CN105675565A - 一种快速检测黄曲霉毒素b1的方法 - Google Patents

一种快速检测黄曲霉毒素b1的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速检测黄曲霉毒素B1的方法，该方法包括如下步骤：（A）使黄曲霉毒素B1核酸适体Apt与单链信号探针ssDNA杂交，形成杂交链；（B）使该杂交链与待测样品接触，当待测样品中有黄曲霉毒素B1存在时，杂交链与黄曲霉毒素B1反应释放出ssDNA；（C）利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶，将双链DNA水解成单核苷酸而除去双链DNA，此时体系中留下ssDNA；（D）在ssDNA诱导下，铜离子还原生成近红外荧光铜纳米粒子；检测体系荧光强度，从而测定待测样品中的黄曲霉毒素B1的含量。

Description

一种快速检测黄曲霉毒素B1的方法
技术领域
本发明涉及纳米生物传感以及生物检测领域，具体地说，是提供一种快速检测黄曲霉毒素B1的方法。
背景技术
黄曲霉毒素是黄曲霉、寄生曲霉等产生的代谢产物，其中黄曲霉毒素B1是已知的化学物质中致癌性最强的一种，对人畜危害极大。当人摄入含黄曲霉毒素B1污染的食物，可发生急性肝炎、出血性坏死等急性中毒，甚至死亡；当微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，致癌、致畸等。然而，黄曲霉毒素在食品中几乎不可避免，为了保证人民身体健康和生命安全，我国食品卫生标准中规定：玉米、花生油、花生及其制品中黄曲霉毒素不得>20μg/kg；大米、其它食用油不得>10μg/kg；其它粮食、豆类、发酵食品不得>5μg/kg；婴儿代乳食品不得检出黄曲霉毒素。欧盟等国于2002年对粮食，花生及其产品中的黄曲霉毒素B1含量规定，人类直接使用的花生中黄曲霉毒素B1含量需≤2μg/kg，作为食品原料进口的花生黄曲霉毒素B1含量需≤8μg/kg。人们若食品中黄曲霉毒素含量超出一定标准，就会直接威胁到人的健康。因此，建立高选择性、高灵敏的黄曲霉毒素B1的检测方法非常有价值。
目前国内外研究主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、免疫亲和柱法以及酶联免疫法等。TLC法的特异性较差，灵敏度也相对较差，所需标准品浓度较高，潜在的污染性较高。HPLC法需要具有专门操作技术的人员才能进行检测，技术要求高；净化柱消耗较多，检测成本较高，免疫亲和柱特异性较好，但仍然需要专门技术人员才能胜任检测工作，检测技术要求高。免疫法具有操作简便、快捷、污染较小、灵敏度也较高等许多优势，但通常需要用到价格昂贵的酶标试剂、酶、抗原、抗体等生物试剂，而且这些生物试剂也很易失活。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测黄曲霉毒素B1的方法。
本发明采用的技术方案：一种快速检测黄曲霉毒素B1的方法，包括如下步骤：
（A）黄曲霉毒素B1核酸适体Apt与单链信号探针ssDNA杂交，形成杂交链；
（B）将待测样品溶液加入到该杂交链溶液，当待测样品中有黄曲霉毒素B1时，杂交链选择性地与黄曲霉毒素B1反应释放出单链信号探针ssDNA；
（C）消除杂交链的干扰，利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用核酸外切酶，将双链DNA水解成单核苷酸而除去双链DNA，留下单链信号探针ssDNA；
（D）利用黄曲霉毒素B1核酸适体-黄曲霉毒素结合体不能诱导铜离子还原成近红外荧光的铜纳米粒子，只有单链信号探针ssDNA能诱导铜离子还原成近红外荧光铜纳米粒子，在铜离子还原检测体系中检测体系荧光强度，从而测定待测样品中的黄曲霉毒素B1的含量。
所述铜离子还原检测体系包括先后添加的铜离子和使铜离子还原成近红外荧光铜纳米粒子的维生素C还原剂。步骤（D）的检测，例如包括依次先后向体系中加入铜离子溶液和维生素C溶液，反应后生成近红外荧光铜纳米粒子。
所述黄曲霉毒素B1核酸适体为5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGC TAGGCCCACA-3’。
所述的单链信号探针ssDNA为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGGGCCTAGCG-3’。
本发明的检测原理如下：先让Apt与ssDNA杂交；当有黄曲霉毒素B1存在时，杂交链与黄曲霉毒素B1反应释放出ssDNA；体系中存在Apt-ssDNA(剩余的)，Apt-黄曲霉毒素B1和ssDNA。Apt-黄曲霉毒素B1不能诱导铜离子还原成近红外荧光铜纳米粒子，Apt-黄曲霉毒素B1存在对测定无干扰；杂交链可能有干扰；为了消除杂交链的干扰：a.利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，b.用核酸外切酶，将双链DNA水解成单核苷酸而除去双链DNA。此时体系中只留下可诱导生成近红外荧光铜纳米粒子的ssDNA，通过检测体系的荧光强度，可以测定黄曲霉毒素B1的含量。由于消除体系中背景荧光的干扰，提高了检测的灵敏度和精度。
本发明还提供了一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其至少包括：黄曲霉毒素B1核酸适体、单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、外切酶、铜离子还原检测体系。
所述黄曲霉毒素B1核酸适体为5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’。
所述的单链信号探针ssDNA为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGGGCCTAGCG-3’。
所述DNA扩增体系包括缓冲溶液、三磷酸脱氧单核苷酸混合溶液dNTP和Phi29DNA聚合酶;所述缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4组成。
所述外切酶为ExoIII核酸外切酶。
所述的铜离子还原检测体系中还原剂为维生素C。
本发明还提供了一种可用于检测黄曲霉毒素B1的黄曲霉毒素B1核酸适体，其碱基序列为5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’。
本发明的优点
根据本发明的检测方法和试剂盒，消除了背景荧光的干扰，提高了黄曲霉毒素B1的检测灵敏度和精度。
附图说明
图1为ssDNA–铜纳米粒子荧光强度与黄曲霉毒素B1的浓度关系。
具体实施方式
实施例1
一种快速检测黄曲霉毒素B1的试剂盒至少包括：黄曲霉毒素B1核酸适体、单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、铜离子还原检测体系。所述的黄曲霉毒素B1核酸适体为5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’。所述的单链信号探针ssDNA为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGGGCCTAGCG-3’。所述的DNA扩增体系包括缓冲溶液、dNTP和Phi29DNA聚合酶。所的述核酸外切酶为ExoIII核酸外切酶。所述的铜离子还原检测体系中的还原剂为维生素C。所述缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4组成。
实施例2
一种快速检测黄曲霉毒素B1的方法，具体操作过程如下：
将各DNA储备液在95℃下经加热处理5分钟，使用前，并在室温下放置30分钟。然后，分别取含3.0μmol黄曲霉毒素B1核酸适体Apt的杂交缓冲溶液40μL和3.0μmol信号探针ssDNA的杂交缓冲溶液40μL置于2ml离心管中，在37℃下杂交1小时，生成黄曲霉毒素B1核酸适体-信号探针杂交物（Apt-ssDNA）。
在37℃下，分别依次将浓度为0~2ng/mL的黄曲霉毒素B1添加到Apt-ssDNA溶液中，黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B1核酸适体反应，生成核酸适体-黄曲霉毒素B1，释放出ssDNA。这时，体系中有ssDNA、剩余（未反应的）APT-ssDNA和核酸适体-黄曲霉毒素B1等物质。
加入10μL缓冲溶液（缓冲溶液组成为50mMTris-HCl,10mMMgCl2，10mM(NH4)2SO4,pH7.8），然后加入dNTP(10mM)18μL。再向体系中加入2μLPhi29DNA聚合酶(10u/μl),在37℃下反应15分钟，使得以黄曲霉毒素B1核酸适体-信号探针杂交序列（Ap-ssDNA）为摸板扩增成双链DNA。在65℃下保持10分钟使Phi29DNA去活。
再向该反应体系中加入2μLExoIII核酸外切酶（20u/μL），在37℃下反应30分钟，使选择性地将双链DNA水解成单核苷酸而除去，单链探针ssDNA因反应速度极慢不水解而保留下来。
向反应液中加入25μL1mmol硝酸铜和200μLPBS缓冲液（10mM，pH7.8）。然后，混合物在室温下避光或暗室中放置10分钟后，在快速搅拌下，加入100μL浓度为1mM的新制备的维生素C溶液。然后在45℃下反应5~10min。将溶液转移至微量比色皿，测定体系的荧光强度，进行黄曲霉毒素B1的定量测定，结果如图1所示。
线性范围0.01–15ng/mL，检测限5pg/mL，回收率在94.8~108.6%。其它真菌毒素等生物小分子黄曲霉毒素B1的检测无干扰。
<110>湖南科技大学
<120>一种快速检测黄曲霉毒素B1的方法
<160>2
<210>1
<211>50
<212>DNA
<213>黄曲霉毒素B1核酸适体
<400>1
5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’
<210>2
<211>53
<212>DNA
<213>单链信号探针
<400>2
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGGGCCTAGCG-3’

Claims (9)

1.一种快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征是，该方法包括如下步骤：
（A）黄曲霉毒素B1核酸适体Apt与单链信号探针ssDNA杂交，形成杂交链；
（B）使该杂交链与待测样品作用，当待测样品中有黄曲霉毒素B1存在时，杂交链选择性地与黄曲霉毒素B1反应释放出单链信号探针ssDNA；
（C）为了消除杂交链的干扰，利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶，将双链DNA水解成单核苷酸而除去双链DNA，留下单链信号探针ssDNA；
（D）利用黄曲霉毒素B1核酸适体-黄曲霉毒素B1结合体不能诱导铜离子还原生成近红外荧光的铜纳米粒子，只有单链信号探针ssDNA能够诱导铜离子还原成近红外荧光铜纳米粒子，检测体系的荧光强度，从而测定待测样品中的黄曲霉毒素B1的含量。
2.根据权利要求1所述的快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征是，所述黄曲霉毒素B1核酸适体为5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’。
3.根据权利要求1或2所述的快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征是，所述的单链信号探针ssDNA为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGGGCCTAGCG-3’。
4.权利要求1所述的快速检测黄曲霉毒素B1的方法，包括检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其至少包括：黄曲霉毒素B1核酸适体、单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、铜离子还原检测体系。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征是，所述黄曲霉毒素B1核酸适体为5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征是，所述的单链信号探针DNA为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGGGCCTAGCG-3’。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征是，所述DNA扩增体系包括缓冲溶液、dNTP和Phi29DNA聚合酶;所述缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4组成。
8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征是，所述核酸外切酶为ExoIII核酸外切酶。
9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征是，所述的铜离子还原检测体系中还原剂为维生素C。
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