿潮暴发的频率和发生的地理范围呈增长趋势，已逐渐成为世界性的海洋环境与生态问题。亚洲的中国、日本，美洲的美国、加拿大，欧洲的法国等国家，均持续暴发了“绿潮”。世界范围内的大型藻华，包括绿潮，多发生在封闭或半封闭的海湾。但在我国，黄海绿潮不同，它是发生在一个开阔的海域。自2007年起至2014年，连年暴发。特别是2008年青岛海域暴发了世界上最大规模的绿潮，也危及到奥帆赛的顺利举行，巨大的生物量和大面积的影响范围，给沿岸生态以及旅游经济造成了严重的负面影响。从而引起了有关政府机构和相关学者的高度重视和媒体的广泛关注。为了更好的对绿潮的发生进行溯源,并进一步达到预防、治理进而合理利用绿潮的目的，那么对引发绿潮的物种——浒苔类藻类，进行鉴定技术的探究则是十分必要的。
需要进行鉴定的引发绿潮的浒苔藻种主要有：曲浒苔、浒苔、缘管浒苔和扁浒苔。目前用于浒苔鉴定技术主要基于以下几种：传统鉴定法、杂交测试法、分子生物学鉴定法。
传统分类学研究是从形态学和解剖学入手的，主要包括：个体水平研究藻体的形态特征和生活史特点，细胞水平研究藻体细胞大小和排列方式、细胞分裂特点和生殖发育方式等，亚细胞水平研究细胞器的形态结构和定位特征等。技术方法上主要涉及野外采集、纯系培养、组织培养、切片染色、光镜电镜技术等。(Tayloretal.1999；Stanleyetal.1999；Callowetal.2000；Rusig&Cosson2001；Hiraoka&Oka2008)通常依据上述研究结果，制订相关分类标准并作为种水平鉴定的依据。然而，石莼属绿藻在藻体形态、分枝程度、细胞和亚细胞水平的形态特征都会因为环境因子的诱导而发生不同程度的变化。这些种内形态的较大变化和种间形态的相近给传统分类学研究以巨大的挑战，造成了石莼属绿藻物种水平鉴定的难度，不利于通过形态学进行石莼属绿藻的资源调查研究。
杂交测试法(Crossingtest)也是用来鉴定石莼属绿藻并分析绿潮构成种的有效方法，它通过已知绿藻与未知绿藻释放的配子能否杂交，来检测石莼属绿藻之间的亲缘关系。Hiraokaetal.(2003)报道了来自日本南部和西部海岸的一种新的绿潮形成种Ulvaohnoi，形态和分子生物学研究都表明，U.ohnoi不同于其它的石莼属绿藻，杂交测试法表明U.ohnoi与亲缘最近的U.fasciata和U.reticulata有杂交障碍，U.ohnoi不能够和U.reticulata杂交，U.ohnoi与U.fasciata仅能发生很少的杂交，但无法分离获得杂交后代(HiraokaM,2004)。
然而，分子生物学鉴定方法的引入克服了形态学研究方面的很多不足，为我们提供了石莼属绿藻更多的进化和遗传信息。通过对ITS、rbcL、cox1、5S、18S等DNA序列的比对分析，使用最大似然法(ML)，邻接法(NJ)，最大简约法(MP)、最小进化法(ME)等聚类分析方法构建进化树，可以从分子系统学角度认识石莼属绿藻种间和同一物种不同地理隔离种群间的亲缘关系(尹顺吉,等2009；Kostamoetal.2008)。但是总的来说，目前现有技术的检测方法耗时长，费用较高。
发明内容
本发明旨在提供一种快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法，能够快速准确地鉴别浒苔(U.Prolifera)、扁浒苔(U.Compressa)、曲浒苔(U.flexuosa)和缘管浒苔(U.Linza)。
技术方案为，一种快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法，步骤包括：
用待测绿潮浒苔类藻类的总DNA为模板，进行以下荧光PCR检测：测体系A为TaqMan体系，检测体系B为SYBRGreen体系；
检测体系A中，加入相应的特异性引物和TaqMan探针，用TaqMan体系进行qPCR扩增和荧光检测；
扁浒苔的特异性引物上游序列C-its-arms-F如SEQIDNo.1的核苷酸所示：GGCGTCCGCCGTTTT，下游序列C-its-arms-R如SEQIDNo.2的核苷酸所示：GCAGAAGGTTTCATGGGTTAGG，TanMan探针C-its-arms-p如SEQIDNo.3的核苷酸所示：CCGGTGAGGTGCGCTCCCC；
曲浒苔的特异性引物上游序列F-5s-F如SEQIDNo.4的核苷酸所示：TCGTCCGGGTTCTCGACG，下游序列F-5s-R如SEQIDNo.5的核苷酸所示：CTGGCGCGAAACATGGC，TanMan探针F-5s-P如SEQIDNo.6的核苷酸所示：CCTCATTCCTTCCCCATGTCGCCAA；
缘管浒苔和浒苔的特异性引物上游序列P-hsp-F如SEQIDNo.7的核苷酸所示：CAACAACCTGCTGGGCAAGT，下游序列P-hsp-R如SEQIDNo.8的核苷酸所示：TCGAACACGACCTCGATTTG，TanMan探针P-hsp-P如SEQIDNo.9的核苷酸所示：CGACCTCACCGGGATTCCTCCC；
所述的三种TaqMan探针的5’端分别连接不同的报告染料，3’端连接淬灭基团；
根据相应荧光信号和特异性扩增曲线，确定样品是否为扁浒苔或曲浒苔，或者是缘管浒苔和浒苔中的一种；
检测体系B中，加入缘管浒苔的特异性引物，用SYBRGreen体系进行qPCR扩增，并进行荧光检测；
缘管浒苔的特异性引物上游序列L-5s-arms-F如SEQIDNo.10的核苷酸所示TCCCCTGTGCTGTATCGCTAT，下游序列L-5s-arms-R如SEQIDNo.11的核苷酸所示：CGGCCGCTGTAGACAGATG；
在检测体系A中鉴定为缘管浒苔或浒苔，并且在检测体系B中出现特异性扩增曲线的，为缘管浒苔；在检测体系A中鉴定为缘管浒苔或浒苔，并在检测体系B中未出现特异性扩增曲线的，为浒苔。
优选的，检测体系A中，扁浒苔的特异性引物上游和下游序列分别如SEQIDNo.1和2所示，TanMan探针C-its-arms-p的序列如SEQIDNo.3所示；曲浒苔的特异性引物上游和下游序列分别如SEQIDNo.4和5所示，TanMan探针F-5s-P的序列如SEQIDNo.6所示；缘管浒苔和浒苔的特异性引物上游和下游引物序列分别如SEQIDNo.7和8所示，TanMan探针P-hsp-P的序列如SEQIDNo.9所示。
优选的，检测体系A中，TaqMan探针的报告染料选自VIC、ROX、FAM(6-羧基荧光素)、CY5、CY3或HEX为TAMRA，淬灭基团为BHQ-2或MGB。
优选的，检测体系B中，缘管浒苔的特异性引物上游和下游序列分别如SEQIDNo.10和11所示。
优选的，检测体系A的扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s、58℃下退火10s、72℃下延伸38～45s并采集信号，30个循环。
优选的，检测体系B的扩增条件为：94.5～96℃预变性4.5～6min；94.5～96℃变性9～12s、58～61℃下退火9～10s、70～75℃下延伸38～45s并采集信号，32～40个循环。更优选的扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s、58℃下退火10s、72℃下延伸38～45s并采集信号，35个循环。
本发明基于TaqMan探针荧光PCR技术，通过ITS基因序列、5SrDNA间隔区序列、热休克蛋白70基因等，在GeneBank里筛选出浒苔、缘管浒苔、曲浒苔、扁浒苔已知的基因进行同源性比对。利用PrimerExpress3.0设计特异性引物和探针，鉴定以上几种浒苔。
由于浒苔和缘管浒苔的ITS序列完全一致，而5S相似性极高。难以设计通用引物，因此，进一步采用SYBRGreen荧光PCR将TaqMan探针不能进行分辨的浒苔和缘管浒苔，利用缘管浒苔的ARMS引物进行区分。
本发明的技术关键在于：
一、首次采用了分子检测前沿技术之一突变扩增阻滞系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)技术，通过序列比对后得到的缘管浒苔的5SrDNA间隔区序列的SNP位点、扁浒苔的ITS基因的SNP位点设计了引物。ARMS技术利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大。与此同时，利用探针对扩增产物进行检测，在TaqMan荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检测，以达到对基因突变检测的高特异性和高灵敏度。
二、首次使用了TaqMan结合SYBRGreen荧光PCR技术进行鉴定大型藻类。
1、利用HSP70热休克蛋白基因设计的TaqMan探针P-5s-p和引物P-hsp70-F/-R，用于鉴定浒苔和缘管浒苔的组成的簇。
2、针对5SrDNA间隔区序列并采用ARMS技术设计的引物L-5s-arms-F/-R通过SYBRGreen技术进行荧光PCR，用于从浒苔和缘管浒苔的簇中筛选出缘管浒苔。
3、针对5SrDNA间隔区序列设计的TaqMan探针F-5s-p以及引物F-5s-F/-R，用于鉴定曲浒苔。
4、针对ITS序列设计结合ARMS技术设计的TaqMan探针C-its-arms-p和引物C-its-arms-F/R通过TaqMan进行荧光PCR，用于鉴定扁浒苔。
与常规鉴定相比，本发明的优势在于：传统的绿潮浒苔类藻类的分子鉴定需要先提取DNA，然后PCR扩增、电泳、测序并根据测序结果进行序列比对和构建系统发育树进而得出结果。耗时至少一星期才可以出结果，如果中途有任何环节上失败，如DNA提取失败，测序失败等。少则耗时半月，多则一个月，而且测序费用成本高，还要额外加上PCR试剂的费用、琼脂糖、缓冲液(TAE)的费用等。本发明只需要快速提取DNA，经荧光PCR(包括TaqMan体系和SYBRGreen体系)、根据电脑屏幕显示的曲线扩增情况即可直观读取分子鉴定结果，即浒苔的种类。本实验全部流程在一天之内即可实现从提取总DNA到种类鉴定的结果，并且无需后期的测序费用。通过前期实验发现，将较浓的样本DNA稀释到五千倍仍然可以检测到信号。也就是说，对样本的基因组要求也较之常规PCR大大降低。
该发明的引物和探针适用于常见绿潮浒苔类藻类的分子鉴定。该技术已经在实验室内部的几种绿潮藻体的检测中初步验证成功，经过后期的大规模反复验证，可设计为绿潮藻快速提取及鉴定试剂盒。总之，本发明能够做到对样本低要求，高效率，精确检测，省时省力省费用，效果显著。
附图说明
图1为检测体系A扁浒苔的荧光检测结果
图2为检测体系A曲浒苔的荧光检测结果
图3为检测体系A浒苔和缘管浒苔的荧光检测结果
图4为检测体系A浒苔或缘管浒苔的荧光检测结果
图5为检测体系B缘管浒苔的荧光检测结果
具体实施方式
实施例1
结合Genebank里面ITS、5S、Hsp70基因对于四种浒苔的同源序列进行比对，利用PrimerExpress3.0设计特异性引物和探针序列。选取其中最佳引物序列，合成最佳引物所对应的探针。
检测体系A即TaqMan体系中，扁浒苔特异性引物(C)的特异性引物和探针序列为，上游C-its-arms-F：GGCGTCCGCCGTTTT，下游C-its-arms-R：GCAGAAGGTTTCATGGGTTAGG。
TaqMan探针C-its-arms-p:CCGGTGAGGTGCGCTCCCC，5'端连接TAMRA荧光基团，3'端连接淬灭基团BHQ-2。
曲浒苔(F)的特异性引物和探针序列为，上游F-5s-F:TCGTCCGGGTTCTCGACG，下游F-5s-R:CTGGCGCGAAACATGGC。
TaqMan探针F-5s-P:CCTCATTCCTTCCCCATGTCGCCAA，5'端连接CY5荧光基团，3'端连接淬灭基团BHQ-2。
浒苔和缘管浒苔(P)的特异性引物和探针序列为，上游P-hsp-F:CAACAACCTGCTGGGCAAGT，下游P-hsp-R:TCGAACACGACCTCGATTTG。
TaqMan探针P-hsp-P:CGACCTCACCGGGATTCCTCCC，5’端连接ROX荧光基团，3'端连接淬灭基团BHQ-2。
检测体系B即SYBRGreen体系中，缘管浒苔(L)的特异性引物序列为，上游L-5s-arms-F:TCCCCTGTGCTGTATCGCTAT，下游L-5s-arms-R:CGGCCGCTGTAGACAGATG
上述引物和探针分别配制成浓度为10ng/ml的溶液。
实施例2
使用CTAB法提取浒苔总基因组DNA；
(1)将100mg-200mg植物组织样品移至预冷无菌研钵中，研磨成粉末状，立即装入提前预冷的离心管中，并放入液氮瓶中。
(2)加入1ml65℃预热的CTAB提取液，震荡混匀，65℃烘箱温浴30min。温浴期间摇匀2～3次，保证裂解充分。
(3)加入800ul氯仿-异戊醇(24:1)，上下颠倒100次(上下为1次)，12000rpm离心20min。
(4)吸取上清液至新的1.5ml无菌离心管中,加入上清液体积的2/3体积的异丙醇，充分混匀，-20℃放置1h。
(5)12000rpm离心10min，弃上清，加入75％的乙醇500ul清洗沉淀。瞬时离心，吸弃多余液体，离心管开盖，37℃烘箱晾干10min至DNA沉淀呈半透明状。
(6)加入60ul含10mg/mlRnase的无菌ddH2O,溶解DNA沉淀。
CTAB提取液的组分包括：CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)20g，0.5mol/LEDTA(pH＝8.0)40ml，5mo1/LNaCl280ml，1moI/LTris-HCl(pH＝8.0)100ml，β-巯基乙醇20ml，用蒸馏水定容至1L。
实施例3
TaqMan试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)用于检测体系A，SYBRGreen试剂盒(KAPABiosystems)用于检测体系B。
在检测体系A即TaqMan体系中加入实施例1合成的扁浒苔(C)、曲浒苔(F)、浒苔和缘管浒苔(P)的特异性引物及TaqMan探针，以及实施例2的样品总DNA(稀释10倍)，用TaqMan反应体系进行PCR扩增。
检测体系B中加入缘管浒苔(L)的特异性引物序列，以及实施例2的样品总DNA(稀释10倍)，用SYBRGreen反应体系进行PCR扩增。
检测体系A和B配比组成如表1：
表1
其中，检测体系A中TaqMan的Primer组成如表2：
表2
名称 上游引物 下游引物 探针
C 1.6μl 1.6μl 0.8μl
F 0.2μl 0.2μl 0.1μl
P 0.2μl 0.2μl 0.1μl
检测体系A的扩增条件为，50℃预变性120s；95℃预变性5min；95℃变性10、55℃退火10s、72℃延伸30s、5个循环；并在95℃变性10s、60℃下退火28～34s并采集信号，30个循环。
检测体系B的扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s、58℃下退火10s、72℃下延伸38～45s并采集信号，35个循环。
用上述方法，分别取浒苔、缘管浒苔、扁浒苔和曲浒苔的标准样品，提取总DNA进行检测。
(1)当检测的标样为扁浒苔时，如图1所示，检测体系A经荧光检测，扁浒苔(连接TAMRA荧光基团)出现S型曲线即阳性，说明发生了扩增；其余的CY5和ROX荧光的扩增曲线为平直曲线，结果为阴性，说明未发生实际扩增。
(2)当检测的标样为曲浒苔时，如图2所示，检测体系A经荧光检测，曲浒苔(连接CY5荧光基团)出现S型曲线即阳性，说明发生了扩增；其余的ROX和TAMRA荧光的扩增曲线为平直曲线，结果为阴性，说明未发生实际扩增。
(3)取浒苔和缘管浒苔标样的总DNA分别装入反应管用检测体系A进行检测(用两个不同的通道)，如图3所示，浒苔和缘管浒苔(连接ROX荧光基团)均出现S型曲线即阳性，说明发生了扩增，且两者的曲线相似；其余的CY5和TAMRA荧光的扩增曲线为平直曲线，结果为阴性，说明未发生实际扩增。
(4)取浒苔或缘管浒苔标样的总DNA分别装入反应管用检测体系A进行检测，如图4所示，浒苔或缘管浒苔(连接ROX荧光基团)出现S型曲线即阳性，说明发生了扩增；其余的CY5和TAMRA荧光的扩增曲线是平直曲线，结果为阴性，说明未发生实际扩增。
(5)分别取浒苔、缘管浒苔分标样的总DNA装入反应管用检测体系B进行检测，如图5所示，当样品为缘管浒苔时，SYBRGreen检测结果出现扩增曲线；浒苔在SYBRGreen体系中不出现扩增曲线。
结果为，在检测体系A中，扁浒苔、曲浒苔都有特异性曲线出现，而浒苔和缘管浒苔由于特异性不强，都会出现同一曲线。但是在检测体系B(SYBRGreen)中，由于加入缘管浒苔的特异性引物，会只出缘管浒苔的曲线，进而区分出浒苔和缘管浒苔。
上述荧光检测过程，所需时间不超过2小时，而且准确率高。
其中的荧光基团还可以替换VIC、FAM、CY3或HEX，淬灭基团可替换为MGB，结果相同。
将实施例2所获得的总DNA溶液稀释10倍、100倍、500倍、1000倍，进行检测仍可获得准确结果。当荧光基团为VIC、ROX、FAM、、CY5、CY3或HEX时，稀释10000倍进行检测仍可获得准确结果。
用上述方法对20个样品进行检测，准确率为100％。

Claims (5)

1.一种快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法，其特征在于，步骤包括：
用待测绿潮浒苔类藻类的总DNA为模板，进行以下荧光PCR检测：
检测体系A中，加入相应的特异性引物和TaqMan探针，用TaqMan体系进行PCR扩增和荧光检测；
扁浒苔的特异性引物上游序列C-its-arms-F如SEQIDNo.1的核苷酸所示：GGCGTCCGCCGTTTT，下游序列C-its-arms-R如SEQIDNo.2的核苷酸所示：GCAGAAGGTTTCATGGGTTAGG，TaqMan探针C-its-arms-p如SEQIDNo.3的核苷酸所示：CCGGTGAGGTGCGCTCCCC；
曲浒苔的特异性引物上游序列F-5s-F如SEQIDNo.4的核苷酸所示：TCGTCCGGGTTCTCGACG，下游序列F-5s-R如SEQIDNo.5的核苷酸所示：CTGGCGCGAAACATGGC，TaqMan探针F-5s-P如SEQIDNo.6的核苷酸所示：CCTCATTCCTTCCCCATGTCGCCAA；
缘管浒苔和浒苔的特异性引物上游序列P-hsp-F如SEQIDNo.7的核苷酸所示：CAACAACCTGCTGGGCAAGT，下游序列P-hsp-R如SEQIDNo.8的核苷酸所示：TCGAACACGACCTCGATTTG，TaqMan探针P-hsp-P如SEQIDNo.9的核苷酸所示：CGACCTCACCGGGATTCCTCCC；
所述的三种TaqMan探针的5’端分别连接不同的报告染料，3’端连接淬灭基团；
检测体系B中，加入缘管浒苔的特异性引物，用SYBRGreen体系进行扩增，并进行荧光检测；
缘管浒苔的特异性引物上游序列L-5s-arms-F如SEQIDNo.10的核苷酸所示：TCCCCTGTGCTGTATCGCTAT，下游序列L-5s-arms-R如SEQIDNo.11的核苷酸所示：CGGCCGCTGTAGACAGATG；
在检测体系A中鉴定为缘管浒苔或浒苔的，同时在检测体系B中出现特异性扩增曲线的，为缘管浒苔；在检测体系A中鉴定为缘管浒苔或浒苔的，并在检测体系B中未出现特异性扩增曲线的，为浒苔。
2.权利要求1所述鉴别绿潮浒苔类藻类的方法，其特征在于，检测体系A的扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s、58℃下退火10s、72℃下延伸38～45s并采集信号，30个循环。
3.权利要求1所述快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法，其特征在于，检测体系B的扩增条件为：94.5～96℃预变性4.5～6min；94.5～96℃变性19～22s、58～61℃下退火9～10s、70～75℃下延伸并采集信号38～45s，32～40个循环。
4.权利要求1所述快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法，其特征在于，检测体系B的扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s、58℃下退火10s、72℃下延伸38～45s并采集信号，35个循环。
5.权利要求1所述快速鉴定绿潮浒苔类藻类的方法，其特征在于，检测体系A中，TaqMan探针的报告染料选自VIC、ROX、FAM、CY5、CY3、HEX或TAMRA，淬灭基团为BHQ-2或MGB。
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