CN106841603B - 一种利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素b1的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于黄曲霉毒素B1的定量检测领域，公开了一种利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，利用纳米金标记黄曲霉毒素的核酸适配体，通过黄曲霉毒素B1单克隆抗体、核酸适配体与目标物黄曲霉毒素B1结合，形成具有夹心式结构的单克隆抗体‑黄曲霉毒素B1‑检测探针复合物，具有更强的特异性，与待测物中的目标分子结合效果好，检测结果更加精确、定量检测范围更广，具有体积小、成本低、操作简单的特点。

Description

一种利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法
技术领域
本发明属于黄曲霉毒素B1的定量检测领域，具体涉及一种利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法。
背景技术
黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物。目前已鉴定分离出AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、AFP1、AFQ1和AFH1等十多种黄曲霉毒素，其中黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，简称AFB1)的毒性和致癌性最强。AFB1的强毒性、高致癌性以及存在的广泛性，对人类健康安全和畜牧业等造成了严重的威胁，因此开发黄曲霉毒素B1的高灵敏检测方法是国内外关注的热点。
核酸适配体是一段寡聚核苷酸，功能与抗体相似，能够特异性结合靶目标分子，凭借其与抗体相比的众多优点吸引了研究人员的广泛关注，如低成本、高稳定性、易修饰、易合成、不需要活体动物或细胞、可重复利用等。
家用便携式血糖仪能够对血糖进行准确的测量，并且具有体积小、成本低和操作简单的特点，成为预防糖尿病的有用工具，是很多家庭的医疗必备品。但它们只能对单一目标物血糖(葡萄糖)进行检测，难以应用于不同类型目标物的检测，这大大限制了这些便携式仪器即时检测的应用范围。怎样利用血糖仪检测非糖靶目标，吸引了研究人员的关注。
目前可分离定量检测AFB1的方法主要有薄层色谱法，高效液相色谱法，液相色谱-串联质谱法以及免疫分析方法。这些方法大多需要体积庞大、价格昂贵的检测设备，并且操作步骤繁琐，检测周期长，不利于现场即时检测。因此，开发一种基于血糖仪检测黄曲霉素B1的方法，实现对黄曲霉素B1这一非糖靶目标的快速简单、高灵敏度检测，具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明目的是提供一种利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法，通过抗体、核酸适配体同时与目标物结合，具有更强的特异性，与待测物中的目标分子结合效果好，检测结果更加精确、定量检测范围广，具有体积小、成本低、操作简单的特点。
为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法，包括以下步骤：
步骤一：制备纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物；
步骤二：将黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，4℃孵育12h；用缓冲液B冲洗；然后加入封闭缓冲液，室温封闭1h；用缓冲液A冲洗，完成黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的固定；
步骤三：向步骤二的黄曲霉毒素B1的单克隆抗体中加入不同浓度的黄曲霉毒素B1待测液，37℃孵育1h，使黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B1的单克隆抗体进行特异性结合，用缓冲液A冲洗未与单克隆抗体结合的黄曲霉毒素B1，得到黄曲霉毒素B1与单克隆抗体的结合体；
步骤四：在步骤三所得的结合体中加入步骤一制备的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物，37℃孵育2h，形成具有夹心式结构的单克隆抗体-黄曲霉毒素B1-检测探针复合物，未与结合体上的黄曲霉毒素B1结合的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物留在上层上清液中；
步骤五：取步骤四的上清液，加入蔗糖溶液，37℃孵育30min后，用血糖仪进行定量检测。
进一步地，所述制备纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物的步骤如下：
a)将蔗糖酶加入到胶体金中混合，4℃孵育6h，得到纳米金-蔗糖酶复合物；
b)向黄曲霉毒素B1的核酸适配体中加入TCEP试剂，室温，黑暗条件下，反应2h激活黄曲霉毒素B1的核酸适配体；
c)将步骤b)激活后的黄曲霉毒素B1的核酸适配体加入到步骤a)的纳米金-蔗糖酶复合物中，在振荡培养箱中50r/min、37℃孵育16h，形成纳米金-蔗糖酶-核酸适配体复合物；
d)将步骤c)的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体复合物离心，取出上清液，先用少量的缓冲液A冲洗沉淀物，再用缓冲液A溶解沉淀物，室温涡旋震荡5min，得到纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针，并在4℃保存。
进一步地，所述黄曲霉毒素B1的核酸适配体的核苷酸序列为：5’-SH-AAAAAAGTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’。
进一步地，所述缓冲液A的浓度为10mmol/L，PH为7.4，缓冲液A包括：10mmol/L的Na2HPO4，2mmol/L的KH2PO4，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl。
进一步地，所述缓冲液B的浓度为10mmol/L，PH为7.4，缓冲液B包括：10mmol/L的Na2HPO4，2mmol/L的KH2PO4，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl；缓冲液B中吐温-20的质量百分数为0.05％。
进一步地，所述封闭缓冲液包括：10mmol/L的Na2HPO4，2mmol/L的KH2PO4，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl，牛血清白蛋白；封闭缓冲液中牛血清白蛋白的质量百分数为1％。
进一步地，所述胶体金中金颗粒的直径为20nm。
进一步地，所述TCEP试剂的浓度为2.5mmol/L，PH为5.0。
进一步地，所述蔗糖酶浓度为2mg/ml。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明采用胶体金作为标记物，因为胶体金能稳定又迅速地吸附蛋白质，而蛋白质的生物活性无明显改变，它可以作为探针对细胞表面和细胞内多糖、蛋白质、多肤、抗原、激素、核酸等生物大分子的精确定位；同时胶体金具有以下特点：使用方便快速，便于基层使用和现场使用成本低，不需要特殊的仪器设备；应用范围广，可适应多种检测条件，可以进行多项检测，多项检测可以节省样品；降低成本，标记物稳定，标记样品在4℃贮存两年年以上，无信号衰减现象；
2.传统的检测大分子物质的方法，都是单一利用抗体与目标物结合，或是核酸适配体与目标物结合，从而间接测出目标物的量，而本发明中形成了具有夹心式结构的单克隆抗体-目标物(黄曲霉毒素B1)-检测探针复合物，通过抗体、核酸适配体同时与目标物结合，具有更强的特异性，且与待测物中的目标分子结合效果更好，通过检测上清液中剩余的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物的量，得到较强的血糖仪信号值，使得检测结果更加精确、定量检测范围更广；
3.本发明利用家用便携式血糖仪进行检测，相比利用传统的大型检测设备，具有体积小、成本低和操作简单的特点，可为日常生活、生产等方面提供一种黄曲霉毒素B1的快速检测方法，保障食品安全。
附图说明
图1是本发明一种利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法的检测原理流程图。
图2是本发明血糖仪信号值与检测黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线图。
图3是本发明血糖仪信号值与检测黄曲霉毒素B1浓度的线性关系图。
图4是本发明检测不同类型的毒菌毒素的特异性曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步陈述，但并非是对本发明保护范围的限定，实施例中所涉及的工艺方法，如无特别说明则为常规方法或步骤，所用药品试剂除特别说明外，均为市售。
本发明所涉及到的术语，除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
胶体金(colloidal gold)：也称金溶胶(gold solution)，是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核(原子金Au)及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子(AuCl2 -)，外层离子层H+则分散在胶体金中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。
核酸适配体：是一段DNA(脱氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)或者是XNA(核酸类似物)序列。通常是利用体外筛选技术—指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolutionof ligands by exponential enrichment，SELEX)，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。核酸适配体能与目标物质高特异性、高选择性地结合，因此被广泛应用于生物传感器领域。
本发明的主要步骤如下：
1.材料与仪器
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride(TCEP)、Invertase(蔗糖酶)、Tween-20(吐温-20)、Sucrose(蔗糖)，牛血清白蛋白(BSA)，黄曲霉毒素B1标准品，黄曲霉毒素B1的核酸适配体，黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，96微孔板，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮，购自上海生工生物技术有限公司(中国)；胶体金，购自上海华蓝化学科技有限公司；GL-16Ⅱ型离心机，购自上海安亭科学仪器厂；HZQ-F200型振荡培养箱，购自北京东联哈尔仪器制造有限公司；IKA Vortex-3型旋涡混合器，购自上海楚柏实验室设备有限公司；07HWS-2数显恒温磁力搅拌器，购自杭州仪表电机有限公司；电子天平，购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；罗氏卓越精采型血糖仪，购自罗氏诊断产品(上海)有限公司。
黄曲霉毒素B1的核酸适配体的核苷酸序列为：5’-SH-AAAAAAGTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’。该核酸适配体的保存条件是-20℃，保存期限是1年。
黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的保存条件是4℃时，可短时间贮存，或者-20℃保存1年。
缓冲液A的浓度为10mmol/L，PH为7.4，缓冲液A包括：10mmol/L的Na2HPO4，2mmol/L的KH2PO4，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl。
缓冲液B的浓度为10mmol/L，PH为7.4，缓冲液B包括：10mmol/L的Na2HPO4，2mmol/L的KH2PO4，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl；缓冲液B中吐温-20的质量百分数为0.05％。
封闭缓冲液包括：10mmol/L的Na2HPO4，2mmol/L的KH2PO4，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl，牛血清白蛋白；封闭缓冲液中牛血清白蛋白的质量百分数为1％。
甲醇-PBS溶液包括：10mmol/L的Na2HPO4，2mmol/L的KH2PO4，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl；甲醇-PBS溶液中甲醇的质量分数为10％。
TCEP试剂的浓度为2.5mmol/L，PH＝5.0。
蔗糖酶的浓度为2mg/mL。
实验用水是电阻为18.2MΩ的超纯水。
2.实验方法
2.1配制黄曲霉毒素B1待测液
(1)配制黄曲霉毒素B1母液
首先将1mg黄曲霉毒素B1标准品溶于1mL甲醇-PBS(10％甲醇)溶液中，得到溶液A，浓度CA＝1mg/mL；
取1ml溶液A，加入99ml的甲醇-PBS溶液(10％甲醇)稀释成100mL的溶液B，浓度CB＝10ng/mL，即得100mL、10ng/mL的黄曲霉毒素B1母液。
(2)稀释黄曲霉毒素B1母液得到不同浓度的黄曲霉毒素B1待测液取4μL黄曲霉毒素B1母液，加入196μL甲醇-PBS溶液稀释，即得200μL、0.2ng/mL的AFB1缓冲液；
同理可知，体积为200μL，浓度分别为0ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、5.5ng/mL、6ng/mL和6.5ng/mL的黄曲霉毒素B1待测液中分别含有0μL、4μL、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL、110μL、120μL、130μL的黄曲霉毒素B1母液，及分别含有200μL、196μL、190μL、180μL、160μL、140μL、120μL、100μL、90μL、80μL、70μL的甲醇-PBS溶液。
2.2制备纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物
a)将500μL、2mg/mL的蔗糖酶加入到1mL的胶体金中混合，4℃孵育6h，得到纳米金-蔗糖酶复合物。
b)将黄曲霉毒素B1的核酸适配体固体粉末先在12000r/min下，离心1min，将离心管壁上的核酸适配体聚集到离心管底部，防止打开时撒出，再在离心管中加入19μL的TCEP试剂形成混合液，混合液浓度为100μmol/L，室温，黑暗条件下，反应2h激活黄曲霉毒素B1的核酸适配体。
c)取10μL步骤b)的混合液加入到步骤a)的纳米金-蔗糖酶复合物中，在振荡培养箱中50r/min、37℃孵育16h，形成纳米金-蔗糖酶-核酸适配体复合物；
d)将步骤c)的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体复合物在14000r/min下，离心20min，取出上清液，用100μL缓冲液A冲洗3次沉淀物，用1mL缓冲液A溶解沉淀物，室温在旋涡混合器上涡旋震荡5min，得到纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物，并在4℃保存。
2.3固定黄曲霉毒素B1的单克隆抗体
将100μL、0.1μg/mL的黄曲霉毒素B1的单克隆抗体加入到96微孔板中，4℃孵育12h；用150μL缓冲液B冲洗3次；然后加入100μL封闭缓冲液，室温封闭1h；用150μL缓冲液A冲洗3次，完成黄曲霉毒素B1的单克隆抗体在96微孔板的固定。
2.4黄曲霉毒素B1与单克隆抗体的特异性结合向上述固定好黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的96微孔板中分别加入200μL不同浓度(0，0.2，0.5，1，2，3，4，5，5.5，6，6.5ng/mL)的黄曲霉毒素B1待测液，37℃孵育1h，其中0ng/mL作为空白对照，使黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B1的单克隆抗体进行特异性结合，用200μL缓冲液A冲洗3次去除未与单克隆抗体结合的黄曲霉毒素B1，得到黄曲霉毒素B1与单克隆抗体的结合体。
黄曲霉毒素B1的浓度越大，固定在96微孔板底部的结合体越多。
2.5制备具有夹心式结构的单克隆抗体-黄曲霉毒素B1-检测探针复合物在步骤2.4所得的结合体中加入100μL步骤2.3制备的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物，37℃孵育2h。结合体上的黄曲霉毒素B1与纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物上的黄曲霉毒素B1核酸适配体发生高效特异性结合，形成具有夹心式结构的单克隆抗体-黄曲霉毒素B1-检测探针复合物。
结合体上的黄曲霉毒素B1与纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物上的黄曲霉毒素B1核酸适配体结合越多，96微孔板内上清液中的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物就越少。
2.6用血糖仪进行检测
取步骤2.5的上清液，并用10μL缓冲液A冲洗96微孔板2次，将上清液和冲洗液同时放入离心管中，加入30μL、1mol/L的蔗糖溶液，37℃孵育30min后，取出2μL用血糖仪检测。
2.7特异性分析
为了研究该检测方法的特异性，分别对体积为200μL，不同浓度(0，0.2，0.5，1，2，3，4，5，5.5，6，6.5ng/mL)赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮进行特异性检测，其中0ng/mL作为空白对照组，不含有任何毒菌毒素。实验方法步骤与本实施例实验方法2.1～2.6相同。
3.实验结果
3.1检测原理
具体检测原理流程如图1所示。
首先将黄曲霉毒素B1单克隆抗体固定于96微孔板上，再加入不同浓度的黄曲霉毒素B1待测液，黄曲霉毒素B1与抗体发生特异性结合被固定在板底，然后加入制备好的定量的纳米金-蔗糖酶-适体检测探针，由于核酸适配体与黄曲霉毒素B1的强亲和力结合，使一部分检测探针被黄曲霉毒素B1固定，形成单克隆抗体-黄曲霉毒素B1-检测探针的夹心式结构。加入黄曲霉毒素B1越多，被固定的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物就越多，上清液中剩余的上清液中剩余的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物就越少，而剩余的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物的量与黄曲霉毒素B1的量成负相关，并随上清液被取出。过量蔗糖加入上清液后，其被纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物上的蔗糖酶水解为葡萄糖，生成葡萄糖的量与剩余纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物的量成正相关，故可建立起葡萄糖浓度与黄曲霉毒素B1浓度之间的线性关系，通过血糖仪检测最终葡萄糖的浓度达到间接检测黄曲霉毒素B1浓度的目的。
3.2黄曲霉毒素B1待测液的检测结果
如图2所示，当黄曲霉毒素B1浓度为0ng/mL时，血糖仪的信号强度最大。随着黄曲霉毒素B1浓度的增加，血糖仪的信号值在逐步减小。当黄曲霉毒素B1浓度在0.5ng/mL～5ng/mL范围时，血糖仪的信号值有一个良好的线性关系，如图3所示，黄曲霉毒素B1浓度与血糖仪信号强度的线性关系为Y＝1.546-0.186X，其中Y为血糖仪信号强度，X为黄曲霉毒素B1浓度，相关系数为：R2＝0.99；黄曲霉毒素B1线性范围为：0.5ng/mL～5ng/mL，检出最低限为：0.5ng/mL。
由于上清液中剩余的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物的量与黄曲霉毒素B1的量成负相关，也就是说如果待测物的浓度越低，则上清液中剩余的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物的量就越多，那么被蔗糖酶水解的葡萄糖的量也就越多，得到的血糖仪的信号值也就越强。所以采用本发明的检测方法，可以检测出较低浓度的待测物中黄曲霉毒素B1，相对来说，黄曲霉毒素B1的定量检测范围更广。
3.3特异性分析结果
如图4所示，赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的血糖仪信号值随着浓度的增大几乎不变，且与空白对照组的血糖仪检测值没有明显差异，而黄曲霉毒素B1的血糖仪信号值随着浓度的增大而降低，且在0.5ng/mL～5ng/mL范围内呈线性变化。结果表明，黄曲霉毒素B1的核酸适配体除了与黄曲霉毒素B1结合之外，不会与其他两种毒菌毒素结合，因此该方法可以实现对黄曲霉毒素B1的特异性检测，而不会识别其他的毒菌毒素。
综上所述，采用本发明的检测方法，形成了具有夹心式结构的单克隆抗体-黄曲霉毒素B1-检测探针复合物，通过抗体、核酸适配体同时与目标物结合，具有更强的特异性，且与待测物中的目标分子结合效果好，通过检测上清液中剩余的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物的量，得到较强的血糖仪信号值，使得检测结果更加精确、定量检测范围更广。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州轻工业学院
<120> 一种利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1）核酸适配体
<400> 1
aaaaaagttg ggcacgtgtt gtctctctgt gtctcgtgcc cttcgctagg cccaca 56

Claims (7)

1.一种利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述方法的灵敏度指标最低检测限为0.5ng/mL，包括以下步骤：
步骤一：制备纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物，具体步骤如下：
a）将蔗糖酶加入到胶体金中混合，4℃孵育6h，得到纳米金-蔗糖酶复合物；
b）向黄曲霉毒素B1的核酸适配体中加入TCEP试剂，室温，黑暗条件下，反应2h激活黄曲霉毒素B1的核酸适配体；所述黄曲霉毒素B1的核酸适配体的核苷酸序列为：5’-SH-AAAAAAGTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’；
c）将步骤b）激活后的黄曲霉毒素B1的核酸适配体加入到步骤a）的纳米金-蔗糖酶复合物中，在振荡培养箱中50r/min、37℃孵育16h，形成纳米金-蔗糖酶-核酸适配体复合物；
d）将步骤c）的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体混合物离心，取出上清液，先用少量的缓冲液A冲洗沉淀物，再用缓冲液A溶解沉淀物，室温涡旋震荡5min，得到纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针，并在4℃保存；
步骤二：将黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，4℃孵育12h；用缓冲液B冲洗；然后加入封闭缓冲液，室温封闭1h；用缓冲液A冲洗，完成黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的固定；
步骤三：向步骤二的黄曲霉毒素B1的单克隆抗体中加入不同浓度的黄曲霉毒素B1待测液，37℃孵育1h，使黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B1的单克隆抗体进行特异性结合，用缓冲液A冲洗未与单克隆抗体结合的黄曲霉毒素B1，得到黄曲霉毒素B1与单克隆抗体的结合体；
步骤四：在步骤三所得的结合体中加入步骤一制备的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物，37℃孵育2h，形成具有夹心式结构的单克隆抗体-黄曲霉毒素B1-检测探针复合物，未与结合体上的黄曲霉毒素B1结合的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物留在上层上清液中；
步骤五：取步骤四的上清液，加入蔗糖溶液，37℃孵育30min后，用血糖仪进行定量检测。
2.根据权利要求1所述的利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述缓冲液A的浓度为10mmol/L，PH为7.4，缓冲液A包括：10mmol/L的Na2HPO4，2mmol/L的KH2PO4，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl。
3.根据权利要求1所述的利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述缓冲液B的浓度为10mmol/L，PH为7.4，缓冲液B包括：10mmol/L的Na2HPO4，2mmol/L的KH2PO4，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl，吐温-20；缓冲液B中吐温-20的质量百分数为0.05%。
4.根据权利要求1所述的利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述封闭缓冲液包括：10mmol/L的Na2HPO4，2mmol/L的KH2PO4，137mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl，牛血清白蛋白；封闭缓冲液中牛血清白蛋白的质量百分数为1%。
5.根据权利要求1所述的利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述胶体金中金颗粒的直径为20nm。
6.根据权利要求1所述的利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述TCEP试剂的浓度为2.5mmol/L，PH为5.0。
7.根据权利要求1所述的利用血糖仪高灵敏定量检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述蔗糖酶浓度为2mg/ml。
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