CN108444992B - 一种黄曲霉毒素定量检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种检测样品中黄曲霉毒素B1(AFB1)含量的方法及酶联核酸适体(ELLA)定量检测试剂盒，采用加以改进的直接竞争ELLA检测模式，采用高特异性、高亲和力的寡核苷酸片段，精确度高、重复性强、稳定性好：将核酸适体作为对靶物质的识别元件，并与辣根过氧化物酶催化底物3，3′，5，5′‑四甲基联苯胺(TMB)放大反应信号相结合，建立了酶联核酸适体检测AFB1的方法。依据此原理对AFB1定量检测试剂盒进行研制。该试剂盒理论检出限为0.7ng/ml，灵敏度高；花生样品的变异系数为3.54％～5.01％；玉米样品中的变异系数为3.97％～7.59％，精密度良好。

Description

一种黄曲霉毒素定量检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及食品安全检测领域，特别是涉及用于定量检测黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)的酶联核酸适体试剂盒及其检测方法，属于食品安全检测领域。
背景技术
黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)是由黄曲霉、特曲霉以及寄生曲霉等产生的一类含有二氢呋喃环结构的次生代谢产物，被世界卫生组织认定为I级天然致癌物。AFB1主要存在于玉米、花生、坚果和棉籽等食物中，其毒性之强、污染之广对生物环境、食品安全及人类健康造成了巨大威胁。AFB1进入人和动物体内后，会引起细胞错误的修复DNA，导致DNA诱变。肝脏成为其最主要攻击的靶器官，慢性毒性会使肝脏出现一系列亚急性或慢性损伤，甚至诱发肝癌。
目前，国内外常用的检测的AFB1的方法有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MC)、酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫层析法(IC)等。虽然这些方法能够达到定量或半定量的检测AFB1的目的，但是这些方法都存在一定的缺点：薄层色谱法操作步骤较为繁琐、检出限高，试剂对操作者危害大，且测定结果容易受到样品中其它物质的干扰；高效液相色谱法净化后的样品需进一步衍生，操作繁琐、仪器昂贵，不适合大批量检测及现场检测；液相色谱-质谱联用法易产生离子抑制现象，且对样品纯度要求高，设备操作复杂，仪器价格昂贵；酶联免疫吸附法所需的抗体制备成本高，保存条件苛刻，易出现假阳性结果；免疫层析法除了特异性的吸附外，可能会因分子的错误识别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质从而对检测结果造成一定影响。
AFB1的严重污染影响人们赖以生存的环境、威胁食品安全、危害人类健康，为了广大消费者的身体健康，解决这一毒性强、危害大、管控难、检测要求高的问题已经迫在眉睫，因此一种方便、快速、灵敏的AFB1检测方法已成当务之急。
发明内容
为了克服上述现有技术中的不足，本发明提供一种检测精确度高、重复性强、稳定性好，能广泛用于食品安全部门定量检测AFB1的试剂盒及其检测方法。
具体地，本发明的技术方案如下：
一种黄曲霉毒素B1的检测试剂盒，其特征在于：包括黄曲霉毒素B1标准品、酶标板、第一生物素标记的黄曲霉毒素B1核酸适体、第二生物素标记的互补链、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-SA)、显色液、终止液。
进一步地，所述酶标板为96孔酶标板，和/或所述显色液为3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)。
进一步地，其中AFB1标准品被配置成AFB1标准工作液，所述AFB1标准工作液的浓度为0～100ng/ml。
进一步地，其中所述酶标板包被液为0.05～0.2M的碳酸缓冲液、3～6μg/ml的链霉亲和素包被并用2～4％牛血清蛋白封闭，生物素标记的AFB1核酸适体浓度为100nM，生物素标记的互补链浓度为15nM，终止液H2SO4的浓度为1M。
进一步地，所述第一生物素其序列为：5′-biotin-GTTGGGCACGTGTTGTCTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3′；和/或所述第二生物素其序列为5′-biotin-TGTGGGCCTAGCG-3′。
一种黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
设定酶标仪检测参数；
选择合适的酶标板，所述酶标板的孔至少包括样品孔和对照孔，在所述酶标板的每个孔中加入第一生物素标记的黄曲霉毒素B1核酸适体，并进行孵育和洗涤；
在所述酶标板的每个孔中加入第二生物素标记的互补链，并进行孵育和洗涤；
在所述样品孔中加入待测样品，所述对照孔中加入等体积的阴性对照液，并进行孵育和洗涤；
在所述酶标板的每个孔中加入HRP-SA，并进行孵育和洗涤；
在所述酶标板的每个孔中加入显色液，反应后再加入终止液终止反应；
用酶标仪读取所述酶标板各孔吸光度值，并记录数据，计算样品中黄曲霉毒素B1的浓度。
进一步地，所述吸光度值的测试，采用双波长检测，测A450nm/620nm。
进一步地，所述显色液为3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)，和/或所述终止液为H2SO4。
进一步地，所述第一生物素其序列为：5′-biotin-GTTGGGCACGTGTTGTCTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3；和/或所述第二生物素其序列为5′-biotin-TGTGGGCCTAGCG-3′。
进一步地，其中所述酶标版的包被液为0.05～0.2M的碳酸缓冲液，3～6μg/ml的链霉亲和素包被并用2～4％牛血清蛋白封闭。
本发明的原理，首先将链霉亲和素包被于酶标板上，随后加入生物素标记的核酸适体，由于链霉亲和素与生物素之间能以非共价作用高亲和力牢固结合，核酸适体将固定于酶标板上，向体系中加入生物素标记的互补链时，核酸适体与互补链因其之间的碱基互补配对将结合在一起。随后分别向体系加入待测物、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，当待测样品中无AFB1存在时，链霉亲和素与互补链上的生物素结合使辣根过氧化物酶停留在酶标板上，加入TMB显色液催化显蓝色，加入硫酸终止反应后呈黄色。当待测样品中有AFB1存在时，核酸适体与AFB1特异性紧密结合迫使互补链脱落，后期加入的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素无法停留在酶标板上，随着AFB1浓度增大，检测体系颜色越浅，吸光度值越小。
附图说明
图1本发明的反应原理示意图；
图2酶联核酸适体法检测AFB1的标准曲线；
图3本发明的ELAA试剂盒稳定性检测结果曲线；
图4本发明的试剂盒特异性测试示意图；
图中：TMB：3，3′，5，5′-四甲基联苯胺；H2SO4：硫酸；Streptavidin(SA)-链霉亲和素；Biotin-生物素；AFB1-黄曲霉毒素B1；HRP-SA-辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；Biotin-aptamer-生物素标记的核酸适体；Biotin-complementaryoligonucleotide-生物素标记的核酸适体互补链。
具体实施方式
下面结合附图和具体实例，对本发明作进一步的说明：
参见图1，本发明依照如下原理实现AFB1检测：首先将链霉亲和素包被于酶标板上，随后加入生物素标记的核酸适体，由于链霉亲和素与生物素之间能以非共价作用高亲和力牢固结合，核酸适体将固定于酶标板上，向体系中加入生物素标记的互补链时，核酸适体与互补链因其之间的碱基互补配对将结合在一起。随后分别向体系加入待测物、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，当待测样品中无AFB1存在时，链霉亲和素与互补链上的生物素结合使辣根过氧化物酶停留在酶标板上，加入TMB显色液催化显蓝色，加入硫酸终止反应后呈黄色。当待测样品中有AFB1存在时，核酸适体与AFB1特异性紧密结合迫使互补链脱落，后期加入的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素无法停留在酶标板上，随着AFB1浓度增大，检测体系颜色越浅，吸光度值越小。
基于上述原理，本发明提出的用于定量检测食品中AFB1的酶联核酸适体试剂盒，包括AFB1标准品、酶标板、第一生物素标记的AFB1核酸适体、第二生物素标记的互补链、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-SA)、显色液、终止液；其中AFB1标准品工作液浓度例如分别为0、0.1、1、10、20、40、60、80、100ng/ml；酶标板例如采用96孔酶标板，酶标板的包被液为0.05～0.2M的碳酸缓冲液，3～6μg/ml的链霉亲和素包被并用2～4％牛血清蛋白封闭，第一生物素标记的AFB1核酸适体浓度为100nM，第二生物素标记的互补链浓度为15nM，终止液例如采用H2SO4，其浓度为1M。
本发明的AFB1核酸适体经第一生物素标记，其序列为：5′-biotin-GTTGGGCACGTGTTGTCTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3′，互补链经第二生物素标记序列为5′-biotin-TGTGGGCCTAGCG-3′。其中，寡核苷酸使用前于-20℃冰箱保存，所有溶液及缓冲液均用纯净水配制。
其中AFB1标准液的制备方法：准确吸取10mL乙腈、用注射器注入装有5mgAFB1纯品的棕色瓶中，配置成300～1000μg/mLAFB1母液，充分混合均匀后，避光密闭保存于-20℃冰箱备用。实验时使用磷酸盐缓冲液(PBS)工作液进行梯度稀释。
一种AFB1的检测方法，具体步骤如下：
(1)依照反应原理和仪器性能设定检验参数；
(2)由待测样品数量确定所需酶标板数目，每个孔都加入生物素标记的AFB1核酸适体，例如37℃孵育约1h，洗涤三次；每个孔加入生物素标记的互补链，例如37℃孵育约1h，洗涤三次；
(3)样品孔加入待测样品，对照孔加入等体积的阴性对照液，例如37℃孵育约1h，洗涤三次；
(4)每孔加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-SA)，例如37℃孵育约1h，洗涤五次；
(5)每孔加入显色液，反应后每孔加入终止液H2SO4 100μL终止反应；
(6)用酶标仪读取各孔吸光度值，并记录数据，计算样品中AFB1的浓度。
所述的吸光度法采用双波长检测，测A450nm/620m。
实施例1
本发明提供一种用于定量检测食品中AFB1的酶联核酸适体试剂盒，包括AFB1标准品、96孔酶标版、生物素标记的AFB1核酸适体、生物素标记的互补链、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-SA)、显色液3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、终止液H2SO4。
(1)AFB1核酸适体及互补链的制备方法：
经第一生物素标记，其序列为：5′-biotin-GTTGGGCACGTGTTGTCTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3′，互补链经第二生物素标记序列为5′-biotin-TGTGGGCCTAGCG-3′。寡核苷酸使用前于-20℃冰箱保存，所有溶液及缓冲液均用纯净水配制。
(2)试剂盒试剂的配置：
AFB1标准液：准确吸取10mL乙腈、用注射器注入装有5mg AFB1纯品的棕色瓶中，配置成300～1000μg/mLAFB1母液，充分混合均匀后，避光密闭保存于-20℃冰箱备用。实验时使用PBS工作液进行梯度稀释。
碳酸缓冲液(CB，0.05M，pH9.6)：准确称取Na2CO30.795g，NaHCO3 1.465g，加水450mL调pH至9.6后定容至500mL。
洗脱液(PBST)：准确称取0.25g Tween20，使之溶解于500mLPBS缓冲液中。
2％牛血清蛋白(BSA)：准确称取0.5g牛血清蛋白，使之溶解于25mLPBS缓冲液中。
1MH2SO4：准确吸取2.7mL浓硫酸，注入装有45mL纯净水的烧杯，不断搅拌，转移并用纯净水定容至50mL容量瓶。
实施例2
本发明所提出的用于定量检测食品中AFB1的酶联核酸适体试剂盒，其用于检测食品中AFB1的检测方法的具体步骤如下：
(1)依照反应原理和仪器性能设定检验参数，选用酶标仪双波长法测A450nm/620nm。
(2)用PBS结合缓冲液将AFB1母液稀释成0、0.1、1、10、20、40、60、80、100ng/mL，在优化好的检测体系中进行标准曲线的建立。
(3)由待测样品数量确定所需酶标板数目，标记样品孔和对照孔都加入100μL生物素标记的AFB1核酸适体，37℃孵育1h，洗涤三次；
(4)每孔加入100μL生物素标记的互补链，37℃孵育1h，洗涤三次；
(5)样品孔加入100μL待测样品，对照孔加入等体积的阴性对照液，37℃孵育1h，洗涤三次；
(6)每孔加入100μLHRP-SA，37℃孵育1h，洗涤五次；
(7)每孔加入100μLTMB，室温反应5min，每孔加入终止液H2SO4100μL终止反应；
(8)用酶标仪读取各孔A450nm/620mn值，并记录数据，将各孔A450nm/620nm值代入线性回归方程，计算样品中AFB1的浓度。
试剂盒的灵敏度、准确度、精密度、稳定性及特异性试验
(1)试剂盒的灵敏度实验
根据实例2的酶联核酸适体检测法测定20份空白标准品，计算A450nm/620nm的平均值和标准偏差(SD)。按照国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)提出的计算公式LOD＝3SD/S(S为线性回归方程斜率)进行计算，得到该试剂盒理论上的检测下限，即灵敏度。其结果为：
A450nm/620nm均值为1.0600，标准偏差(SD)为0.0024。标准曲线线性方程为Y＝-0.01x+0.95705(R2＝0.9901)，线性范围为1～80ng/mL，通过LOD＝3SD/S计算得到该试剂盒理论上的检测下限值为0.7ng/mL，灵敏度较强。
(2)试剂盒的准确度试验
将AFB1标准品添加到花生、玉米样品中，使AFB1浓度分别为5、20、60μg/kg，
每个浓度设6个重复，计算回收率和变异系数(CV)。结果见下表1
表1ELAA试剂盒测定样品中AFB1添加回收率实验结果
Figure BDA0001575145700000071
结果表明，花生中的AFB1回收率为84.34％～89.96％，变异系数为3.54％～5.01％；玉米中的AFB1回收率为79.30％～90.43％，变异系数为3.97％～7.59％。对于花生、玉米两种不同的样品，本试剂盒的检测回收率均高于79％，变异系数均小于8％，表明本方法准确可靠。
(3)试剂盒的精密度试验
在添加回收实验中，取同一批次预包被酶标板，对同批样品进行检测，计算批内变异系数，得到同批样品中的精密度。对6批不同批样品进行检测，计算批间变异系数，得到不同批次样品的精密度。结果见表2。
表2ELAA试剂盒测定样品中AFB1的精密度实验结果
Figure BDA0001575145700000072
结果表明，以花生为样品的批内变异系数在3.93％～5.20％之间，批间变异系数在6.00％～8.36％之间；以玉米为样品的批内变异系数在3.97％～6.59％之间，批间变异系数在4.62％～9.36％之间。对于花生、玉米两种不同的样品，批内变异系数均小于7％，批间变异系数均小于10％，表明该试剂盒精密度良好。
(4)试剂盒的稳定性试验
将试剂盒于4℃放置，分别于0、10、20、30、40、50、60天时取出，测定10ng/mLAFB1，每10天平行检测6次，记录A450nm/620nm，以时间为横坐标，A450nm/620nm为纵坐标作图，观察其数值变化并计算全部数据的变异系数。结果见图3。
结果表明，60天中试剂盒检测10ng/mLAFB1的平均A450nm/620nm数值为0.859，标准偏差为0.059，变异系数为6.92％，表明该试剂盒稳定性良好。
(5)试剂盒的特异性试验
采用PBS缓冲液将赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、雪腐镰刀菌烯醇(DON)配制成100ng/mL作为待测样品进行反应，观察反应系统中不同毒素使检测体系发生的颜色变化及A450nm/620nm变化。其中加入100ng/mLDON、OTA、ZEN颜色较深，与空白对照的颜色相近；而100ng/mL AFB1存在下的颜色接近无色，与空白对照及高浓度其他生物毒素颜色相差较大。
结果表明，加入100ng/mLDON、OTA、ZEN的吸光度值与阴性状态时的吸光度值无明显差异，而100ng/mLAFB1存在下的吸光度值与空白对照及高浓度其他生物毒素均有显著差异，结果见图4。说明实验所选用的核酸适体对AFB1具有极强的识别选择性，本发明基于酶联核酸适体法研制的AFB1ELAA定量检测试剂盒特异性较强。
以上实施例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代和改进等，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围之内。
序列表
<110> 河南工业大学
<120> 一种黄曲霉毒素定量检测试剂盒及其检测方法
<130> F045
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
gttgggcacg tgttgtctgt ctcgtgccct tcgctaggcc caca 44
<210> 2
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
tgtgggccta gcg 13

Claims (10)

1.一种黄曲霉毒素B1的检测试剂盒，其特征在于：包括黄曲霉毒素B1标准品、酶标板、链酶亲和素、第一生物素标记的黄曲霉毒素B1核酸适体、第二生物素标记的互补链、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-SA)、显色液、终止液。
2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1的检测试剂盒，其特征在于：所述酶标板为96孔酶标板，和/或所述显色液为3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)。
3.根据权利要求1或2所述的黄曲霉毒素B1的检测试剂盒，其特征在于：其中黄曲霉毒素B1标准品被配置成黄曲霉毒素B1标准工作液，所述黄曲霉毒素B1标准工作液的浓度为0～100ng/ml。
4.根据权利要求1或2所述的黄曲霉毒素B1的检测试剂盒，其中所述酶标板 的包被液为0.05～0.2M的碳酸缓冲液，3～6μg/ml的链霉亲和素包被并用2～4％牛血清蛋白封闭。
5.根据权利要求1或2所述的黄曲霉毒素B1的检测试剂盒，其特征在于：第一生物素序列如SEQ ID NO：1所示，且所述第一生物素序列的5′末端经生物素标记，和/或第二生物素序列如SEQ ID NO：2所示，且所述第二生物素序列的5′末端经生物素标记；其中，
所述SEQ ID NO：1序列为：
5′-biotin-GTTGGGCACGTGTTGTCTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3′；
所述SEQ ID NO：2序列为：5′-biotin-TGTGGGCCTAGCG-3′。
6.一种黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
设定酶标仪检测参数；
选择合适的酶标板，并将链酶亲和素包被于所述酶标板上，所述酶标板的孔至少包括样品孔和对照孔，在所述酶标板的每个孔中加入第一生物素标记的黄曲霉毒素B1核酸适体，并进行孵育和洗涤；
在所述酶标板的每个孔中加入第二生物素标记的互补链，并进行孵育和洗涤；
在所述样品孔中加入待测样品，所述对照孔中加入等体积的阴性对照液，并进行孵育和洗涤；
在所述酶标板的每个孔中加入HRP-SA，并进行孵育和洗涤；
在所述酶标板的每个孔中加入显色液，反应后再加入终止液终止反应；
用酶标仪读取所述酶标板各孔吸光度值，并记录数据，计算样品中黄曲霉毒素B1的浓度。
7.根据权利要求6所述的黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，所述吸光度值的测试，采用双波长检测，测A450nm/620nm。
8.根据权利要求6所述的黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，所述显色液为3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)，和/或所述终止液为H2SO4。
9.根据权利要求6所述的黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，第一生物素序列如SEQID NO：1所示，且所述第一生物素序列的5′末端经生物素标记，和/或第二生物素序列如SEQID NO：2所示，且所述第二生物素序列的5′末端经生物素标记；其中，
所述SEQ ID NO：1序列为：
5′-biotin-GTTGGGCACGTGTTGTCTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3′；
所述SEQ ID NO：2序列为：5′-biotin-TGTGGGCCTAGCG-3′。
10.根据权利要求6所述的黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，其中所述酶标板的包被液为0.05～0.2M的碳酸缓冲液，3～6μg/ml的链霉亲和素包被并用2～4％牛血清蛋白封闭。
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