CN107988408B - 一种鉴定浒苔近缘种的引物对、dna条形码及其应用和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于藻类分子标记技术领域，具体涉及一种鉴定浒苔近缘种DNA条形码的引物对、DNA条形码及其应用和检测方法。鉴定浒苔近缘种的引物对，上游引物序列：5’GCTGACATACCATCACGATAGT 3’(SEQ ID U01)；下游引物序列：5’CGTATTATTTCACCAGACCCTT 3’(SEQ ID U02)。所述引物对在鉴定浒苔近缘种中的应用。本发明是传统物种鉴定的强有力补充，而且样本鉴定过程能够实现自动化和标准化，突破了对经验的过度依赖，并可利用藻体的残片进行快速有效的鉴定，能够在较短时间内建立形成易于利用的应用系统。

Description

一种鉴定浒苔近缘种的引物对、DNA条形码及其应用和检测 方法

技术领域

本发明属于藻类分子标记技术领域，具体涉及一种鉴定浒苔近缘种DNA条形码的引物对、DNA条形码及其应用和检测方法。

背景技术

浒苔(Ulva prolifera)、缘管浒苔(Ulva linza)和曲浒苔(Ulva flexuosa)是隶属于石莼属近缘物种，均属于可以食用的绿藻，但其大量增殖会引发生态灾害，例如，由浒苔爆发性增殖而引起的“绿潮”灾害，从2007年起在我国黄海连续发生，其生物量巨大，影响范围广，给沿岸经济和生态都造成严重的负面影响，引起了社会、媒体、政府和相关学者的广泛关注。

目前用于石莼属绿藻的鉴定方法包括形态学观察、杂交实验鉴定和DNA条形码鉴定等。传统形态学鉴定主要依据形态特征和生活史特点，如，藻体形状、生殖发育方式、细胞大小和排列方式、叶绿体形态及淀粉核数量等。形态学观察通常耗时较长，要求操作人员具有一定的分类学基础，同时由于石莼属绿藻在不同生活环境中会产生较大的形态变异，也是形态学鉴定的难点。杂交实验鉴定通过对雌雄配子进行杂交实验，根据是否存在生殖隔离，来实现绿藻的鉴定，该方法需要对藻体进行持续培养和配子体分离，对人员的操作要求高，试验周期也较长。

近年来，DNA条形码对物种进行分类鉴定已经成为一种准确高效的方法。DNA条形码的工作原理是基于DNA短片段来识别动物、植物或其它生物的类别，可利用有机体的残片进行快速有效的鉴定，能够在较短时间内建立形成易于利用的应用系统。石莼属绿藻一般利用ITS和rbcL等DNA序列片段的作为DNA条形码进行物种鉴定，然而，对于浒苔和缘管浒苔这对近缘物种来说，使用ITS和rbcL这些常用的分子标记时，得到的DNA条形码序列相似性极高，在系统发育分析中聚为一个同源支系，无法有效的对这两个物种进行区分。进而，急需能够准确区分浒苔和缘管浒苔等近缘物种的方法。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种鉴定浒苔近缘种DNA条形码的引物对、DNA条形码及其应用和检测方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种鉴定浒苔近缘种的引物对：

上游引物序列：5’GCTGACATACCATCACGATAGT 3’(SEQ ID U01)；

下游引物序列：5’CGTATTATTTCACCAGACCCTT 3’(SEQ ID U02)。

一种鉴定浒苔近缘种的引物对的应用，所述引物对在鉴定浒苔近缘种中的应用。

一种鉴定浒苔近缘种的DNA条形码，DNA条形码为叶绿体rps7-ycf3序列。

所述用于鉴定浒苔(U.prolifera)的DNA条形码，为SEQ ID No.3所示的碱基序列；用于鉴定缘管浒苔(U.linza)的DNA条形码，为SEQ ID No.4所示的碱基序列；用于鉴定曲浒苔(U.flexuosa)的DNA条形码，为SEQ ID No.5所示的碱基序列。

所述DNA条形码对在鉴定浒苔近缘种中的应用。

一种鉴定浒苔近缘种得方法：

1)以待测样品的DNA为模板，以所述鉴定浒苔近缘种的引物对作为引物，进行PCR扩增；

2)将上述扩增获得产物经电泳检测，在595±20bp存在条带(叶绿体rps7-ycf3序列)，即为浒苔近缘种，将其进一步测序分析；

3)将在595±20bp存在条带的扩增产物与所述SEQ ID No.3-5所示的DNA条形码进行碱基序列对比，扩增产物与所述SEQ ID No.3-5任意一条所示的DNA条形码的同源性在99.5％以上，即待测的物种来自于所述DNA条形码对应的物种。

所述25μL PCR体系为：

所述PCR条件为：预变性94℃、5min；94℃变性30s,55℃退火40s,72℃延伸40s,35个循环；最后72℃延伸10min。

与传统的形态学分类方法相比，本发明所具有的优点：

本发明是传统物种鉴定的强有力补充，而且样本鉴定过程能够实现自动化和标准化，突破了对经验的过度依赖，并可利用藻体的残片进行快速有效的鉴定，能够在较短时间内建立形成易于利用的应用系统。

本发明能够对浒苔近缘种进行区分，能够在更高分辨率的水平上稳定、准确的对浒苔近缘种实施鉴定。

本发明方法可对于绿潮灾害研究、石莼属物种分类、系统发育、系统地理学研究，以及保护和利用浒苔资源方面都具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例提供的浒苔和缘管浒苔叶绿体基因组比对结果，所示为rps7-ycf3的基因间隔区图。

图2为本发明实施例提供的rps7-ycf3序列全局比对结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的解释说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

浒苔近缘种DNA条形码rps7-ycf3的获得

1)浒苔近缘种叶绿体基因组比较分析：.

从美国国立生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取浒苔和缘管浒苔的叶绿体基因组序列(浒苔：KX342867.1，缘管浒苔：KX058323.1)，利用MEGA7.0软件中的Clustal W模块进行基因组比对，根据叶绿体基因组比对结果，首先找到两物种间序列一致性不高的区段，进一步依据基因组注释信息，筛选出属于基因间隔区的区段，最后确定出候选区段为rps7-ycf3的基因间隔区(图1)。

2)rps7-ycf3序列引物对的设计：

以上述获取的rps7-ycf3的基因间隔区的上下游序列为模板，设计引物的序列信息如下：

上游引物序列：5’GCTGACATACCATCACGATAGT 3’(SEQ ID U01)

下游引物序列：5’CGTATTATTTCACCAGACCCTT 3’(SEQ ID U02)

3)引物扩增及结果检测：

将上述扩增引物分别应用于PCR扩增鉴定已知三种浒苔近缘种(浒苔、缘管浒苔和曲浒苔)样品：

以上述获得上下游引物，以浒苔近缘种样品DNA为模板，PCR体系为：

条件为：预变性94℃、5min；94℃变性30s,55℃退火40s,72℃延伸40s,35个循环；最后72℃延伸10min。

扩增产物用1.5倍的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果显示，利用此对引物分别扩增出的DNA片段长度分别约为600bp，分别为有效地扩增出样品的rps7-ycf3片段。

4)确定DNA条形码

将凝胶电泳中的PCR扩增产物切胶，送至测序公司(青岛擎科公司)进行Sanger法DNA测序，使用上述扩增引物(SEQ ID U01)作为测序引物。测序结果表明，使用已知的浒苔近缘种样品作为模板，利用本实施例的通用引物可以有效的扩增出浒苔、缘管浒苔和曲浒苔的上述DNA条形码。

测序得到的用于鉴定浒苔(U.prolifera)的DNA条形码，其核苷酸序列如下(SEQID NO.3)

ATTTGATGTTGGTAAATTTTTATTAAAACATCTGCTACTACTGTAAACGTCTTATCAATAAAATTATCATTTTTTTGTGAACGTGGCATATTTAAATTTAAATTTAATTATTTTTTTACTAGTTTATTATTTTTTAAATAATAAAAAATTTTCTAGCAAAACAAAATCCAAAATCCCCCTTAAAAACGGAATTTTGCAAAAGCTTTATTAGCTTCTGCCATACGATGAACCTCAGTTCGACGTTTTATTGCACCACCAGTTTTTGCAAAAGCATCTAAAATTTCATTTGTTAATTTTAAAACTGAACTATTACCAGCTCTATTACGAGCAGCAGAAAGAATCCATTGAATTGCTAAAACTGTCCCACGTTCAGAATTAACCTCTATTGGTACTTGATAAGCAGAACCTCCTATTCTTTGAGCTTTTACTTCAACTAATGGTTTAACATTTTCAATTGCTTGTTCTAATATTTGTAATGAATTTTGTTCAGTTTTTTCTGAAATTAATTGCATAGTTTGATAAACTATTTTATAAGCTAATGTTTTTTTACCGTCTTTCATAATACGATTAACTAGCATATGAACTAATATACTATCATAATAAGGG

用于鉴定缘管浒苔(U.linza)的DNA条形码，其核苷酸序列如下(SEQ ID No.4)

ATTTGATGTTGGTAAAATTTTTATTAAAACATCTGCTACTACTGTAAACGTCTTATCAATAAAATTATCATTTTTTTGTGAACGTGGCATATTTAAATTTAAATTTAATTATTTTTTTACTAGTTTATTATTTTTTAAATAATAAAAAATTTTCTAGCAAAACAAAATCCAAAATTTGGATTCCCCTTAAAAACGGAATTTTGCAAAAGCTTTATTAGCTTCTGCCATACGATGAACCTCAGTTCGACGTTTTATTGCACCACCAGTTTTTGCAAAAGCATCTAAAACTTCATTTGTTAATTTTAAAACTGAACTATTACCAGCTCTATTACGAGCAGCAGAAAGAATCCATTGAATTGCTAAAACTGTCCCACGTTCAGAATTAACCTCTATTGGTACTTGATAAGCAGAACCTCCTATTCTTTGAGCTTTTACTTCAACTAATGGTTTAACATTTTCAATTGCTTGTTCTAATATTTGTAATGAATTTTGTTCAGTTTTTTCTGAAATTAATTGCATAGTTTGATAAACTATTTTATAAGCTAATGTTTTTTTACCGTCTTTCATAATACGATTAACTAGCATATGAACTAATATACTATCATAATAAGGG

用于鉴定曲浒苔(U.flexuosa)的DNA条形码，其核苷酸序列如下(SEQ ID No.5)

ATTTGATGTTGGTAAATTTTTATTAAAACATCTGCTACTACTGTAAACGTTTTATCAATAAAATTATCATTTTTTTGTGAACGTGGCATATTTAAATTAAATTATTTTTTTTACTAGTTTATTATTTTTAAATAATAAAAAATTTAAAAACGGAATTTTGCAAAAGCTTTGTTAGCTTCTGCCATACGGTGAACCTCAGTTCGACGTTTTATTGCACCACCAGTTTTTGCAAAAGCATCTAAAATTTCATTTGTTAATTTTAAAACTGAACTATTTCCAGCTCTATTACGAGCAGCAGAAAGAATCCATTGAATTGCTAAAACTGTTCCACGTTCAGAATTAACTTCTATTGGTACTTGATAAGCAGAACCTCCTACTCTTTGAGCTTTTACTTCAACTAACGGTTTAACATTTTCAATTGCTTGTTCTAATATTTGTAATGAATTTTGTTCAGTTTTTTCTGAAATTAATTGCATAGTTTGATAAACTATTTTATAAGCTAATGTTTTTTTACCGTCTTTCATAATACGATTAACTAGCATATGAACTAATATGCTATCATAATAAGGG

实施例2

采自山东荣成西霞口的石莼样品，初步形态判断为一种浒苔，但无法确认其物种。用本发明方法进行对比鉴定：

具体步骤如下：

1)利用常规方法提取待检测样品的DNA待用；

2)PCR扩增：

以步骤1)获得样品作为模板，分别以上述实施例获得引物和石莼ITS通用引物分别进行PCR扩增，PCR条件为：预变性94℃、5min；94℃变性30s,55℃退火40s,72℃延伸40s,35个循环；最后72℃延伸10min。

PCR体系为：

3)通过上述PCR扩增产物进行测序：

测定rps7-ycf3片段核苷酸序列为：

ATTTGATGTTGGTAAATTTTTATTAAAACATCTGCTACTACTGTAAACGTCTTATCAATAAAATTATCATTTTTTTGTGAACGTGGCATATTTAAATTTAAATTTAATTATTTTTTTACTAGTTTATTATTTTTTAAATAATAAAAAATTTTCTAGCAAAACAAAATCCAAAATTTGGATTCCCCTTAAAAACGGAATTTTGCAAAAGCTTTATTAGCTTCTGCCATACGATGAACCTCAGTTCGACGTTTTATTGCACCACCAGTTTTTGCAAAAGCATCTAAAACTTCATTTGTTAATTTTAAAACTGAACTATTACCAGCTCTATTACGAGCAGCAGAAAGAATCCATTGAATTGCTAAAACTGTCCCACGTTCAGAATTAACCTCTATTGGTACTTGATAAGCAGAACCTCCTATTCTTTGAGCTTTTACTTCAACTAATGGTTTAACATTTTCAATTGCTTGTTCTAATATTTGTAATGAATTTTGTTCAGTTTTTTCTGAAATTAATTGCATAGTTTGATAAACTATTTTATAAGCTAATGTTTTTTTACCGTCTTTCATAATACGATTAACTAGCATATGAACTAATATACTATCATAATAAGGG

4)碱基序列对比：

将测得rps7-ycf3片段序列与上述序列表中记载的DNA条形码3-5利用MEGA 7.0软件中的Clustal W模块进行DNA全局对比。

由比对结果可知，待测样品和缘管浒苔DNA条形码序列完全一致，和其他浒苔近缘种DNA条形码的序列同源性均低于99％(图2)(其中和浒苔DNA条形码的序列同源性为98.69％，和曲浒苔DNA条形码的序列同源性为97.89％)；

由上述鉴定过程，得出该石莼类绿藻属于石莼属(Ulva)缘管浒苔。

序列表

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 一种鉴定浒苔近缘种的引物对、DNA条形码及其应用和检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 606

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atttgatgtt ggtaaatttt tattaaaaca tctgctacta ctgtaaacgt cttatcaata 60

aaattatcat ttttttgtga acgtggcata tttaaattta aatttaatta tttttttact 120

agtttattat tttttaaata ataaaaaatt ttctagcaaa acaaaatcca aaatccccct 180

taaaaacgga attttgcaaa agctttatta gcttctgcca tacgatgaac ctcagttcga 240

cgttttattg caccaccagt ttttgcaaaa gcatctaaaa tttcatttgt taattttaaa 300

actgaactat taccagctct attacgagca gcagaaagaa tccattgaat tgctaaaact 360

gtcccacgtt cagaattaac ctctattggt acttgataag cagaacctcc tattctttga 420

gcttttactt caactaatgg tttaacattt tcaattgctt gttctaatat ttgtaatgaa 480

ttttgttcag ttttttctga aattaattgc atagtttgat aaactatttt ataagctaat 540

gtttttttac cgtctttcat aatacgatta actagcatat gaactaatat actatcataa 600

taaggg 606

<210> 2

<211> 613

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atttgatgtt ggtaaaattt ttattaaaac atctgctact actgtaaacg tcttatcaat 60

aaaattatca tttttttgtg aacgtggcat atttaaattt aaatttaatt atttttttac 120

tagtttatta ttttttaaat aataaaaaat tttctagcaa aacaaaatcc aaaatttgga 180

ttccccttaa aaacggaatt ttgcaaaagc tttattagct tctgccatac gatgaacctc 240

agttcgacgt tttattgcac caccagtttt tgcaaaagca tctaaaactt catttgttaa 300

ttttaaaact gaactattac cagctctatt acgagcagca gaaagaatcc attgaattgc 360

taaaactgtc ccacgttcag aattaacctc tattggtact tgataagcag aacctcctat 420

tctttgagct tttacttcaa ctaatggttt aacattttca attgcttgtt ctaatatttg 480

taatgaattt tgttcagttt tttctgaaat taattgcata gtttgataaa ctattttata 540

agctaatgtt tttttaccgt ctttcataat acgattaact agcatatgaa ctaatatact 600

atcataataa ggg 613

<210> 3

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atttgatgtt ggtaaatttt tattaaaaca tctgctacta ctgtaaacgt tttatcaata 60

aaattatcat ttttttgtga acgtggcata tttaaattaa attatttttt ttactagttt 120

attattttta aataataaaa aatttaaaaa cggaattttg caaaagcttt gttagcttct 180

gccatacggt gaacctcagt tcgacgtttt attgcaccac cagtttttgc aaaagcatct 240

aaaatttcat ttgttaattt taaaactgaa ctatttccag ctctattacg agcagcagaa 300

agaatccatt gaattgctaa aactgttcca cgttcagaat taacttctat tggtacttga 360

taagcagaac ctcctactct ttgagctttt acttcaacta acggtttaac attttcaatt 420

gcttgttcta atatttgtaa tgaattttgt tcagtttttt ctgaaattaa ttgcatagtt 480

tgataaacta ttttataagc taatgttttt ttaccgtctt tcataatacg attaactagc 540

atatgaacta atatgctatc ataataaggg 570

<210> 4

<211> 612

<212> DNA

<213> 叶绿体(rps7-ycf3)

<400> 4

atttgatgtt ggtaaatttt tattaaaaca tctgctacta ctgtaaacgt cttatcaata 60

aaattatcat ttttttgtga acgtggcata tttaaattta aatttaatta tttttttact 120

agtttattat tttttaaata ataaaaaatt ttctagcaaa acaaaatcca aaatttggat 180

tccccttaaa aacggaattt tgcaaaagct ttattagctt ctgccatacg atgaacctca 240

gttcgacgtt ttattgcacc accagttttt gcaaaagcat ctaaaacttc atttgttaat 300

tttaaaactg aactattacc agctctatta cgagcagcag aaagaatcca ttgaattgct 360

aaaactgtcc cacgttcaga attaacctct attggtactt gataagcaga acctcctatt 420

ctttgagctt ttacttcaac taatggttta acattttcaa ttgcttgttc taatatttgt 480

aatgaatttt gttcagtttt ttctgaaatt aattgcatag tttgataaac tattttataa 540

gctaatgttt ttttaccgtc tttcataata cgattaacta gcatatgaac taatatacta 600

tcataataag gg 612

Claims (5)

1.一种鉴定浒苔近缘种的DNA条形码，其特征在于：DNA条形码为叶绿体rps7-ycf3序列；所述序列由用于鉴定浒苔(U.prolifera)的DNA条形码，为SEQ ID No.3所示的碱基序列；用于鉴定缘管浒苔(U.linza)的DNA条形码，为SEQ ID No.4所示的碱基序列；和，用于鉴定曲浒苔(U.flexuosa)的DNA条形码，为SEQ ID No.5所示的碱基序列组成。

2.按权利要求1所述的鉴定浒苔近缘种的DNA条形码的应用，其特征在于：所述DNA条形码对在鉴定浒苔近缘种中的应用。

3.一种鉴定浒苔近缘种的方法，其特征在于：

1)以待测样品的DNA为模板，以鉴定所述浒苔近缘种的引物对作为引物，进行PCR扩增；

2)将上述扩增获得产物经电泳检测，在595±20bp存在条带，叶绿体rps7-ycf3序列，即为浒苔近缘种，将其进一步测序分析；

3)将在595±20bp存在条带的扩增产物与所述SEQ ID No.3-5所示的DNA条形码进行碱基序列对比，扩增产物与所述SEQ ID No.3-5任意一条所示的DNA条形码的同源性在99.5％以上，即待测的物种来自于所述DNA条形码对应的物种。

4.按权利要求3所述鉴定浒苔近缘种的方法，其特征在于：

所述25μL PCR体系为：

所述PCR条件为：预变性94℃、5min；94℃变性30s,55℃退火40s,72℃延伸40s,35个循环；最后72℃延伸10min。

5.按权利要求3所述鉴定浒苔近缘种的方法，其特征在于：

上游引物序列：5’GCTGACATACCATCACGATAGT 3’(SEQ ID U01)；

下游引物序列：5’CGTATTATTTCACCAGACCCTT 3’(SEQ ID U02)。

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