CN103509854B - Pcr酶切分型快速鉴定土壤和环境水中军团菌的方法 - Google Patents

Pcr酶切分型快速鉴定土壤和环境水中军团菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种PCR酶切分型快速鉴定土壤和环境水中军团菌的方法，包括设计一对引物和一种限制性内切酶、配制CTEN基因组DNA提取液、提取DNA、PCR扩增、电泳、酶切分析等步骤。基于16S rRNA基因序列中的一个嗜肺军团菌特异的酶切位点，设计一对军团菌属特异引物来扩增含该特异位点的557bp片段，通过该PCR反应可鉴别军团菌，再通过HinfⅠ酶对PCR产物酶切，嗜肺军团菌可被消化为400bp和157bp片段。该方法操作简便快速，结果直观，且灵敏度高，特异性好，可以广泛应用于可疑菌株、水样本及其它样本中军团菌及嗜肺军团菌的快速鉴定。

Description

PCR酶切分型快速鉴定土壤和环境水中军团菌的方法
技术领域
本发明涉及军团菌检测鉴定的技术领域，具体为一种通过PCR检测军团菌，再通过酶切技术鉴定嗜肺军团菌的一种方法。
背景技术
军团菌是一种兼性胞内寄生菌，广泛分布在土壤和环境水系统中。是引起军团菌病的重要病原体。目前已确认军团菌有58个种，70多个血清型，但嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）与人类的疾病关系最为密切，据报道，临床上约90%的军团菌病是由嗜肺军团菌引起。因此，军团菌尤其是嗜肺军团菌的快速鉴定显得尤为重要。
目前的军团菌检测鉴定主要依靠军团菌分离培养、生化试验反应、血清学反应、脂肪酸成分分析、多重PCR检测、RT-PCR及基因测序等，但传统的军团菌分离培养法所需时间长，阳性率低，培养基的配置复杂，价格昂贵，且需要专业的技术人员；生化实验对于大量菌株的分类鉴定繁琐费时、准确性较差；血清学检测成本高昂，且易产生交叉反应；脂肪酸成分分析操作复杂，且易受细菌生长条件的影响；多重PCR检测特异性较差；RT-PCR检测及基因测序检测方法虽能准确的鉴定军团菌，但对仪器设备要求高，且耗时长、花费高。因此，一种快速、可靠、且成本低廉的方法鉴定军团菌及嗜肺军团菌是很有必要的。
PCR方法具有很高的特异性与敏感性，它在检测军团菌中有着很广泛的应用，可以通过PCR方法检测军团菌中的特异基因，达到快速检测军团菌的目的。目前可以通过PCR扩增军团菌16S rRNA基因、5S rRNA基因、23S与5S之间的间隔基因、巨噬细胞感染力增强因子（mip）基因检测军团菌。相对而言，16S rRNA基因片段，在军团菌属中最为保守，具有更好的属特异性。
发明内容
为了克服现有技术的障碍，本发明基于在16S rRNA基因序列中一个嗜肺军团菌特异的酶切位点，建立一种更为简单、快速、且成本低廉的方法对军团菌及嗜肺军团菌进行准确鉴定。
本发明是这样实现的：一种PCR酶切分型快速鉴定土壤和环境水中军团菌的方法，步骤如下：
（1）针对军团菌特异位点设计并合成一对引物；
（2）配制CTEN基因组DNA提取液：
（3）提取DNA；
（4）PCR扩增；
（5）琼脂糖凝胶电泳；
（6）酶切分析。
进一步地，其中针对军团菌特异位点设计的引物中：
上游引物为Leg 557F，其序列为SEQ ID NO：1，
下游引物为Leg 557R，其序列为SEQ ID NO：2。
进一步地，各个具体成分、步骤为：
（2）中的CTEN基因组DNA提取液成分为：
Chelex-100溶液  5%
三羟甲基氨甲烷盐酸盐  10mM
乙二胺四乙酸二钠  0.1mM
叠氮钠  0.1%
蛋白酶K  100μg/ml
（3）DNA提取的具体步骤为：
样本离心沉淀后，于沉淀物种中加入CTEN基因组DNA提取液60μl，充分混匀，55℃水浴30min，100℃水浴10min，离心后，上清液即是提取的基因组DNA模板；
（4）PCR扩增的具体步骤为：
PCR反应体系为上游引物和下游引物各1μl，PCR Master Mix 12.5μl，双蒸水 5.5μl，基因组DNA模板5μl，总体系25μl；
PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，进行30～40个循环；72℃保温5min
（5）琼脂糖凝胶电泳的具体步骤为：
取PCR扩增产物5μl经琼脂糖凝胶电泳，如有557bp条带出现则认为军团菌阳性，反之，则认为军团菌阴性；
（6）酶切分析的具体步骤为：
取上述（5）阳性PCR产物10μl于PCR管中，加入2μl 10×Buffer，1μl限制性内切酶FastDigest HinfⅠ酶，用17μl双蒸水补足至30μl，37℃水浴5min后，取8μl PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行分析；嗜肺军团菌可被消化为400bp和157bp片段，而非嗜肺军团菌中的阿德莱德军团菌、釜山军团菌和伦敦军团菌可被消化为约257bp和150bp片段，其他非嗜肺军团菌不被消化，仍为557bp，据此可区分鉴别嗜肺军团菌。
所述酶切反应使用的限制性内切酶为限制性核酸内切酶HinfⅠ的同裂酶，即识别位点为“GANTC”的所有内切酶。
与现有技术相比，本发明基于嗜肺军团菌特异性酶切位点“GANTC”，建立一种新型的PCR酶切分析检测方法，该方法在PCR反应、酶切反应及结果判定上与传统方法完全不同。
此外，本方法具有电泳片段大结果更易观察、所用的限制性内切酶FastDigest HinfⅠ酶成本更加低廉、反应时间更短，仅需5min的优势。
该技术对仪器设备要求简单, 具备PCR高灵敏度的优点, 且成本低廉、方便快速，无须DNA抽提便可对环境水样及其它样品中分离的可疑军团菌进行快速检测鉴定, 具有很高的实用性。
本发明为一种军团菌检测及进一步的嗜肺军团菌鉴定方法，它采用一对军团菌特异引物扩增16S rRNA基因上的区域，在该扩增片段（557bp）上包含有嗜肺军团菌的一个特异性酶切位点，通过一个酶切反应便可对嗜肺军团菌进行鉴定。
本发明根据上述设计的引物和技术方案，通过优化反应体系和扩增条件建立的嗜肺军团菌新检测方法，其主要特点如下：
（1）高特异性：本发明通过对16株嗜肺军团菌（包括15个血清型）、22株非嗜肺军团菌及12株其它非军团菌进行基因分型检测，该方法能准确的鉴定出军团菌和非嗜肺军团菌，说明该方法是一种特异性很高的军团菌及嗜肺军团菌检测方法。
（2）高敏感性：本发明建立的PCR-酶切方法，大大提高了检测的敏感性。
（3）简便快速：无须先进设备，且结果容易分析。
（4）检测范围广：本发明的技术方案设计合理，可以广泛应用于各种水样本中军团菌的快速鉴定。
本发明可以用于可疑菌株、也可以用于水样本及其它环境样本等的军团菌及嗜肺军团菌的快速鉴定，但并不仅限于此。
附图说明
图1为军团菌16S rRNA基因序列分析图。图中，LP系代表嗜肺军团菌该片断中碱基序列，NLP系代表非嗜肺军团菌该片断中碱基序列，黄色部分为酶切位点）。
图2 为PCR扩增军团菌的16S rDNA 557bp基因片段电泳图。图中，C：阴性对照；ad：阿德莱德军团菌；bu：釜山军团菌；lp1、lp2和lp3：分别代表嗜肺军团菌血清1-3型；fe：菲氏军团菌；go：戈氏军团菌；oa：橡树岭军团菌；M：DNA分子标记物。
图3为军团菌16S rDNA 557bp基因片段的酶切结果电泳图。图中，ad：阿德莱德军团菌；bu：釜山军团菌；lp1、lp2和lp3：分别代表嗜肺军团菌血清1-3型；fe：菲氏军团菌；go：戈氏军团菌；oa：橡树岭军团菌；M：DNA分子标记物。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
本发明PCR酶切分型快速检测土壤和环境水中军团菌的方法，包括如下步骤：
1、本发明所需主要试剂的准备
试验所用引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成，2×PCR MasterMix酶体系、DNA Marke 2SD 012购自北京天根生化科技有限公司；限制性内切酶FastDigest HinfⅠ酶购自富酶泰斯生物技术（深圳）有限公司。
PCR引物设计：通过对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌和其它非军团菌的16S rRNA基因序列分析比对，设计选择一对保守引物，用来扩增军团菌16S rRNA基因中一段557bp的保守序列：
上游引物为Leg557F：5’-CTGACACTGAGGCACGAA-3’（SEQ ID NO：1），下游引物为Leg557R：5’-CGGACTACGACCGACTTT-3’（SEQ IDNO：2）。
2、提取待检样本的基因组DNA（以可疑军团菌菌株为例，按本实验室自制提取液进行提取）
向挑取的可疑菌株中加入自配的CTEN基因组DNA提取液60μl（如表1所示），充分混匀，55℃水浴30min，100℃水浴10min，上清液即是基因组DNA模板。
成分 浓度
Chelex-100溶液 5%
三羟甲基氨甲烷盐酸盐（Tris-HCL） [PH 8.3] 10 mM
乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2） 0.1 mM
叠氮钠（NaN3） 0.1%
蛋白酶K（Protease-k）   100μg/ml
水H2O ------
表1  CTEN基因组DNA提取液配方（表中的mM为毫摩尔每升）
3、PCR反应
以提取得的基因组DNA为模板，进行PCR反应，具体反应体系为：PCRMaster Mix 12.5μl, 引物Leg557F和 Leg557R各1 μl (浓度10 μmol/L)，双蒸水dd H2O 5.5μl，模板5 μl，总体系25μl。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃保温5min。取5μl PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，如有557bp条带出现则认为军团菌阳性，反之，则认为军团菌阴性（图2）。
4、酶切分析
在以上反应体系和反应程序完成后，对PCR产物进行酶切反应，分析程序为：取上述PCR产物10μl于PCR管中，加入2μl 10×酶切缓冲液Buffer，1μl 限制性内切酶FastDigest HinfⅠ酶，用17μl双蒸水补足至30μl，37℃水浴5min后，取8μl PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。嗜肺军团菌可被消化为400bp和157bp片段，而非嗜肺军团菌中的阿德莱德军团菌（L. adelaidensis）、釜山军团菌（L. busanensis）和伦敦军团菌（L. londiniensis）可被消化为约257bp和150bp片段，其他非嗜肺军团菌不被消化，仍为557bp，据此可区分嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌（图3）。
序   列   表
SEQUENCE LISTING
<110>  广州金域医学检验中心有限公司
<120>  PCR酶切分型快速鉴定土壤和环境水中军团菌的方法
<160>  2
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  1
ctgacactga ggcacgaa18
<210>  2
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  2
cggactacga ccgacttt18

Claims (1)

1.一种PCR酶切分型快速鉴定土壤和环境水中军团菌的方法，步骤如下：
(1)针对军团菌特异位点设计并合成一对引物：
上游引物为Leg 557F，其序列为SEQ ID NO：1，
下游引物为Leg 557R，其序列为SEQ ID NO：2；
(2)配制CTEN基因组DNA提取液，CTEN基因组DNA提取液成分为：
Chelex-100溶液 5％
三羟甲基氨甲烷盐酸盐 10mM
乙二胺四乙酸二钠 0.1mM
叠氮钠 0.1％
蛋白酶K 100μ g/ml；
(3)提取DNA，
样本离心沉淀后，于沉淀物种中加入CTEN基因组DNA提取液60μl，充分混匀，55℃水浴30min，100℃水浴10min，离心后，上清液即是提取的基因组DNA模板；
(4)PCR扩增，
PCR反应体系为上游引物和下游引物各1μl，PCR Master Mix 12.5μl，双蒸水5.5μl，基因组DNA模板5μl，总体系25μl，
PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，进行30～40个循环；72℃保温5min；
(5)琼脂糖凝胶电泳，
取PCR扩增产物5μl经琼脂糖凝胶电泳，如有557bp条带出现则认为军团菌阳性，反之，则认为军团菌阴性；
(6)酶切分析，
取上述(5)阳性PCR产物10μl于PCR管中，加入2μl 10×Buffer，1μl限制性内切酶FastDigest Hinf Ⅰ酶，用17μl双蒸水补足至30μl，37℃水浴5min后，取8μl PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行分析；嗜肺军团菌可被消化为400bp和157bp片段，而非嗜肺军团菌中的阿德莱德军团菌、釜山军团菌和伦敦军团菌可被消化为约257bp和150bp片段，其他非嗜肺军团菌不被消化，仍为557bp，据此可区分鉴别嗜肺军团菌。
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