CN103103258A - 一种利用多重pcr技术分析花生粕中黄曲霉毒素b1产生趋势的方法 - Google Patents

一种利用多重pcr技术分析花生粕中黄曲霉毒素b1产生趋势的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用多重PCR技术分析花生粕中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法，该方法属于微生物与分子生物学领域，是利用土壤DNA抽提试剂盒提取花生粕基因组DNA，通过黄曲霉毒素B1合成代谢途径的关键酶基因设计引物序列，PCR鉴定潜藏性的黄曲霉毒素产生菌，通过PCR结果指导花生粕的储藏、运输条件控制，也可为研究花生粕中黄曲霉毒素B1的动态变化与控制提供科学依据，具有速度快，可靠性高的优点。

Description

一种利用多重PCR技术分析花生粕中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法
技术领域
本发明属于微生物与分子生物学应用领域，尤其涉及一种利用多重PCR技术分析花生粕中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法。
背景技术
花生粕极易感染黄曲霉和寄生曲霉等微生物，在一定温度与湿度条件下产生黄曲霉毒素。而黄曲霉毒素是目前发现的污染农产品中毒性最强的一类生物毒素，具有极强的致癌、致突变和致畸性；尤其是黄曲霉毒素B1，毒性分别是氰化钾和砒霜的10倍和68倍；黄曲霉毒素的污染，已经成为很多农产品规模应用的瓶颈与人畜生命安全的潜在威胁。
目前黄曲霉菌毒素B1产生菌的鉴定十分困难，主要采用传统的形态学方法，通过光学显微镜观察微生物的形态特征以及平板单菌落的形态学分析，但是这两种方法都很难将黄曲霉毒素B1产生菌与其他非产黄曲霉毒素霉菌区分开来，尽管检测黄曲霉和寄生曲霉的传统方法和分子生物学方法已有许多，但由于花生粕样品成分复杂，对分子生物学方法的直接应用存在较大干扰，难以实现。
发明内容
本发明的目的在于改进已有技术的不足而提供一种具有特异性高、能够快速鉴定花生粕中是否感染黄曲霉毒素B1产生菌、检测花生粕的黄曲霉毒素B1产生的趋势的方法。
本发明的目的是这样实现的，一种利用多重PCR技术分析花生粕中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法，其特征在于提取样品花生粕的基因组DNA后，通过多重PCR扩增黄曲霉毒素B1合成基因，通过PCR结果判断花生粕产生黄曲霉毒素B1的趋势，用于指导花生粕的储藏和运输条件控制。
为了进一步实现本发明的目的，可以是所述样品花生粕采用缩分法取样，最终样品的重量为0.1g。
为了进一步实现本发明的目的，可以是该方法包括以下步骤：
（1）将花生粕进行液氮研磨预处理，用土壤DNA抽提试剂盒提取花生粕基因组DNA，得到的粗DNA用核酸蛋白定量仪检测后存于﹣20℃备用；
    （2）以提取的DNA为模板，用4组引物进行PCR扩增，得到PCR产物，所述4组引物为4对引物序列，第一组引物的正向序列如序列表中SEQ ID -1F所示，第一组引物反向序列则具有表中SEQ ID -1R的碱基序列；第二组正向、反向的序列分别对应于序列表中的SEQ ID -2F和SEQ ID -2R的碱基序列；第三组正向、反向的序列分别对应于序列表中的SEQ ID -3F和SEQ ID -3R的碱基序列；第四组正向、反向的序列分别对应于序列表中的SEQ ID -4F和SEQ ID -4R的碱基序列；
引物名称 序列 产物大小 序列表中的序列号
aflRF TATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGG 24 SEQ ID -1F
aflRR CCGTCAGACAGCCACTCCACACGG 24 SEQ ID -1R
omt-1F GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC 25 SEQ ID -2F
omt-1R GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG 25 SEQ ID -2R
ver-1F GCCGCAGGCCGCGGAGAAAGGTGGT 25 SEQ ID -3F
ver-1R CCGCAGTCAATGGCCATGCAGCG 23 SEQ ID -3R
ITSF TCCGTAGGTGAACCTGCGG 19 SEQ ID -4F
ITSR TCCTCCGCTTATTGATATGC 20 SEQ ID -4R
    （3）PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，根据PCR产物电泳条带的数目，判定花生粕中是否感染黄曲霉毒素产生菌，其中：
当PCR产物有0，1，2,或3个条带时，判定花生粕未感染黄曲霉毒素产生菌；当PCR产物有4个条带时，判定花生粕感染了黄曲霉毒素产生菌，根据条带的丰度确定黄曲霉毒素产生的趋势。
为了进一步实现本发明的目的，可以是所述的PCR扩增是以待测花生粕的DNA为模板，用aflR、omt-1、ver-1和ITS的4对引物进行PCR反应，每次反应均用无菌水代替DNA模板做一个阴性对照，其中：
PCR反应体系（25 μL）：2μL DNA模板、2.5μL 10×PCR Buffer、2μL 10mmol/L dNTP、上下游引物（10nmol/μL）各1μL和0.25μL Taq DNA聚合酶（5U/μL），用超纯水补足总体积；
PCR扩增条件：采用95℃变性4min、94℃变性30s、59℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环，最后72℃延伸5min。
为了进一步实现本发明的目的，可以是根据PCR结果的条带数目，判定花生粕是否感染黄曲霉毒素B1产生菌，根据条带丰度判定黄曲霉毒素B1产生趋势。
本发明分别以aflR、omt-1、ver-1和ITS作为目的基因，根据其碱基序列设计四对引物分别进行合成，四种目的基因所对应的引物分别是SEQ ID -1F（R）、SEQ ID -2F(R)、SEQ ID -3F（R）和SEQ ID -4F（R）；以待测花生粕的DNA为模板，利用以上四对引物进行PCR，对其产物进行检测是否含有以上全部四种基因。如果花生粕中的DNA序列含有以上4个基因，那么可以判定该样品含有黄曲霉毒素B1产生菌，而如果花生粕中的DNA序列中少了以上4种基因中的其中任何一个，可以判定该样品不含有黄曲霉毒素B1产生菌。
本发明提供了利用上述引物鉴定花生粕中是否含有黄曲霉毒素B1产生菌，产生黄曲霉毒素B1的趋势的方法，本发明引物序列特异性高，通过多重PCR技术检测花生粕黄曲霉毒素B1的产生趋势，通过PCR结果指导花生粕的储藏、运输条件控制，也可为研究花生粕中黄曲霉毒素B1的动态变化与控制提供科学依据，速度快，可靠性高。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
图1 为花生粕黄曲霉毒素阳性的琼脂糖凝胶电泳图谱。  
为某批次生产的花生粕通过本方法，以花生粕中的DNA为模板，用上述4对引物进行PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳图谱，从图1可以看出该批花生粕含有黄曲霉毒素B1产生菌，且丰度很高，图中：1为aflR;   2为omt-1;   3为ver-1;  4为ITS。
具体实施方式
实施例，一种利用多重PCR技术分析花生粕中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法，包括：
花生粕基因组DNA提取：取3份经液氮研磨好的花生粕样品，每份0.1g，用土壤DNA抽提试剂盒提取花生粕基因组DNA，详细步骤参照土壤DNA抽提试剂盒说明书，得到的粗DNA用核酸蛋白定量仪检测后存于﹣20℃备用；
引物合成：作为调节基因，aflR编码一个特异性的DNA结合蛋白，可以活化黄曲霉毒素的生物合成途径，而一些编码该合成途径中相关酶的基因已被克隆和测序，如基因omt-1编码柄曲霉素转甲氧基酶，调控它向黄曲霉毒素前体O-甲基柄曲霉素的转化；基因ver-1编码杂色曲菌素A脱氢酶，使其转化为柄曲霉素，此外，ITS序列作为真菌共有的5.8SrDNA序列，也是真菌的分子鉴定所不可或缺的，分别以aflR、omt-1、ver-1和ITS作为目的基因，根据其碱基序列设计四对引物分别进行合成；以提取的DNA为模板，用4组引物进行PCR扩增，得到PCR产物，所述4组引物为4对引物序列，第一组引物的正向序列如序列表中SEQ ID -1F所示，第一组引物反向序列则具有表中SEQ ID -1R的碱基序列；第二组正向、反向的序列分别对应于序列表中的SEQ ID -2F和SEQ ID -2R的碱基序列；第三组正向、反向的序列分别对应于序列表中的SEQ ID -3F和SEQ ID -3R的碱基序列；第四组正向、反向的序列分别对应于序列表中的SEQ ID -4F和SEQ ID -4R的碱基序列；上述引物的具体序列与序列表中的序列对应关系如下表所示：
引物名称 序列 产物大小 序列表中的序列号
aflRF TATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGG 24 SEQ ID -1F
aflRR CCGTCAGACAGCCACTCCACACGG 24 SEQ ID -1R
omt-1F GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC 25 SEQ ID -2F
omt-1R GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG 25 SEQ ID -2R
ver-1F GCCGCAGGCCGCGGAGAAAGGTGGT 25 SEQ ID -3F
ver-1R CCGCAGTCAATGGCCATGCAGCG 23 SEQ ID -3R
ITSF TCCGTAGGTGAACCTGCGG 19 SEQ ID -4F
ITSR TCCTCCGCTTATTGATATGC 20 SEQ ID -4R
上述引物由上海生工生物工程有限公司合成，也可以通过常规的引物合成法合成；
多重PCR：以待测花生粕DNA为模板，用aflR、omt-1、ver-1和ITS的4对引物进行PCR反应，得到PCR产物，每次反应均用无菌水代替DNA模板做一个阴性对照，其中：PCR反应体系（25 μL）：2μL DNA模板、2.5μL 10×PCR Buffer、2μL 10mmol/L dNTP、上下游引物(10nmol/μL)各1μL和0.25μL Taq DNA聚合酶（5U/μL），用超纯水补足总体积；PCR扩增条件：采用95℃变性4min、94℃变性30s、59℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环，最后72℃延伸5min；
结果判定：PCR产物经1.0%的含核酸染料gold view的琼脂糖凝胶电泳进行检测，根据产物的电泳条带数目判断该花生粕是否含有黄曲霉毒素B1产生菌，根据条带的丰度确定黄曲霉毒素B1的产生趋势：当PCR产物有0，1，2,或3个条带时，判定花生粕未感染黄曲霉毒素产生菌；当PCR产物有4个条带时，判定花生粕感染了黄曲霉毒素产生菌。

Claims (5)

1.一种利用多重PCR技术分析花生粕中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法，其特征在于提取样品花生粕的基因组DNA后，通过多重PCR扩增黄曲霉毒素B1合成基因，通过PCR结果判断花生粕产生黄曲霉毒素B1的趋势，用于指导花生粕的储藏和运输条件控制。
2.根据权利要求1所述的一种利用多重PCR技术分析花生粕中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法，其特征在于所述样品花生粕采用缩分法取样，最终样品的重量为0.1g。
3.根据权利要求1所述的一种利用多重PCR技术分析花生粕中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法，其特征是该方法包括以下步骤：
（1）将花生粕进行液氮研磨预处理，用土壤DNA抽提试剂盒提取花生粕基因组DNA，得到的粗DNA用核酸蛋白定量仪检测后存于﹣20℃备用；
（2）以提取的DNA为模板，用4组引物进行PCR扩增，得到PCR产物，所述4组引物为4对引物序列，第一组引物的正向序列如序列表中SEQ ID -1F所示，第一组引物反向序列则具有表中SEQ ID -1R的碱基序列；第二组正向、反向的序列分别对应于序列表中的SEQ ID -2F和SEQ ID -2R的碱基序列；第三组正向、反向的序列分别对应于序列表中的SEQ ID -3F和SEQ ID -3R的碱基序列；第四组正向、反向的序列分别对应于序列表中的SEQ ID -4F和SEQ ID -4R的碱基序列；
引物名称 序列 产物大小 序列表中的序列号 aflRF TATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGG 24 SEQ ID -1F aflRR CCGTCAGACAGCCACTCCACACGG 24 SEQ ID -1R omt-1F GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC 25 SEQ ID -2F omt-1R GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG 25 SEQ ID -2R ver-1F GCCGCAGGCCGCGGAGAAAGGTGGT 25 SEQ ID -3F ver-1R CCGCAGTCAATGGCCATGCAGCG 23 SEQ ID -3R ITSF TCCGTAGGTGAACCTGCGG 19 SEQ ID -4F ITSR TCCTCCGCTTATTGATATGC 20 SEQ ID -4R
    （3）PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，根据PCR产物电泳条带的数目，判定花生粕中是否感染黄曲霉毒素产生菌，其中：
当PCR产物有0，1，2,或3个条带时，判定花生粕未感染黄曲霉毒素产生菌；当PCR产物有4个条带时，判定花生粕感染了黄曲霉毒素产生菌，根据条带的丰度确定黄曲霉毒素产生的趋势。
4.根据权利要求3所述的一种利用多重PCR技术分析花生粕中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法，其特征在于所述的PCR扩增是以待测花生粕的DNA为模板，用aflR、omt-1、ver-1和ITS的4对引物进行PCR反应，每次反应均用无菌水代替DNA模板做一个阴性对照，其中：
PCR反应体系（25 μL）：2μL DNA模板、2.5μL 10×PCR Buffer、2μL 10mmol/L dNTP、上下游引物（10nmol/μL）各1μL和0.25μL Taq DNA聚合酶（5U/μL），用超纯水补足总体积；
PCR扩增条件：采用95℃变性4min、94℃变性30s、59℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环，最后72℃延伸5min。
5.权利要求1所述的一种利用多重PCR技术分析花生粕中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法，其特征在于根据PCR结果的条带数目，判定花生粕是否感染黄曲霉毒素B1产生菌，根据条带丰度判定黄曲霉毒素B1产生趋势。
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