CN103184283A - Pcr酶切分型检测军团菌试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明为公开了一种PCR酶切分型检测军团菌试剂盒，包括PCR反应液、酶切反应液、阴性对照及阳性对照。采用一对军团菌特异引物扩增16S rRNA基因上的区域，在该扩增片段存在一个嗜肺军团菌特异的酶切位点，通过一个PCR-酶切反应便可对军团菌及嗜肺军团菌进行鉴定。该检测试剂盒操作简便快速，结果直观，且灵敏度高，特异性好，稳定性好，可以广泛应用于可疑菌株、土壤和环境水样本及其它样本的军团菌及嗜肺军团菌的快速鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及军团菌检测和鉴定技术领域，具体是一种PCR酶切分型检测军团菌的试剂盒。
背景技术
军团菌是一种兼性胞内寄生菌，广泛分布在土壤和环境水系统中。是引起军团菌病的重要病原体。近年来，军团菌病在世界各地时有暴发流行。目前已知军团菌虽有58个种，70多个血清型。但临床上80%以上军团菌感染是由嗜肺军团菌引起。因此，军团菌尤其是嗜肺军团菌的鉴定具有重要的现实意义。
目前可供使用的军团菌鉴定方法主要包括军团菌分离培养、生化试验反应、血清学反应、尿可溶性抗原检测、多重PCR检测、RT-PCR及基因测序等。但以上的检测方法均存在不足，如直接分离培养，所需时间长达3～10天，且阳性率低；尿抗原检测仅对嗜肺军团菌1型具有特异性；生化实验对于大量菌株的分类鉴定繁琐费时、准确性较差；血清学检测成本高昂，且易产生交叉反应；多重PCR检测特异性较差；基于荧光共振能量转移原理的杂交探针标记技术价格昂贵、操作复杂；DNA测序是最为准确的军团菌种鉴定方法，但耗时较长，分析困难。因此，基于以上方法建立的各种试剂盒也存在各种不足。
发明内容
本发明为了解决现有技术存在的缺陷，基于在16S rRNA基因片段中的一个嗜肺军团菌特异酶切位点，建立一种新型的PCR-酶切技术检测军团菌试剂盒，可以更为简单、快速、有效的对军团菌及嗜肺军团菌进行准确鉴定。
本发明是这样实现的：一种PCR酶切分型检测军团菌试剂盒，由PCR反应液、酶切反应液、阴阳性对照品组成；
（1）PCR反应液包括：
针对军团菌特异位点设计的上游引物和下游引物各36μl
2×PCR Master Mix 500μl
双蒸水dd H2O 300～340μl
（2）酶切反应液包括：10×酶切缓冲液 40μl
限制性内切酶FastDigest HinfⅠ酶 20μl
双蒸水dd H2O 330～350μl
（3）阴阳性对照品
所述阴性对照为1×104个菌/ml的大肠杆菌培养物 0.5ml
所述阳性对照为1×104个菌/ml的嗜肺军团菌培养物 0.5ml。
进一步地，其中针对军团菌特异位点设计的引物中：
上游引物为Leg 557F，其序列为SEQ ID NO：1，
下游引物为Leg 557R，其序列为SEQ ID NO：2。
PCR酶切分型检测军团菌试剂盒应用于对军团菌的检测及鉴定，使用方法为：
按照待检样品数n＋2配置反应体系，每管取PCR反应液45μl，后分别加入提取的待检基因组DNA模板5μl和阳性对照品和阴性对照品，将上述扩增管放到PCR扩增仪上，按反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，进行30～45个循环，72℃保温5min，得扩增产物，取5μl PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，观察记录结果，如有557bp条带，则是阳性军团菌；
取上述阳性PCR产物10μl于PCR管中，加入2 0μl酶切反应液，37℃水浴5min后，取8μl PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行分析。嗜肺军团菌可被消化为400bp和157bp片段，而非嗜肺军团菌中的阿德莱德军团菌、釜山军团菌和伦敦军团菌可被消化为约257bp和150bp片段，其他非嗜肺军团菌不被消化，仍为557bp，据此可区分嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌。
与现有技术相比，本发明基于嗜肺军团菌特异性酶切位点“GANTC”，建立一种新型的PCR-酶切分析检测试剂盒，同传统的试剂盒在PCR反应、酶切反应及结果判定上完全不同。此外，与先前的试剂盒相比本试剂盒具有电泳片段大结果更易观察、所用的FastDigest HinfⅠ酶成本更加低廉、反应时间更短，仅需5min的优势。而相比其它的检测试剂盒，该试剂盒对仪器设备要求简单，具备PCR高灵敏度的优点，且成本低廉、方便快速，无须DNA抽提便可对环境水样及其它样品中分离的可疑军团菌进行快速检测鉴定，具有很高的实用性。适合于土壤和环境水样标本及其它样本中军团菌的检测。
本发明的军团菌及嗜肺军团菌新检测试剂盒，其主要特点如下：
（1）高特异性：本发明通过对16株嗜肺军团菌（包括15个血清型）、22株非嗜肺军团菌及12株其它非军团菌进行基因分型检测，该试剂盒能准确的鉴定出军团菌及嗜肺军团菌，说明该检测试剂盒特异性很高；
（2）高敏感性和稳定性：本发明建立的检测军团菌试剂盒，大大提高了检测的敏感性，且结果稳定可靠；
（3）操作简便快速；无须先进设备，且结果容易分析；
（4）检测范围广：作为一种军团菌快速检测试剂盒，本发明可以广泛应用于可疑菌株、环境水样本及其它样本中军团菌的快速鉴定。
（5）本专利扩增的片段大，有利于进一步的酶切分析，即电泳片段大分离结果在电泳时更易观察，有利于结果判别。
说明书附图
图1为PCR扩增军团菌的16S rDNA 557bp基因片段电泳图。图中，C：阴性对照；ad：阿德莱德军团菌；bu：釜山军团菌；lp1、lp2和lp3：分别代表嗜肺军团菌血清1-3型；fe：菲氏军团菌；go：戈氏军团菌；oa：橡树岭军团菌；M：DNA分子标记物。
图2为军团菌16S rDNA 557bp基因片段的酶切结果电泳图。图中，ad：阿德莱德军团菌；bu：釜山军团菌；lp1、lp2和lp3：分别代表嗜肺军团菌血清1-3型；fe：菲氏军团菌；go：戈氏军团菌；oa：橡树岭军团菌；M：DNA分子标记物。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
1.本发明所需主要试剂的准备
（1）引物合成。通过对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其它非军团菌的16s rRNA序列比对分析，发现在嗜肺军团菌在该序列中存在一个特异的酶切位点“GANTC”，而非嗜肺军团菌在此位置不存在该位点。据此设计一对军团菌特异引物来扩增含该特异位点的557bp片段，通过该PCR反应可鉴别军团菌与其他细菌。引物对和序列如下：
通过上述设计，获得一对军团菌的特异引物，分别用无菌双蒸水溶解，-20℃保存。
（2）配置PCR反应液（20人份）
PCR反应液主要包括上游引物Leg 557F 36μl (浓度10μmoL/L)、下游引物Leg 557R 36μl (浓度10μmoL/L)、2×PCR Master Mix 500μl、双蒸水dd H2O 328μl。
（3）配置酶切反应液（20人份）
主要包括10×酶切缓冲液FastDidest Buffuer 40μl、双蒸水ddH2O 340μl、限制性内切酶FastDigest HinfⅠ酶 20μl。
（4）配制试剂盒阴性、阳性对照品
分别使用大肠杆菌和嗜肺军团菌标准菌株，采用平板计数法测定菌液浓度，然后稀释至1×104个菌/ml，按0.5ml分装。
将上述制备好的PCR反应液、酶切反应液、阴性对照、阳性对照置于同一包装盒中，组成试剂盒，封装。
2.试剂盒的第一应用实施例(以环境水样本检测为例)
（1）PCR反应检测
按照待检样品数n＋2配置反应体系，每管取PCR反应液45μl，后分别加入提取的待检水样本基因组DNA模板5μl（包括阳性对照和阴性对照），将上述扩增管放到PCR扩增仪上，按反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72延伸℃30s，进行40个循环，72℃保温5min。取5μl PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，观察记录结果，如有557bp 条带，则认为是军团菌阳性，见附图1。
（2）酶切分析及结果判定
取上述阳性PCR产物10μl于PCR管中，加入2 0μl 酶切反应液，37℃水浴5 min后，取8μl PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行分析。嗜肺军团菌可被消化为400bp和157bp片段，而非嗜肺军团菌中的阿德莱德军团菌、釜山军团菌和伦敦军团菌可被消化为约257bp和150bp片段，其他非嗜肺军团菌不被消化，仍为557bp，见附图2。
3.试剂盒的第二应用实施例(以菌株为例)
（1）PCR反应检测
以上取得的基因组DNA为模板，进行PCR反应。按照待检样品数n＋2配置反应体系，每管取PCR反应液45μl，后分别加入提取的菌株基因组DNA模板5μl以及阳性对照和阴性对照，将上述扩增管放到PCR仪上，按反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，进行40个循环；72℃保温5min。取5μl PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，观察记录结果，如有557bp 条带，则认为是军团菌阳性。
注：本发明在试剂盒中增加了阴性对照和阳性对照（参照物），在检测时需随同待检样品同时进行，以检测跟踪整个反应过程。假设有10个待检样本，那么在试验时加上阴性对照和阳性对照就需要配置10＋2个反应体系。
（2）酶切分析及结果判定
取上述阳性PCR产物10μl于PCR管中，加入2 0μl 酶切反应液，37℃水浴5min后，取8μl PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行分析。嗜肺军团菌可被消化为400bp和157bp片段，而非嗜肺军团菌中的阿德莱德军团菌、釜山军团菌和伦敦军团菌可被消化为约257bp和150bp片段，其他非嗜肺军团菌不被消化，仍为557bp，据此可区分嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌。
序 列 表
SEQUENCE LISTING
<110> 广州金域医学检验中心有限公司
<120> PCR酶切分型检测军团菌试剂盒及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctgacactga ggcacgaa18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cggactacga ccgacttt18
Claims (3)
1.一种PCR酶切分型检测军团菌试剂盒，其特征在于：由PCR反应液、酶切反应液、阴阳性对照品组成；
（1）PCR反应液包括：
针对军团菌特异位点设计的上游引物和下游引物各36μl
2×PCR Master Mix 500μl
双蒸水dd H2O 300～340μl
（2）酶切反应液包括：10×酶切缓冲液 40μl
限制性内切酶FastDigest HinfⅠ酶 20μl
双蒸水dd H2O 330～350μl
（3）阴阳性对照品
所述阴性对照为1×104个菌/ml的大肠杆菌培养物 0.5ml
所述阳性对照为1×104个菌/ml的嗜肺军团菌培养物 0.5ml。
2.权利要求1所述的试剂盒，其中针对军团菌特异位点设计的引物中：
上游引物为Leg 557F，其序列为SEQ ID NO：1，
下游引物为Leg 557R，其序列为SEQ ID NO：2。
3.权利要求1或2所述的试剂盒，其应用于对军团菌的检测及鉴定，使用方法为：按照待检样品数n＋2配置反应体系，每管取PCR反应液45μl，后分别加入提取的待检基因组DNA模板5μl和阳性对照品和阴性对照品，将上述扩增管放到PCR扩增仪上，按反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，进行30～45个循环，72℃保温5min，得扩增产物，取5μl PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，观察记录结果，如有557bp条带，则是阳性军团菌；
取上述阳性PCR产物10μl于PCR管中，加入2 0μl酶切反应液，37℃水浴5min后，取8μl PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行分析。嗜肺军团菌可被消化为400bp和157bp片段，而非嗜肺军团菌中的阿德莱德军团菌、釜山军团菌和伦敦军团菌可被消化为约257bp和150bp片段，其他非嗜肺军团菌不被消化，仍为557bp，据此可区分嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌。
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