KR20180039163A - 페길화 분석물-특이적 결합제를 사용하는 입자-기반 면역어세이 - Google Patents
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Abstract
본원에서는 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이 중의 분석물의 측정 방법으로서 (상기 마이크로입자는 결합 쌍의 제 1 파트너로 코팅됨), 방법은 a) 코팅된 마이크로입자, 결합 쌍의 제 2 파트너에 콘쥬게이션된 분석물-특이적 결합제, 및 분석물을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 혼합 (상기 결합 쌍의 제 2 파트너는 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위 (PEG 12 내지 30) 를 포함하는 링커를 통해 상기 분석물-특이적 결합제에 결함함) 함으로써, 분석물을 콘쥬게이션된 분석물-특이적 결합제를 통해 코팅된 마이크로입자에 결합시키고, 결합 쌍을 통해 결합된 분석물 및 분석물-특이적 결합제를 포함하는 마이크로입자를 혼합물로부터 분리하고, 마이크로입자에 결합된 분석물을 측정하는 것을 포함하는 방법이 보고된다.
Description
본 발명은 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이 중의 분석물의 측정 방법으로서 (상기 마이크로입자는 결합 쌍의 제 1 파트너로 코팅됨), 방법은 코팅된 마이크로입자, 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 분석물-특이적 결합제, 및 분석물을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 혼합 (상기 결합 쌍의 제 2 파트너는 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위 (PEG 12 내지 30) 를 포함하는 링커를 통해 상기 분석물-특이적 결합제에 결함됨) 함으로써, 분석물을 분석물-특이적 결합제를 통해 코팅된 마이크로입자에 결합시키고, 결합 쌍을 통해 결합된 분석물 및 분석물-특이적 결합제를 포함하는 마이크로입자를 혼합물로부터 분리하고, 마이크로입자에 결합된 분석물을 측정하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
생화학적 및 생물학적 샘플 중의 관심의 분석물의 검출 및 정량을 위해 수 많은 방법 및 시스템이 개발되었다. 미량의 미생물, 약제, 호르몬, 바이러스, 항체, 핵산 및 기타 단백질을 측정할 수 있는 방법 및 시스템은 연구원 및 임상의에게 가치가 크다.
많은 어세이 방법은 샘플로부터 관심의 특이적 표적 분자를 포획하고 표적 분자의 측정을 가능하게 하도록 분석물-특이적 결합제를 사용한다.
결합 반응, 예를 들어, 항원-항체 반응, 핵산 하이브리드화 기술, 및 단백질-리간드 시스템에 기반하여 상당한 기술이 발달되어 왔다. 많은 생화학적 및 생물학적 결합 시스템에서의 높은 정도의 특이성은 연구 및 진단에서 가치있는 많은 어세이 방법 및 시스템을 도출하였다. 전형적으로, 관심의 분석물의 존재는 하나 이상의 분석물-특이적 결합제에 부착된 관찰가능한 "표지" 의 존재 또는 부재에 의해 나타내진다.
어세이 민감성은 비-특이적 결합 현상에 의해 크게 제한된다. 따라서 주요한 어려움은 매우 민감하고 동시에 예를 들어, 프로브된 샘플 유체에 의해 야기되는 높은 백그라운드 신호를 본질적으로 겪지 않는 어세이 기술을 구상하는 것이다. 비-특이적 결합은 전형적으로 증가된 백그라운드 신호, 부정확한 검출 및 더 높은 (열악한) 검출 한계를 도출한다. 특히, 비특이적 결합은 인간 혈장 또는 혈청 샘플과 같은 복합 생물학적 매트릭스가 샘플 유체로서 사용되는 경우 좀더 성가시다.
최근, 좀더 정확하고 민감한 어세이가 개발되었고, 이것은 (예를 들어, 초상자성) 마이크로입자의 사용에 기반하는 것이다. 특히 이러한 입자-기반 어세이에서, 비특이적 신호에 대한 중요한 기여는 입자-입자 상호작용 및/또는 입자-표면 상호작용으로부터 유래한다.
US 5.212.063 은 비오틴 콘쥬게이트를 사용하는 면역어세이에 의해 자유 비오틴을 함유하는 체액 중의 분석물의 검출 방법을 기재한다. 문헌은 코어로 이루어지고 비오틴에 대한 다수의 결합 부위 및, 커버 (covering) 로서, 적어도 한 층의 단백질을 갖는 중합체를 함유하는 중합체 마이크로입자를 언급한다.
WO 2013/001447 은 쉘 구조를 포함하는 코팅을 갖는 예비코팅된 마이크로입자를 기재하고, 상기 쉘 구조는 하나 이상의 친화성 분자 (즉, 분석물-특이적 결합제) 를 포함하는 제 1 층 및, 제 1 층에 커플링된 추가의 제 2 층을 포함하고, 상기 제 1 및 제 2 층은 메쉬를 형성하는 비-친화성 스페이서 분자를 포함하며, 상기 하나 이상의 친화성 분자는 코팅 구조 내에 포매되고, 상기 메쉬는 비-특이적 분자에 대한 입체 장애를 발생시킨다. 이러한 특별히 처리된/코팅된 마이크로입자를 사용하여 비-특이적 결합에 의해 유발되는 백그라운드를 감소시킬 수 있다.
그러나, 심지어 가장 발전된 어세이는 여전히 더 낮은 검출 한계 (LOD) 또는 측정 범위 또는 둘 다를 손상시키는 상당한 수준의 비-특이적 결합을 나타낸다. 시험 개발자는 종종 어세이 민감성, 측정 범위 및 어세이 특이성 사이의 절충을 둔다. 동시에, 시험은 빠르고, 민감하며, 정량적으로 정확하고 심지어 비용-효과적일 필요가 있다. 게다가 시험이 수행되어야 하는 플랫폼은 사용하기 용이하고 신뢰성일 필요가 있다.
항상, 신호 대 백그라운드 노이즈의 비를 증가시킴으로써 어세이 및, 따라서, 어세이의 민감성을 개선시키고자 하는 요구가 있다. 어세이의 신호를 증가시키는 것은 또한 하기를 포함하는 여러 도구적 장점을 갖는다: i) 덜 민감한 (및 덜 비싼) 검출 시스템이 필요하다; ii) 더 적은 양의 가치있는 샘플이 필요하다; iii) 더 작은 기기 및/또는 작은 영역에서 동시에 많은 어세이를 수행하는 장치를 허용하도록 기기장치를 소형화할 수 있다.
그러나, 특히 입자-기반 어세이에서, 비특이적 신호에 대한 중요한 기여는 입자-입자 상호작용 및 입자-표면 상호작용으로부터 유래한다.
따라서 개선된 입자-기반 어세이 방법을 위한 신규한 구조 및 방법을 고안하려는 필요가 있다. 많은 수의 검출 어세이에서 제한 인자인, 마이크로입자의 비-특이적 결합 및 클러스터링을 피하고자 하는 강한 요구가 있다.
이제 놀랍게도 - 한편으로는 결합 쌍의 하나의 구성원 및 다른 한편으로는 분석물-특이적 결합제에 결합된 - 12 내지 30 개의 폴리에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 링커 분자가 마이크로입자-기반 결합 어세이에서 큰 장점을 가지고 사용될 수 있으며, 마이크로입자는 결합 쌍의 다른 구성원으로 코팅된다는 것이 밝혀졌다.
기재되는 것은 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이 중의 분석물의 측정 방법으로서 (상기 마이크로입자는 결합 쌍의 제 1 파트너로 코팅됨), 방법은 a) 코팅된 마이크로입자, 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 분석물-특이적 결합제, 및 분석물을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 혼합 (상기 결합 쌍의 제 2 파트너는 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위 (PEG 12 내지 30) 를 포함하는 링커를 통해 상기 분석물-특이적 결합제에 결함됨) 함으로써, 분석물을 분석물-특이적 결합제를 통해 코팅된 마이크로입자에 결합시키고, b) 결합 쌍을 통해 결합된 분석물 및 분석물-특이적 결합제를 포함하는 마이크로입자를 혼합물로부터 분리하고, c) 마이크로입자에 결합된 분석물을 측정하는 것을 포함하는 방법이다.
또한 기재되는 것은 단일 용기 유닛의 별도의 용기 또는 분리된 구획에 결합 쌍의 제 1 구성원으로 코팅된 적어도 마이크로입자 및 상기 결합 쌍의 제 2 구성원에 결합된 분석물-특이적 결합제를 포함하는 키트로서, 상기 결합 쌍의 상기 제 2 구성원이 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위 (PEG 12 내지 30) 를 포함하는 링커를 통해 상기 분석물-특이적 결합제에 결합되는 키트이다.
하나의 구현예에서 본 발명은 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이 중의 분석물의 측정 방법으로서 (상기 마이크로입자는 결합 쌍의 제 1 파트너로 코팅됨), 방법은 a) 코팅된 마이크로입자, 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 분석물-특이적 결합제, 및 분석물을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 혼합 (상기 결합 쌍의 제 2 파트너는 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위 (PEG 12 내지 30) 를 포함하는 링커를 통해 상기 분석물-특이적 결합제에 결함됨) 함으로써, 분석물을 분석물-특이적 결합제를 통해 코팅된 마이크로입자에 결합시키고, b) 결합 쌍을 통해 결합된 분석물 및 분석물-특이적 결합제를 포함하는 마이크로입자를 혼합물로부터 분리하고, c) 마이크로입자에 결합된 분석물을 측정하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이는 다양한 표지화 또는 검출 기술을 사용하는, 예를 들어, 특정 혼탁분석 어세이, 특정 라텍스 응집 어세이 및 많은 민감성 샌드위치 유형 어세이에서 널리 사용된다.
본원에서 사용되는 "입자" 는 물리적 특성, 예컨대 부피, 질량 또는 평균 크기로 할당될 수 있는, 작은, 국부화된 대상을 의미한다. 마이크로입자는 따라서 대칭, 구형, 본질적 구형 또는 구체 형상이거나, 또는 불규칙한, 비대칭 형상 또는 형태일 수 있다. 본 발명에 의해 구상되는 입자의 크기는 다양할 수 있다. 하나의 구현예에서 사용되는 것은 구형 형상, 예를 들어, 나노미터 및 마이크로미터 범위의 직경을 가진 마이크로입자이다. 하나의 구현예에서 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 마이크로입자는 50 나노미터 내지 20 마이크로미터의 직경을 갖는다. 추가의 구현예에서, 마이크로입자는 100 ㎚ 내지 10 ㎛ 의 직경을 갖는다. 하나의 구현예에서 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 마이크로입자는 200 ㎚ 내지 5 ㎛ 또는 750 ㎚ 내지 5 ㎛ 의 직경을 갖는다.
상기 본원에 정의된 마이크로입자는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 재료를 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있고, 예를 들어, 이들은 무기 또는 유기 재료를 포함하거나 이것으로 이루어지거나 또는 이것으로 본질적으로 이루어질 수 있다. 전형적으로, 이들은 금속 또는 금속의 합금, 또는 유기 재료를 포함하거나 이것으로 이루어지거나 또는 이것으로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 또는 탄수화물 요소를 포함하거나 이것으로 이루어지거나 또는 이것으로 본질적으로 이루어진다. 마이크로입자에 대해 구상되는 재료의 예는 아가로오스, 폴리스티렌, 라텍스, 폴리비닐 알코올, 실리카 및 강자성 금속, 합금 또는 조성물 재료를 포함한다. 하나의 구현예에서 마이크로입자는 자성 또는 강자성 금속, 합금 또는 조성물이다. 추가의 구현예에서, 재료는 특정한 성질을 가질 수 있으며, 예를 들어, 소수성, 또는 친수성일 수 있다. 이러한 마이크로입자는 전형적으로 수용액에 분산되고, 마이크로입자를 분리하여 유지하고 비-특이적 클러스터링을 피하면서 작은 음성 표면 전하를 보유한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 마이크로입자는 상자성 마이크로입자이고, 본 발명에 따른 측정 방법에서의 이러한 입자의 분리는 자기력에 의해 용이하다. 자기력은 상자성 또는 자성 입자를 용액/현탁액 외로 뽑아내고, 이들을 원하는대로 보유하면서, 용액/현탁액의 액체를 제거할 수 있고, 입자를 예를 들어 세척할 수 있도록 적용된다.
본 발명에 따른 방법에서 사용되는 마이크로입자는 특정한 결합 쌍의 제 1 구성원으로 코팅된다.
본원에서 사용되는 "결합 쌍" 은 높은 친화성을 가지고, 즉, 1 나노몰의 친화성 또는 그 이상을 가지고 서로에 대해 결합하는 2 개의 파트너로 이루어진다. 결합 쌍에 대한 구현예는 예를 들어, 수용체 및 리간드, 합텐 및 항-합텐 항체로 이루어진 결합 쌍, 및 자연 발생적인 고 친화성 결합 쌍에 근거한 결합 쌍이다.
수용체-리간드 결합 쌍의 하나의 예는 스테로이드 호르몬 수용체 및 상응하는 스테로이드 호르몬으로 이루어진 쌍이다.
본 발명에 따른 방법에 적합한 결합 쌍의 하나의 유형은 합텐 및 항-합텐 항체 결합 쌍이다. 합텐은 100 내지 2000 달톤 (Dalton), 바람직하게는 150 내지 1000 달톤 (Dalton) 의 분자량을 가진 유기 분자이다. 이러한 작은 분자는 이것을 운반체 분자에 커플링함으로써 면역원성이 되도록 할 수 있고, 항-합텐 항체는 표준 절차에 따라 생성될 수 있다. 합텐은 스테롤, 담즙산, 성 호르몬, 코르티코이드, 카르데놀리드, 카르데놀리드-글리코시드, 부파디에놀리드, 스테로이드-사포게닌 및 스테로이드 알칼로이드, 카르데놀리드 및 카르데놀리드-글리코시드를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 대표적인 이들 성분 계열은 디곡시게닌, 디기톡시게닌, 기톡시게닌, 스트로판티딘, 디곡신, 디기톡신, 디톡신, 및 스트로판틴이다. 또다른 적합한 합텐은 예를 들어, 플루오레세인이다.
자연 발생적 고 친화성 결합 쌍에 기반한 결합 쌍의 예는 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘 뿐 아니라 FimG 및 DsF 결합 쌍이다. 비오틴-(스트렙트)아비딘 결합 쌍은 당업계에 잘 알려져 있다. FimG-DsF 결합 쌍의 기본 원리는 예를 들어, WO2012/028697 에 기재되어 있다.
하나의 구현예에서 결합 쌍은 합텐 및 항-합텐 항체, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘, FimG 및 DsF, 및 수용체 및 리간드로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 결합 쌍은 합텐 및 항-합텐 항체 및 비오틴 또는 비오틴 유사체 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘, FimG 및 DsF 로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 결합 쌍은 비오틴 (또는 비오틴 유사체, 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴) 및 아비딘 또는 스트렙타비딘이다.
하나의 구현예에서 결합 쌍은 비오틴 및 스트렙타비딘으로 이루어진다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 결합 쌍은 10 kD 이상의 분자량을 갖는 이러한 결합 쌍의 제 1 파트너 및 1 kD 이하의 분자량을 갖는 이러한 결합 쌍의 제 2 쌍으로 이루어진다. 상기 표시된 바와 같이, 하나의 구현예에서 10 kD 이상의 분자량을 갖는 결합 쌍의 제 1 파트너는, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 마이크로입자에 결합 (코팅) 된다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 마이크로입자-기반 방법에서 상기 결합 쌍의 제 1 파트너는 아비딘 및/또는 스트렙타비딘, 및 FimG, 각각으로부터 선택되며, 상기 결합 쌍의 제 2 파트너는 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴 및 DsF, 각각으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 마이크로입자-기반 방법에서 상기 결합 쌍의 제 1 파트너는 아비딘 및/또는 스트렙타비딘이고, 상기 결합 쌍의 제 2 파트너는 비오틴이다.
본 발명에 따른 방법에서 사용되는 마이크로입자는 결합 쌍의 제 1 파트너로 "코팅" 된다. 이러한 코팅은 당업계의 절차에 따라 수행된다. 결합 쌍의 제 1 파트너는 흡착, 공유 결합 또는 두 방법의 조합에 의해 입자의 표면에 결합될 수 있다. 마이크로입자는 임의로 예를 들어, 단백질, 예컨대 소 혈청 알부민과 함께 추가로 인큐베이션하여, 다른 어세이 성분의 비-특이적 결합을 감소시킬 수 있다. 당업자는 비-특이적 결합의 이러한 임의적 차단에 사용되는 방법을 완전히 인식하고 있다. 당업계에서 사용되는 용어에 따라, 이러한 코팅되고 차단된 마이크로입자는 또한 코팅된 마이크로입자로서 간단히 언급된다.
결합 쌍의 제 1 파트너의 분자는 마이크로입자 상에서 상기 결합 쌍의 제 2 파트너에 대해 많은 근처의 결합 부위를 제공하며 아주 근접하여 존재한다. 가장 실제적이고/정규적인 적용을 위해, 결합 쌍의 제 1 파트너는 포화 농도에서 마이크로입자에 코팅되고, 최적의 코팅 밀도를 산출한다. 당업자가 인식하듯이, 코팅 밀도는, 원하는 경우 결합 쌍의 제 1 파트너의 최적-이하 농도를 사용함으로써 감소될 수 있다. 결합 쌍의 제 1 파트너의 최적-이하 농도가 코팅에 사용되는 경우에, 당업자는 분석물-특이적 결합제를 결합 쌍의 제 2 파트너에 대한 결합에 사용되는 링커 길이를 매치하도록 평균 코팅 밀도를 선택할 것이다. 일반적으로 용어: 코팅된 마이크로입자 상의 결합 쌍의 제 1 파트너의 분자 사이의 평균 거리는 분석물-특이적 결합제의 결합 쌍의 제 2 파트너에 대한 결합에 사용되는 링커의 길이의 거의 2 배일 것이다. 이에 의한 거리는 하나의 분자의 중심에서 또다른 분자의 중심까지이다. 예로서: 폴리에틸렌 글리콜 단위의 평균 길이는 약 0.38 ㎚ 이다. 따라서, 12 개의 PEG-단위를 가진 링커는 약 4.5 ㎚ 의 길이를 갖는다. 결합 쌍의 제 2 파트너의 분자가 동일한 마이크로입자 상의 상기 결합 쌍의 제 1 파트너에 결합하도록 하기 위해, 입자 상의 결합 쌍의 제 1 파트너의 분자 사이의 평균 거리는 9 ㎚ 이하일 것이다. 하나의 구현예에서 결합 쌍의 제 1 파트너의 분자의 평균 거리는 9 ㎚ 이하이다. 하나의 구현예에서 결합 쌍의 제 1 파트너의 분자의 평균 거리는 각각, 9 ㎚ 또는 8 ㎚ 이다. 하나의 구현예에서 마이크로입자는 결합 쌍의 제 1 파트너의/와 포화 농도로 코팅된 것이 사용된다.
"분석물" 또는 "관심의 분석물" 또는 "표적 분자" 는 분석물-특이적 결합제에 의해 결합될 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 문맥에서 분석물은 핵산 (DNA 또는 RNA) 분자, 펩티드, 단백질, 약물 분자, 호르몬 또는 비타민이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 문맥에서 분석물은 펩티드, 단백질, 약물 분자, 호르몬 또는 비타민이다.
액체 샘플은 본 개시내용에 따른 방법에서 분석물의 시험관내-검출에 특이적인 방법에서 사용될 수 있다. 샘플은 분석물을 포함하는 것으로 공지될 수 있거나 또는 이것은 분석물을 포함하는 것으로 의심될 수 있다. 하나의 구현예에서 본 개시내용에 따른 방법에서 사용되는 시험관내 진단을 위한 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 리쿼 (liquor), 소변 또는 타액으로부터 선택된 체액이다. 하나의 구현예에서 분석물을 포함하는 또는 포함하는 것으로 의심되는 샘플은 혈청, 혈장 또는 리쿼이다. 하나의 구현예에서 분석물을 포함하는 또는 포함하는 것으로 의심되는 샘플은 혈청 또는 혈장이다.
본 개시내용에 따른 분석물의 측정 방법은 분석물-특이적 결합제를 사용한다. 용어 "분석물-특이적 결합제" 는 관심의 분석물에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 본 개시내용의 견지에서 분석물-특이적 결합제는 전형적으로 분석물 (다른 용어 관심의 분석물; 표적 분자) 에 결합할 수 있는 결합 또는 포획 분자를 포함한다. 하나의 구현예에서 분석물-특이적 결합제는 적어도, 그것의 대응하는 표적 분자, 즉 분석물에 대해 107 l/mol 의 친화성을 갖는다. 분석물-특이적 결합제는 다른 구현예에서 그것의 표적 분자에 대해 108 l/mol 또는 심지어 109 l/mol 의 친화성을 갖는다. 숙련가는 특이적이라는 용어가 샘플에 존재하는 다른 생체분자가 분석물에 특이적인 결합제와 상당히 결합하지 않는 것을 나타내는데 사용되는 것을 알 것이다. 일부 구현예에서, 표적 분자 이외의 생체분자에 대한 결합 수준은 표적 분자의 친화성의 오로지 10%, 더 바람직하게는 오로지 5% 또는 그 미만인 결합 친화성을 초래한다. 하나의 구현예에서 분석물에 대한 것외에 다른 분자에 대한 결합 친화성은 측정가능하지 않다. 하나의 구현예에서 분석물-특이적 결합제는 친화성 뿐만 아니라 특이성에 대한 상기 최소 기준 둘 다를 충족시킬 것이다.
하나의 구현예에서 분석물-특이적 결합제는 앱타머, 펩티드 앱타머, 단백질, 올리고뉴클레오타이드, 및 분자 각인 폴리머로 이루어진 군으로부터 선택된다.
분석물-특이적 결합제의 문맥에서 사용된 "앱타머" 는 짧은 핵산 분자, 예를 들면 RNA, DNA, PNA, CNA, HNA, LNA 또는 ANA 분자 또는, 분석물을 결합할 수 있는, 당업자에 공지된 임의의 다른 적합한 핵산 포맷일 수 있다.
펩티드 앱타머는 특이적인 아미노산 서열을 포함하는 (a) 단백질(들), 폴리펩티드(들) 또는 펩티드(들) 에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머이다. 전형적으로, 펩티드 앱타머는 예를 들어, 10 내지 20 개의 아미노산을 포함하는 펩티드 루프를 갖는다. 본 개시내용의 문맥에서 펩티드 앱타머는 특정 구현예에서 스캐폴드 구조에 1 개 또는 양 말단에 부착될 수 있다. 스캐폴드 구조는 임의의 분자, 바람직하게는 단백질, 예를 들면 양호한 용해도 특성을 갖는 단백질일 수 있다. 적합한 스캐폴드 분자는 당업자에 공지될 것이다. 적합한 스캐폴드 분자의 예는 박테리아 단백질 티오레독신-A, 및 FkpA- 또는 SlyD-샤페론, 각각에 기반한다. 앱타머 펩티드 루프는 바람직하게는 스캐폴드 분자의 환원 활성 부위 내에 삽입될 수 있다. 대안적으로, 포도상구균 단백질 A 및 이의 도메인 및 이들 도메인의 유도체, 예컨대 단백질 Z 또는 리포칼린이 펩티드 앱타머로서 사용될 수 있다.
핵산 또는 펩티드 앱타머는 당업자에 공지된 임의의 적합한 방법에 따라, 예를 들면 PCR 또는 분자 합성 접근법 또는 효모 2-하이브리드 접근법을 통해 생성될 수 있다.
분석물-특이적 결합제의 문맥에서 사용된 "펩티드" 는 2 내지 49 길이의 아미노산, 아미노산 유도체 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있거나 대안적으로 이것으로 이루어질 수 있다. 펩티드는 선형, 분지형, 원형 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 펩티드 분석물-특이적 결합제는 또한, 상기 본 명세서에서 정의된 바와 같이 스캐폴드 구조에 부착될 수 있다.
분석물-특이적 결합제의 문맥에서 사용된 "폴리펩티드" 또는 "단백질" 은 약 50 초과 길이의 아미노산, 아미노산 유도체 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있거나 대안적으로 이것으로 이루어질 수 있다. 단백질은 선형, 분지형, 및 원형 형태를 가질 수 있거나 또는 이들 형태의 혼합물로 구성될 수 있다.
하나의 구현예에서 분석물-특이적 결합제는 적어도 50 개 아미노산의 폴리펩티드이다. 이론상 분석물-특이적 결합제의 폴리펩티드 길이에 상한은 없지만, 하나의 구현예에서 최대 10.000 아미노산을 가질 것이다.
분석물-특이적 결합제의 문맥에서 사용된 "올리고뉴클레오타이드" 는 10 내지 120 개 길이의 뉴클레오타이드, 또는 12 내지 60, 또는 15 내지 40 개 길이의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나 대안적으로 이것으로 이루어질 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 분석물-특이적 결합제는 RNA 분자 또는 DNA 분자, 또는 둘의 혼합물일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "분자 각인 폴리머" 는 상보적 공동 (cavity) (각인) 을 뒤에 남겨두는, 나중에 추출되는 분자의 존재 하에 형성되었던 폴리머를 지칭한다. 전형적으로, 분자 각인 폴리머는 기원 분자에 대해 특정 화학적 친화성을 보여준다. 분자 각인 폴리머는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 폴리머 단위로 구성될 수 있다. 그것의 생산을 위한 기술은 중합 기술 예컨대 벌크, 침전, 유화, 현탁, 분산, 겔화, 다단계 팽윤 중합 및 계층적 각인 방법을 포함한다.
분석물-특이적 결합제의 문맥에서 사용된 "항체" 는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분 (단편), 즉 분석물에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 본 발명에 따른 방법에서 사용된 면역글로불린 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류 (예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다. 항체는 이들이 인지하는 또는 특이적으로 결합하는 폴리펩티드의 에피토프(들) 또는 부분(들)에 관해 기재되거나 구체화될 수 있다. 특이적인 에피토프 및 항체와의 이들의 상호작용은 당업자에게 공지될 것이다.
항체의 문맥에서 사용된 용어 "분석물-특이적 결합" 은 분석물 상의 에피토프에 대한 항체의 면역특이적 결합을 말한다. 분석물 상의 그것의 에피토프를 통한 항체의 분석물-특이적 결합의 개념은 당업자에게 완전히 명백하다.
본원에서 용어 "항체" 는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 한다면 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단일 사슬 항체, 적어도 2개의 상이한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들면 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포괄한다. 본 개시내용의 견지에서 항체는 또한, 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드와 항체의 공유 또는 비-공유 회합에 의해 형성된, 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
"단리된" 항체는 그것의 자연적인 환경의 성분으로부터 확인된 및 분리된 및/또는 회수된 것이다. 그것의 자연적인 환경의 오염 성분은 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료 용도에 간섭할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 예를 들면, 쿠마씨 블루 또는 은 염색을 사용하는 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE 에 의해 결정된 바와 같이, 항체 95 중량% 초과, 및 일부 구현예에서, 99% 초과로 정제된다.
면역글로불린 G 부류의 항체는 일반적으로 2 개의 동일한 경쇄 (L) 및 2 개의 동일한 중쇄 (H) 로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1 개의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 디설파이드 연결기의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄 사이에서 상이하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 간격을 둔 사슬내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 1 개의 말단에, 가변 도메인 (VH) 에 이은 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 1 개의 말단에 가변 도메인 (VL) 및 그것의 다른 말단에 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제 1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 말한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH" 로서 불릴 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL" 로서 불릴 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 최대 가변 부분이고, 항원-결합 부위를 함유한다.
용어 "가변성" 은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 중에서 서열이 광범위하게 상이하고, 그것의 특정한 항원에 대한 각각의 특정한 항체의 결합 및 특이성에서 사용되는 것을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 고르게 분포되지 않는다. 이것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에 과가변 영역 (HVR) 으로 불리는 3 개의 분절에서 집중된다. 가변 도메인의 좀더 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR) 으로 불린다. 고유의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 베타-시트 구조를 연결하는, 그리고 일부 경우에서 이의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 3 개의 HVR 에 의해 연결된 대부분 베타-시트 배치구성을 채용하는 4 개의 FR 영역을 포함한다. 각각의 사슬 중의 HVR 은 FR 영역에 아주 근접하여 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 HVR 과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (참조 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여되지 않으나, 다양한 효과기 기능, 예컨대 항체-의존적 세포 독성에서 항체의 참여를 나타낸다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (면역글로불린) 의 "경쇄" 는 그것의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반한, 카파 (κ) 및 람다 (λ) 로 불리는 2 개의 명확히 구별되는 유형 중 하나에 배정될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 사용된 항체는 임의의 동물 기원으로부터일 수 있다. 하나의 구현예에서 항체는 인간, 쥣과 (예를 들면, 마우스 및 래트), 당나귀, 원숭이, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말, 또는 닭 항체이다.
그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (면역글로불린) 는 상이한 부류로 배정될 수 있다. 인간 면역글로불린에 5 개의 주요 부류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고, 이들 중 몇 개는 서브클래스 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 로 추가로 나눠질 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 로 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배치구성은 잘 알려지고, 예를 들면, Abbas et al. Cellular and Mol . Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co., 2000) 에 일반적으로 기재된다. 항체는 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드와의 공유 또는 비-공유 회합에 의해 형성된, 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
용어 "전장 항체," "온전한 항체," 및 "전체 항체" 는 본원에서 아래에 정의된 바와 같은 항체 단편이 아닌, 그것의 실질적으로 온전한 형태로의 항체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 가진 항체를 지칭한다.
"항체 단편" 은 바람직하게는 그의 항원-결합 영역을 포함하는, 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 단일-사슬 항체 분자; scFv, sc(Fv)2; 디아바디; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
항체의 파파인 소화는 각각 단일 항원-결합 부위, 및 그 명칭이 쉽게 결정화하는 그것의 능력을 반영하는 잔류 "Fc" 단편을 갖는, "Fab" 단편이라고 불리는 2 개의 동일한 항원-결합 단편을 생성한다. 펩신 처리는 2 개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 산출한다.
Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제 1 불변 도메인 (CH1) 을 함유한다. Fab' 단편은 항체-힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇 개의 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH 는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들) 이 자유 티올기를 가지고 있다는 Fab' 에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지된다.
"Fv" 는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 하나의 구현예에서, 2-사슬 Fv 종은 단단한, 비-공유 회합으로 1 개의 중쇄 및 1 개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일-사슬 Fv (scFv) 종에서, 1 개의 중쇄 및 1 개의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-사슬 Fv 종 (sc(Fv)2) 에 있는 것과 유사한 "이량체성" 구조로 회합할 수 있는 가요성 펩티드 링커에 의해 공유결합될 수 있다. 상기 배치구성에서 각각의 가변 도메인의 3 개의 HVR 이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6 개의 HVR 은 항체에 대한 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 오직 3 개의 HVR 을 포함하는 Fv 의 절반) 은, 심지어 전체 결합 부위보다 낮은 친화성이긴 하지만, 항원을 인지하고 결합하는 능력을 갖는다.
용어 "디아바디" 는 2 개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭하는데, 이 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL) 에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) 을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2 개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루고 2 개의 항원-결합 부위를 창출하도록 강요된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med . 9:129-134 (2003); 및 Holliger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993) 에 좀더 자세히 설명된다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 Hudson et al., Nat. Med . 9:129-134 (2003) 에 기재된다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체" 는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체, 즉, 집단을 포함하는 개별 항체가 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들면, 자연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 따라서, 수식어 "모노클로날" 은 항체의 특징을 별개의 항체의 혼합물이 아닌 것으로서 나타낸다. 특정 구현예에서, 이러한 모노클로날 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서 상기 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적-결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 방법에 의해 수득되었다. 예를 들면, 선택 방법은 복수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파아지 클론, 또는 재조합 DNA 클론의 집단으로부터의 독특한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은 예를 들면, 표적에 대한 친화성을 개선하기 위해, 표적 결합 서열을 인간화하기 위해, 세포 배양 중 그것의 생산을 개선하기 위해, 그것의 면역원성을 생체내에서 감소시키기 위해, 다중특이적 항체를 생성하는 등을 위해 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체가 또한 본 발명의 모노클로날 항체라는 것으로 이해되어야 할 것이다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프) 에 대항하여 지향된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 모노클로날-항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지향된다. 그들의 특이성에 더해, 모노클로날-항체 제제는 이들이 다른 면역글로불린에 의해 전형적으로 비오염되는 것이 유리하다.
수식어 "모노클로날" 은 항체의 특징이 실질적으로 균질한 집단의 항체로부터 수득되는 것으로 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 예를 들어, 하이브리도마 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Haemmerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참고), 파지-디스플레이 기술 (예를 들어, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol . Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol . Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, PNAS USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol . Methods 284(1-2): 119-132(2004) 참고), 및 인간 면역글로불린 서열을 엔코딩하는 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체의 제조를 위한 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., PNAS USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 (1995) 을 포함하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정한 종으로부터 유래된 항체 중의 또는 특정한 항체 부류 또는 서브클래스에 속하는 항체 중의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라성" 항체를 포함하는 한편, 사슬(들) 의 나머지는 이들이 요망된 생물학적 활성을 나타내는 한, 또다른 항체 부류 또는 서브클래스, 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편에 속하는 또는 또다른 종으로부터 유래되는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다 (예를 들면, 미국 특허 번호 4,816,567 및 Morrison et al., PNAS USA 81:6851-6855 (1984)). 키메라성 항체는 항체의 상기 항원-결합 영역이 예를 들면, 마카크 원숭이를 관심의 항원으로 면역화시킴으로써 생산된 항체로부터 유래되는 PRIMATIZED® 항체를 포함한다.
비-인간 (예를 들면, 쥣과) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라성 항체이다. 하나의 구현예에서, 인간화된 항체는 수령체의 HVR 로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성, 및/또는 수용력을 갖는 비-인간 종 (공여체 항체) 예컨대 마우스, 랫트, 토끼, 또는 비인간 영장류의 HVR 로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린 (수령체 항체) 이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체는 수령체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하도록 행해질 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 과가변성 루프가 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하는, 그리고 FR 의 모두, 또는 실질적으로 모두가 인간 면역글로불린 서열의 것인, 적어도 1 개의, 및 전형적으로 2 개의, 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이다. 인간화된 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc) 의 적어도 일부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가 설명을 위해, 예를 들어, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr . Op. Struct . Biol. 2:593-596 (1992) 를 참고한다. 또한 예를 들어, Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem . Soc . Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr . Op. Biotech. 5:428-433 (1994); 및 미국 특허 번호 6,982,321 및 7,087,409 를 참고한다.
"인간 항체" 는 인간에 의해 생산된 및/또는 본원에 기재된 인간 항체를 제조하기 위한 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조된, 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 제외한다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 포함하여, 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol ., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol ., 222:581 (1991). 또한 인간 모노클로날 항체의 제조에 이용가능한 것은 Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol ., 147(1):86-95 (1991) 에 기재된 방법이다. 또한 van Dijk and van de Winkel, Curr . Opin . Pharmacol ., 5: 368-74 (2001) 을 참고한다. 인간 항체는 항원 챌린지에 대해 반응하나, 그 내인성 유전자좌의 기능이 저해된 (disabled), 예를 들면, 면역화된 제노마우스에서 이러한 항체를 제조하기 위해 변형된 유전자도입 동물에게 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다 (예를 들어, XENOMOUSE™ 기술에 관해서는 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 참고). 또한, 예를 들어, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관해서는 Li et al., PNAS USA, 103:3557-3562 (2006) 을 참고한다.
용어 "과가변 영역," "HVR," 또는 "HV," 는 본원에서 사용되는 경우 루프를 구조적으로 정의하는 서열 및/또는 형태에서 과가변적인 항체-가변 도메인의 영역을 말한다. 일반적으로, 항체는 6 개의 HVR 을; 3 개는 VH 에 (H1, H2, H3), 3 개는 VL 에 (L1, L2, L3) 포함한다. 고유의 항체에서, H3 및 L3 은 6 개의 HVR 의 최대 다양성을 나타내고, H3 은 특히 항체에 대한 미세한 특이성을 부여하는데 독특한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 예를 들면, Xu et al. Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003) 을 참고한다. 사실상, 오직 중쇄로만 이루어진 자연 발생적 낙타과 항체는 경쇄의 부재 시 기능하고 안정적이다. 예를 들어, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) 및 Sheriff et al., Nature Struct . Biol . 3:733-736 (1996) 을 참고한다.
다수의 HVR 묘사가 본원에 사용되고 포함된다. Kabat 상보성-결정 영역 (CDR) 인 HVR 은 서열 가변성을 기반으로 하고 가장 통상적으로 사용된다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Chothia 는 구조적 루프의 위치 대신에 언급된다 (Chothia and Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)). AbM HVR 은 Kabat CDR 과 Chothia 구조 루프 사이의 절충을 나타내고, Oxford Molecular's AbM 항체-모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR 은 이용가능한 복합 결정 구조의 분석에 기반한다. 이들 HVR 각각으로부터의 잔기를 하기에 명시한다.
HVR 은 하기와 같은 "연장된 HVR" 을 포함할 수 있다: VL 중 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2), 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH 중 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2), 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변성-도메인 잔기는 각각의 이들 연장된-HVR 정의에 대해, Kabat et al., supra 에 따라 넘버링된다.
표현 "Kabat 으로의 가변성-도메인 잔기-넘버링" 또는 "Kabat 으로의 아미노-산-위치 넘버링," 및 이의 변이는, Kabat et al., supra 에서의 항체 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인을 위해 사용되는 넘버링 시스템을 말한다. 본 넘버링 시스템을 사용하면, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR 의 단축, 또는 그 내로의 삽입에 상응하는 몇 개의 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 도메인은 H2 의 잔기 52 후에 단일 아미노산 삽입체 (Kabat 에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 후에 삽입된 잔기 (예를 들면 Kabat 에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c, 등) 를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 "표준" Kabat 넘버링된 서열과 항체의 서열의 상동성의 영역에서 정렬에 의해 제시된 항체에 대해 결정될 수 있다.
본 명세서에서 개시된 바와 같이, 결합 쌍의 제 2 파트너는 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위 (PEG 12 내지 30) 를 포함하는 링커를 통해 분석물-특이적 결합제에 결합된다.
용어 "링커" 는 제 1 모이어티를 제 2 모이어티 또는 더 많은 모이어티와 콘쥬게이션 (연결) 시키는데 사용될 수 있는 이중작용성 또는 다중작용성 모이어티를 나타낸다. 서로에 대해 결합된 제 1 및 제 2 모이어티를 포함하는 콘쥬게이트는 2 개의 반응성 작용기를 갖는 링커를 사용하여 편리하게 제조될 수 있다. 이러한 콘쥬게이트에서, 2 개의 모이어티는 상기 링커를 "통해" 결합된다. 당업자에게는 명백한 바와 같이, 이러한 콘쥬게이트에서 링커의 기능성 모이어티는 미반응된 작용성 모이어티로서가 아닌 결합의 일부로서 존재한다.
이론에 구애되지 않으면서, 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 링커가 본원에 개시된 놀라운 발견에 대한 핵심이라고 여겨진다. 분석물의 측정을 위한 마이크로입자-기반 어세이에 대한 선행기술에서 오직 짧은 PEG-함유 링커 분자가 심각하게 고려된다. US 5,521,319 에는 생체분자의 비오틴화에 매우 유용한 것으로 입증된 신규한 시약이 기재된다. 링커의 길이는 짧은 것으로 교시된다 (즉 최대 5 단위의 에틸렌 옥사이드, 바람직하게는 오직 1 내지 3 개의 단위의 에틸렌 옥사이드 및 가장 바람직하게는 2 개의 이러한 단위). 상기 교시와는 반대로 이제 놀랍게도 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이에서 긴 링커 분자 - 12 내지 30 개의 에틸렌 옥사이드 단위를 포함함 (= PEG 12 내지 30) - 는 결합 쌍의 제 2 구성원, 예를 들면 비오틴을, 분석물-특이적 작용제에 커플링하는데 사용되는 경우 유리하다는 것이 밝혀졌다.
비오틴을 PEG-링커를 통해 표적 분자에 연결 또는 커플링하기 위한 적합한 시약은 예를 들어, 화학식 I 에 따른 시약이다:
화학식 I 중의 (n) 은 에틸렌 글리콜 단위의 수에 관한 것일 것이다. n 은 바람직하게는 12 내지 30 이다.
본 발명의 방법은 매우 다양한 포맷으로 구축될 수 있다. 이러한 포맷은 샌드위치 어세이 및 경쟁적 결합 어세이와 같은 당업계에 공지된 포맷을 포함한다 (예를 들어, 하기 참고문헌 참조: Nonradioactive Labeling and Detection of Molecules, Kessler, C., ed., Springer-Verlag: Berlin 1992; The Immunoassay Handbook, Wild, D., ed., Stackton Press: New York 1994; Keller, G.H. and Manak, M.M. DNA Probes, 2nd Ed., MacMillan Publishers Ltd.: London, 1993; Tietz Textbook of Clinical Chemistry 2nd Edition, Burtis et al. Ed., W.B. Saunders and Co.: Philadelphia, 1994).
본 발명에 따른 방법에서, 분석물이 측정된다. 당업자는 마이크로입자에 결합된 분석물의 측정이 통상적으로 적절한 어세이 성분 상의 표지에 의해 운반되거나 생성된 신호의 측정에 의해, 그리고 분석물에 대한 표준 곡선으로부터 분석물의 농도를 계산함으로써, 즉 이에 의해 분석물을 측정함으로써 이루어짐을 쉽게 알 수 있을 것이다. 표지가 일반적으로 부착되는 어세이 성분은 분석물-특이적 결합제 (샌드위치-유형 어세이) 이거나 어세이는 표지된 분석물과 샘플 내의 분석물 사이의 경쟁을 이용한다. 표지가 측정되기 전에, 표지된 어세이 성분의 일부를 포함하는 마이크로입자는 마이크로입자에 결합되지 않은 표지된 어세이 성분의 부분으로부터 분리된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 방법은 샌드위치 어세이 포맷에서 실시된다. 전형적으로 샌드위치 어세이 포맷은 결합 쌍의 제 1 파트너로 코팅된 마이크로입자, 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 분석물-특이적 결합제, 분석물을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 혼합하는 것을 포함하며, 이때 상기 결합 쌍의 제 2 파트너는 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위 (PEG 12 내지 30) 를 포함하는 링커를 통해 상기 분석물-특이적 결합제에, 그리고 검출가능하게 표지된 제 2 분석물-특이적 결합제에 결합된다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 이들 성분을 혼합하고, 검출가능하게 표지된 분석물-특이적 결합제를 분석물, 결합 쌍의 제 2 파트너 (에 결합된) 분석물-특이적 결합제 및 마이크로입자에 대한 결합 쌍의 제 1 파트너를 통해 결합시키기 위해 충분한 시간 동안 인큐베이션한다. 하나의 구현예에서, 세척 단계, 그러한 혼합/인큐베이션이 없는 샌드위치 어세이는 단일 반응 용기에서 수행된다. 4 가지 성분 (코팅된 마이크로입자, 샘플, 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 분석물-특이적 결합제, 및 검출가능하게-표지된 분석물-특이적 결합제 각각) 을 첨가하고 혼합하는 순서는 중요하지 않다. 하나의 구현예에서, 결합 쌍의 제 1 구성원으로 코팅된 마이크로입자, 샘플 및 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 분석물-특이적 결합제의 세척 단계, 첨가 및 혼합이 있는 샌드위치 어세이는 단일 반응 용기에서 수행된다. 이 첫 번째 (분석물 - 포획) 단계 후에, 이제 분석물이 결합되어 있는 마이크로입자를 검출가능하게 표지된 분석물-특이적 결합제를 첨가하기 전에 세척한다. 처음 3 가지 성분 (코팅된 마이크로입자, 샘플 및 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 분석물-특이적 결합제, 각각) 의 첨가 및 혼합 순서는 중요하지 않다.
하나의 구현예에서, 샌드위치-유형 어세이 포맷에서, 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 분석물-특이적 결합제, 및 검출가능하게 표지된 분석물-특이적 결합제는 각각 상이하고 중첩되지 않는 에피토프에서 분석물에 결합한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 방법은 경쟁적 어세이 포맷으로 실시된다.
전형적으로 경쟁적 어세이 포맷은 결합 쌍의 제 1 파트너로 코팅된 마이크로입자, 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 분석물-특이적 결합제, 분석물을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 혼합하는 것을 포함하며, 이때 상기 결합 쌍의 제 2 파트너는 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위 (PEG 12 내지 30) 를 포함하는 링커를 통해 상기 분석물-특이적 결합제에, 그리고 검출가능하게 표지된 분석물의 양에 결합된다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 이들 성분을 혼합하고, - 샘플 내 분석물에 의한 경쟁 후 - 결합 쌍의 제 2 파트너 및 마이크로입자에 코팅된 결합 쌍의 제 1 파트너에 (결합된) 분석물-특이적 결합제를 통해 마이크로입자에 결합할 수 있는 검출가능하게 표지된 분석물의 분획을 결합에 충분한 시간 동안 인큐베이션한다.
분석물-특이적 결합제 또는 분석물의 표지화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Haugland (2003) Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley (1992) Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGruyter, Berlin and New York; and Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); DeLeon-Rodriguez et al, Chem. Eur. J. 10 (2004) 1149-1155; Lewis et al, Bioconjugate Chem. 12 (2001) 320-324; Li et al, Bioconjugate Chem. 13 (2002) 110-115; Mier et al Bioconjugate Chem. 16 (2005) 240-237 에서 분명하게 기재되어 있다.
용어 검출가능하게 표지된다는 것은 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 표지를 포함한다.
간접적으로 검출가능하게 표지된다는 것은, 예를 들면 합텐으로의 표지화 및 직접적으로 검출가능한 표지를 가지고 있는 항-합텐 항체에 의한 이러한 합텐화된 화합물의 검출 또는 효소로의 표지화 및 적절한 염료 기질의 전환을 산출하는 그것의 상응하는 효소 활성에 의한 이러한 효소의 검출을 말한다. 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하거나 또는 개시된다 (예를 들면 US 4,275,149 참고). 효소는 일반적으로 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학적 변경을 촉매화한다. 예를 들면, 효소는 분광광도법적으로 측정될 수 있는 기질 내의 색상 변화를 촉매화할 수 있다. 대안적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경할 수 있다. 화학발광 기질은 화학적 반응에 의해 전자적으로 여기되며, 이후 측정될 수 있는 (예를 들면, 화학발광분석기를 사용함) 빛을 방출할 수 있거나 또는 에너지를 형광 수용체로 기부한다. 효소 표지의 예는 루시퍼라아제 (예를 들면, 반딧불 루시퍼라아제 및 박테리아 루시퍼라아제; US 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 탈수소효소, 우레아제, 페록시다아제 예컨대 홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP), 알칼리성 포스파타제 (AP), 3-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 당류 옥시다제 (예를 들면, 글루코스 옥시다제, 갈락토오스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소), 헤테로시클릭 옥시다제 (예컨대 우리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토페록시다아제, 마이크로페록시다아제, 등을 포함한다. 폴리펩티드에 효소를 콘쥬게이션하기 위한 기술은 O'Sullivan et al "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", in Methods in Enzym. (ed. by J. Langone & IT Van Vunakis), Academic Press, New York, 73 (1981) 147-166 에 기재된다.
효소-기질 조합의 예 (US 4,275,149; US 4,318,980) 는, 예를 들면: 기질로서 수소 페록시다아제를 가진 홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP) [여기서 상기 수소 페록시다아제는 염료 전구체 (예를 들면, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 히드로클로라이드 (TMB)) 를 산화시킴]; 발색 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트를 가진 알칼리성 포스파타제 (AP); 및 발색 기질 (예를 들면, p-니트로 페닐-(3-D-갈락토시다아제) 또는 형광발색 기질 4-메틸움벨리페릴-(3-D-갈락토시다아제) 를 가진 (3-D-갈락토시다아제 ((3-D-Gal) 를 포함한다.
직접적으로 검출가능한 표지는 검출가능한 신호를 제공하거나 또는 이들은 제 2 표지와 상호작용하여, 제 1 및 제 2 표지에 의해 제공된 검출가능한 신호를 개질하도록, 예를 들면 FRET (형광 공명 에너지 전달) 를 제공하도록 한다. 표지, 예컨대 형광 염료 및 발광성 (화학발광 및 전기화학발광 포함) 염료 (Briggs et al "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1 (1997) 1051-1058) 는 검출가능한 신호를 제공하고, 일반적으로 표지화에 적용가능하다. 하나의 구현예에서 검출가능하게 표지된다는 것은 검출가능한 신호를 제공하는 또는 제공하도록 유도가능한 표지, 즉 형광 표지, 화학발광 표지 또는 전기화학발광 표지, 각각을 말한다.
본 발명에 따른 하나의 구현예에서, 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이는 화학발광 또는 전기화학발광 표지 및 상응하는 빛 검출 시스템을 사용한다. 표지에 의해 생성된 빛이 측정되고, 분석물의 존재 또는 양을 직접적으로 또는 간접적으로 나타낸다.
전기화학발광 (ECL) 어세이는 관심의 분석물의 존재 및 농도의 민감성 및 정확한 측정을 제공한다. 이러한 기술은 적절한 화학적 환경에서 전기화학적으로 산화된 또는 환원된 경우 발광을 유도할 수 있는 표지 또는 다른 반응물을 사용한다. 이러한 전자화학발광은 특정한 시간 및 특정한 방식으로 작동 전극에 부과된 전압에 의해 유발된다. 표지에 의해 생산된 빛이 측정되고, 분석물의 존재 또는 양을 나타낸다. 이러한 ECL 기술의 좀더 완전한 설명을 위해서는, 미국 특허 번호 5,221,605, 미국 특허 번호 5,591,581, 미국 특허 번호 5,597,910, PCT 공개 출원 WO90/05296, PCT 공개 출원 WO92/14139, PCT 공개 출원 WO90/05301, PCT 공개 출원 WO96/24690, PCT 공개 출원 US95/03190, PCT 출원 US97/16942, PCT 공개 출원 US96/06763, PCT 공개 출원 WO95/08644, PCT 공개 출원 WO96/06946, PCT 공개 출원 WO96/33411, PCT 공개 출원 WO87/06706, PCT 공개 출원 WO96/39534, PCT 공개 출원 WO96/41175, PCT 공개 출원 WO96/40978, PCT/US97/03653 및 US 특허 출원 08/437,348 (미국 특허 번호 5,679,519) 을 참고한다. 또한 Knight, et al. 에 의한 ECL 의 분석적인 적용의 1994 년 리뷰 (Analyst, 1994, 119: 879-890) 및 그곳에 언급된 참고를 참조한다. 하나의 구현예에서 본 발명에 따른 방법은 전자화학발광 표지를 사용하여 실시된다.
상기 언급된 바와 같이, 전자화학발광은 특정 시간 및 특정 방식으로 작동 전극에 부과되는 전압에 의해 유발된다. 종래 기술에 상세히 언급되지 않은 것은 작동 전극 상의 마이크로입자의 분포가 어세이의 품질에 큰 영향을 준다는 사실이다. 마이크로입자 사이에 더 많은 응집체가 존재할수록 -경험으로- 하나 이상의 어세이 특징의 품질이 낮아진다. 응집된 입자는 종종 측정 사이의 더 높은 변동 계수, 더 높은 백그라운드 신호 및/또는 감소된 어세이 민감도를 초래한다.
쉽게 상상할 수 있듯이, 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합되고 분석물-특이적 결합제의 분자 당 제 2 결합 파트너 2 개 이상의 분자를 포함하는 분석물-특이적 결합제의 사용은 결합 쌍의 제 1 파트너 (의 많은 분자) 로 코팅된 마이크로입자의 응집을 쉽게 초래할 수 있다. 따라서 종래 기술에서 분석물-특이적 결합제의 1 개의 분자 및 결합 쌍의 제 2 파트너의 1 개의 분자로 이루어지는 콘쥬게이트를 제조하려는 많은 시도가 있었다. 그러한 1:1 콘쥬게이트를 수득하기에 적합한 방법이 예를 들어, US 6,391,571 에 기재되어 있다.
부위-특이적 단백질 표지화, 특히 단백질의 부위-특이적 모노-표지화를 위한 가장 중요한 최근의 접근법 중 하나는 효소적 반응을 통해 특정 부위에서 이들 단백질 내로 생물직교성 (bioorthogonal) 작용기를 도입하는 것이다. "단백질의 효소적 표지화" 에 대한 최근 리뷰를 위해서는, M. Rashidian et al., Bioconjugate Chemistry 24 (2013) 1277-1294 를 참고한다. 본 리뷰에서 포괄되는 부위-특이적 콘쥬게이션에 사용되는 효소는 포르밀글리신 생성 효소, 시알릴트랜스페라아제, 포스포판테테이닐트랜스페라아제, O-GlcNAc 번역-후 개질, 소르태깅 (sortagging), 트랜스글루타미나아제, 파르네실트랜스페라아제, 비오틴 리가아제, 리포산 리가아제, 및 N-미리스토일트랜스페라아제를 포함한다.
놀랍게도, 효소 섹션을 통해 제시되는 바와 같이, 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위 (PEG 12 내지 30) 를 포함하는 링커를 통한 결합 쌍의 제 2 파트너의 단일 분자에 결합된 분석물-특이적 결합제, 예를 들어, 모노비오틴화 항체는, 변동 계수 뿐 아니라 신호-대-노이즈 비 둘 다와 관련하여 매우 양호한 어세이 성능을 도출한다.
부가적으로, 상기 결합 쌍의 제 2 파트너가 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위 (PEG 12 내지 30) 를 포함하는 링커를 통해 상기 분석물-특이적 결합제에 결합되는, 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 분석물-특이적 결합제의 사용은, 표준 커플링 화학의 사용에 의해 수득된 1:1 화학량론보다 높은 모노-비오틴화 또는 콘쥬게이트의 제거를 필요로 하지 않는 것으로 보인다. 예상되는 바와 같이, 1:1 화학량론보다 높은 콘쥬게이트를 포함하는 콘쥬게이트 제제는 비이드 응집을 도출하는 경향이 있다. 그러나, 상기 효과는 훨씬 덜 가시적이고, 결합 쌍의 제 2 파트너가 심지어 1:1 화학량론보다 높게, 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위 (PEG 12 내지 30) 를 포함하는 링커를 통해 상기 분석물-특이적 결합제에 결합하는 경우에 확연하다.
본 이론에 구애되지 않으면서, 가능한 설명은 이들 비교적 길고 유연한 PEG 링커가, 코팅된 마이크로입자에 존재하고 도달하는 이러한 결합 쌍의 제 1 파트너의 결합 부위에 대한 결합 쌍의 제 2 파트너의 다수의 빠른 결합을 가능하게 한다는 것일 수 있다. 반대로, 분석물-특이적 결합제 상의 결합 쌍의 여러 제 2 파트너는 동일한 마이크로입자 상의 또다른 제 1 결합 파트너에 결합하기에는 너무 짧은 링커를 가지며 그보다는 제 2 마이크로입자 상의 적합한 제 1 결합 파트너를 발견하여 - 그에 의해 비이드 응집에 대한 경향을 명백하게 촉진하는 경향이 있다. 도 1 및 2 는 상기 이론을 도식적으로 나타내려는 시도이다.
결합 쌍의 제 2 파트너와의 "과-표지화" 를 피하기 위해, 지금까지의 표준 화학은 분석물-특이적 결합제 및 결합 쌍의 제 2 구성원의 비교적 낮은 비를 사용해야만 한다. 평균 콘쥬게이트 제제의 1:1 화학량론을 달성하기 위해 통상, 결합 쌍의 제 2 파트너 (예를 들어, 비오틴화 시약 중의 비오틴) 는 분석물-특이적 결합제 (예를 들어, 항체) 에 대해 1.3-배 과량으로 사용된다. 이러한 1.3 내지 1 커플링 조건에서, 산출되는 콘쥬게이트 제제는 약 37% 의 비-콘쥬게이션된 항체; 약 37 % 의 모노-비오틴화 항체, 또한 18%, 6% 및 2% 의 이중-, 삼중- 또는 그 이상의 삼중-비오틴화 항체를, 각각 포함한다. 통상 1:1-콘쥬게이트를 나타내는 분획은 시판 면역 어세이에서의 최적 결과를 달성하기 위해 정제되어야만 한다.
반대로, 결합 쌍의 제 2 파트너가 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위 (PEG 12 내지 30) 를 포함하는 링커를 통해 상기 분석물-특이적 결합제에 결합되는 경우, 표준 커플링 화학이 - 심지어 더 높은 몰비에서 결합 쌍의 커플링된/결합된 제 2 구성원인 경우에도 - 1:1 콘쥬게이트를 포함하는 분획의 단리를 필요로 하지 않고, 사용될 수 있다. 명백하게, 이것은 본원에 기재된 방법에서의 이러한 콘쥬게이트의 성능 외에도, 이러한 콘쥬게이트의 제조에서 큰 장점이다.
하나의 구현예에서 본 발명은 분석물-특이적 결합제에 결합된 결합 쌍의 제 2 파트너 사이의 평균 몰비가 1.1 이상인 조성물에 포함되는 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 콘쥬게이션된 특이적 결합제에 관한 것이다.
하나의 구현예에서 본 발명은 분석물-특이적 결합제에 결합된 결합 쌍의 제 2 파트너 사이의 평균 몰비가 1.1 내지 10 인 조성물에 포함되는 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 콘쥬게이션된 특이적 결합제에 관한 것이다.
하나의 구현예에서 본 발명은 분석물-특이적 결합제에 결합된 결합 쌍의 제 2 파트너 사이의 평균 몰비가 1.2 내지 6 인 조성물에 포함되는 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 콘쥬게이션된 특이적 결합제에 관한 것이다.
하나의 구현예에서 본 발명은 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이 중의 분석물의 측정 방법에 관한 것으로서 (상기 마이크로입자는 결합 쌍의 제 1 파트너로 코팅됨), 상기 방법은 a) 코팅된 마이크로입자, 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 분석물-특이적 결합제, 및 분석물을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 혼합 (상기 결합 쌍의 제 2 파트너는 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위 (PEG 12 내지 30) 를 포함하는 링커를 통해 상기 분석물-특이적 결합제에 결합됨) 함으로써, 분석물을 분석물-특이적 결합제를 통해 코팅된 마이크로입자에 결합시키고, 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 상기 콘쥬게이션된 특이적 결합제는, 분석물-특이적 결합제에 결합된 결합 쌍의 제 2 파트너 사이의 평균 몰비가 1.1 이상인 조성물에 포함되는 단계, b) 결합 쌍 및 분석물-특이적 결합제를 통해 결합된 분석물을 포함하는 마이크로입자를 혼합물로부터 분리하는 단계 및 c) 마이크로입자에 결합된 분석물을 측정하는 단계를 포함한다.
하나의 구현예에서 본 발명은 단일 용기 유닛의 별도의 용기 또는 분리된 구획에 결합 쌍의 제 1 파트너로 코팅된 적어도 마이크로입자 및 상기 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 분석물-특이적 결합제를 포함하는 키트로서, 상기 결합 쌍의 제 2 파트너가 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위 (PEG 12 내지 30) 를 포함하는 링커를 통해 상기 분석물-특이적 결합제에 결합되는 키트에 관한 것이다.
용어 단일 용기 유닛은 많은 자동 분석기, 예컨대 Elecsys® 분석기 시리즈 (Roche diagnostics) 에 대해, 특정 분석물을 측정하는데 필요한 시약은 "시약 팩" 의 형태로, 즉, 분석기 상에 피팅되고 상이한 구획 내에 관심의 분석물의 측정에 필요한 핵심 시약 모두를 함유하는 하나의 용기 단위로서 제공된다는 사실에 관한 것이다.
하나의 구현예에서 본 발명은 상기 결합 쌍의 제 1 파트너가 아비딘 또는 스트렙타비딘이고, 상기 결합 쌍의 상기 제 2 파트너가 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴으로부터 선택되는 키트에 관한 것이다.
하나의 구현예에서 본 발명은 단일 용기 유닛의 별도의 용기 또는 분리된 구획 내에 아비딘 또는 스트렙타비딘으로 코팅된 적어도 마이크로입자, 및 비오틴화 분석물-특이적 결합제를 포함하는 키트로서, 상기 비오틴은 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위 (PEG 12 내지 30) 를 포함하는 링커를 통해 상기 분석물-특이적 결합제에 결합되는 키트에 관한 것이다.
도 1
최신 링커를 통해 여러 개의 비오틴 모이어티 (Bi) 에 결합된 분석물-특이적 결합제에 의해 야기된 비이드 응집 및 상이한 비이드 상의 스트렙타비딘 분자 (비이드 상의 십자가 모양) 에 대한 결합의 도식적 설명.
도 2 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 링커를 통해 여러 개의 비오틴 모이어티 (Bi) 에 결합된 분석물-특이적 결합제의 사용으로 인한 비이드 응집 부재 및 동일한 비이드 상의 스트렙타비딘 분자 (비이드 상의 십자가 모양) 에 대한 결합의 도식적 설명.
도 3 비오틴화를 위해 비오틴-DDS 를 사용하는 실험 HCV 코어 항원 어세이에서 수득된 바와 같은 자동화 cobas® e601 분석기 (Roche Diagnostics GmbH) 의 측정 (작동) 전극 상의 비이드의 패턴: 윗줄의 2 개 사진은 음성 또는 대조군 샘플 중의 비이드 분포를 나타낸다. 아랫줄의 2 개의 사진은 HCV-양성 샘플 중의 비이드 분포를 나타낸다. 좌측면 상의 2 개의 사진은 모노-비오틴화 항체로의 비이드 분포를 나타낸다. 우측면 상의 2 개의 사진은 콘쥬게이트의 제제 내 항체 당 3.5 등가의 비오틴화 시약을 사용함으로써 수득된 콘쥬게이트 제제로의 비이드 분포를 나타낸다. 우측 사진으로부터 명백하듯이, 비이드 분포는 매우 불균등하고/불안정하며, 전극의 좌측 부분 상에 가장 많은 비이드가 있다.
도 4 비오틴화를 위해 비오틴-PEG24-NHS 를 사용하는 실험 HCV 코어 항원 어세이에서 수득된 바와 같은 자동화 cobas® e601 분석기 (Roche Diagnostics GmbH) 의 측정 (작동) 전극 상의 비이드의 패턴: 윗줄의 2 개 사진은 음성 또는 대조군 샘플 중의 비이드 분포를 나타낸다. 아랫줄의 2 개의 사진은 HCV-양성 샘플 중의 비이드 분포를 나타낸다. 좌측면 상의 2 개의 사진은 모노-비오틴화 항체로의 비이드 분포를 나타낸다. 우측면 상의 2 개의 사진은 콘쥬게이트의 제제 내 항체 당 5 등가의 비오틴화 시약을 사용함으로써 수득된 콘쥬게이트 제제로의 비이드 분포를 나타낸다. 심지어 상기 높은 비의, 항체 당 비오틴화 시약에서, 비이드는 전극 상에서 균질한 분포를 보인다.
도 2 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 링커를 통해 여러 개의 비오틴 모이어티 (Bi) 에 결합된 분석물-특이적 결합제의 사용으로 인한 비이드 응집 부재 및 동일한 비이드 상의 스트렙타비딘 분자 (비이드 상의 십자가 모양) 에 대한 결합의 도식적 설명.
도 3 비오틴화를 위해 비오틴-DDS 를 사용하는 실험 HCV 코어 항원 어세이에서 수득된 바와 같은 자동화 cobas® e601 분석기 (Roche Diagnostics GmbH) 의 측정 (작동) 전극 상의 비이드의 패턴: 윗줄의 2 개 사진은 음성 또는 대조군 샘플 중의 비이드 분포를 나타낸다. 아랫줄의 2 개의 사진은 HCV-양성 샘플 중의 비이드 분포를 나타낸다. 좌측면 상의 2 개의 사진은 모노-비오틴화 항체로의 비이드 분포를 나타낸다. 우측면 상의 2 개의 사진은 콘쥬게이트의 제제 내 항체 당 3.5 등가의 비오틴화 시약을 사용함으로써 수득된 콘쥬게이트 제제로의 비이드 분포를 나타낸다. 우측 사진으로부터 명백하듯이, 비이드 분포는 매우 불균등하고/불안정하며, 전극의 좌측 부분 상에 가장 많은 비이드가 있다.
도 4 비오틴화를 위해 비오틴-PEG24-NHS 를 사용하는 실험 HCV 코어 항원 어세이에서 수득된 바와 같은 자동화 cobas® e601 분석기 (Roche Diagnostics GmbH) 의 측정 (작동) 전극 상의 비이드의 패턴: 윗줄의 2 개 사진은 음성 또는 대조군 샘플 중의 비이드 분포를 나타낸다. 아랫줄의 2 개의 사진은 HCV-양성 샘플 중의 비이드 분포를 나타낸다. 좌측면 상의 2 개의 사진은 모노-비오틴화 항체로의 비이드 분포를 나타낸다. 우측면 상의 2 개의 사진은 콘쥬게이트의 제제 내 항체 당 5 등가의 비오틴화 시약을 사용함으로써 수득된 콘쥬게이트 제제로의 비이드 분포를 나타낸다. 심지어 상기 높은 비의, 항체 당 비오틴화 시약에서, 비이드는 전극 상에서 균질한 분포를 보인다.
하기 실시예, 도면 및 서열은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 이의 참 범주는 특허청구범위에 언급된다. 본 발명의 취지로부터 벗어남 없이 절차에 변형이 언급될 수 있음을 이해한다.
상기 발명이 이해의 명확성을 목적으로 예시로서 및 실시예에서 일부 상세하게 설명될지라도, 설명 및 실시예는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
모노클로날 항체는 상기 본원에 기재된 바와 같은 표준 하이브리도마 기술에 의해 또는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다.
재조합 DNA 기술
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 에 기재된 바와 같이 DNA 를 조작하기 위해 표준 방법을 사용하였다. 분자 생물학 시약은 제조자의 지침에 따라 사용되었다.
유전자 및 올리고뉴클레오티드 합성
원하는 유전자 분절을 Geneart GmbH (Regensburg, Germany) 에서 화학적 합성에 의해 제조하였다. 합성된 유전자 절편을 증식/증폭을 위해 E. coli 플라스미드 내로 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 절편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 입증하였다. 대안적으로, 짧은 합성 DNA 절편을 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 어닐링함으로써 또는 PCR 을 통해 어셈블리하였다. 각각의 올리고뉴클레오티드를 metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Germany) 에 의해 제조하였다.
기본/표준 포유류 발현 플라스미드의 설명
원하는 유전자/단백질 (예를 들어, 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄, 또는 그 N-말단에 올리고글리신을 함유하는 Fc-사슬) 의 발현을 위해, 하기 기능적 요소를 포함하는 전사 단위가 사용된다:
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인트론 A 를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 전초기 인핸서 및 프로모터,
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인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 영역 (5'UTR),
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쥣과 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
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발현하고자 하는 유전자/단백질 (예를 들어, 전장 항체 중쇄), 및
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소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH pA).
발현하고자 하는 원하는 유전자를 포함하는 발현 유닛/카세트 외에, 기본/표준 포유류 발현 플라스미드는 하기를 포함한다:
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E. coli 에서 상기 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기원, 및
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E. coli 에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마아제 유전자.
단백질 측정
정제된 폴리펩티드의 단백질 농도는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기반하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 또는 비색 BCA 방법을 사용하여, 280 ㎚ 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 측정되었다.
실시예
1
활성화된
비오틴화
시약의 합성
최신 활성화된 비오틴-포함 링커 (비오틴화 시약), 예컨대 널리 사용되는 링커 비오틴-DDS 의 합성은 EP 632 810 에 기재되어 있다.
비오틴-PEGn-NHS-비오틴화 시약 (CAS-Nr. 365441-71-0; n = 에틸렌 옥시드 단위의 수) 은 IRIS Biotech GmbH 로부터 수득되거나 사내에서 합성된다. 비오틴-PEG~110-NHS (비오틴-PEG-NHS, MW 5000 Da) 를 Iris Biotech GmbH (Germany) 에서 구입하였다.
드 누보 (de novo) 합성에서, 에틸렌 옥시드 단위의 개별 갯수의 통제는 Chen and Baker, J. Org. Chem. 1999, 64, 6840-6873 로부터 기재된 방법에 따라, 더 짧은 PEG, 예컨대 테트라에틸렌 글리콜의 단계식 신장에 의해 확보되었다.
제 1 단계에서, 비스-트리틸-PEGn 1 이 수득되었다 (명백하게, n 은 에틸렌 글리콜 단위의 수를 나타냄).
1 의 탈보호는 디옥산 중의 1M HCl 에서 1h 동안 실온에서 교반함으로써 실시되었다. 증발 후 잔류물을 맑은 용액이 수득될 때까지 메탄올에서 환류시키고, 플라스크를 4℃ 에서 밤새 유지하였다. 여과 후 용액을 헥산으로 추출하고, 메탄올 층을 증발시키고 건조시켜, 상응하는 PEGn-디올 2 를 오일 또는 왁스로서 산출하였다 (PEG 의 단위 (n) 의 길이/수에 따른 농도).
그 다음 산 작용의 도입을 Seitz and Kunz, J. Org. Chem. 1997, 62, 813-826 에 따라 tert-부틸 아크릴레이트에 PEGn-디올의 소듐 촉매화된 첨가에 의해 실시하였다. 이러한 방식으로 화합물 3 이 수득된다.
메틸렌 클로라이드 중의 HO-PEGn-COOtBu 3 (1 등가) 및 트리에틸아민 (2.5 등가) 의 용액에 메틸술포닐 클로라이드 (2 등가) 를 0℃ 에서 적가하였다. 1h 동안의 교반 후 수성 워크-업 및 증발을 후속한다.
메실레이트 4 (1 등가) 를 실온에서 2 일 동안 디메틸포름아미드 중에서 교반함으로써 NaN3 (2 등가) 과 직접 반응시켰다. 고체 및 디메틸포름아미드의 제거 후, 디에틸에테르 및 Na2CO3 으로의 수성 워크-업을 후속한다.
미정제 생성물 5 를 에틸 아세테이트/메탄올 15/1 중에서 실리카 상의 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 아지드 5 (1 등가) 의 환원을 실온에서 테트라히드로푸란/물 4/1 중의 트리페닐포스핀 (1.1 등가) 으로 24h 동안 교반에 의해 수행하였다. 증발 후 잔류물을 물에 현탁하고, 에틸 아세테이트로 수 회 세척하였다. 물 층을 증발시키고 건조시켜, 아민 6 을 무색 오일로서 산출하였다.
tert-부틸 에스테르의 분할을 물 중 5% 트리플루오로아세트산으로 실시하였다. 아미노-PEGn-산 7 을 물로 수 회 증발시킴으로써 수득하였다.
비오틴을 상응하는 N-히드록시숙신이미드 에스테르 8 (1.05 등가) 과 디메틸포름아미드 중의 트리에틸아민 (4 등가) 을 실온에서 밤새 커플링시킴으로써 도입하였다.
증발 후 미정제 생성물 9 를 아세토니트릴/물 중의 RP-HPLC 에 의해 정제하였다.
마지막으로, N-히드록시숙신이미드 에스테르 10 을 메틸렌 클로라이드 중의 N-히드록시숙신이미드 (1.1 등가) 및 에틸 디메틸아미노프로필 카르보디이미드 (1.1 등가) 와의 반응에 의해 형성하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 메틸렌 클로라이드로 희석하고 물로 세정하였다. 증발 및 건조로, 에틸렌 옥시드 단위의 수에 따라 각각, 오일, 왁스 또는 고체로서 순수 비오틴-PEGn-NHS 10 을 산출하였다.
반응식 1
비오틴-PEG(n)-NHS 의 합성
실시예
2
비오틴 및 루테늄
모이어티
, 각각의 항체에 대한 커플링
당업자에게 완전히 친숙한 최신 절차에 따라 항체를 수득하고 정제하였다.
커플링을 위해, 일반적으로 항체의 리신 ε-아미노 기를 N-히드록시-숙신이미드 활성화된 화합물에 의해 표적시켰다. 10 mg/ml 의 단백질 농도에서 항체를 N-히드록시-숙신이미드 활성화된 비오틴화 시약 및 N-히드록시-숙신이미드 활성화된 루테늄 표지화 시약, 각각으로 반응시켰다. 비오틴화 또는 표지화 시약, 각각/단백질 (항체) 의 몰 비는 각각의 항체 콘쥬게이트에 따라, 1.3:1 내지 5:1 로 다양하였다. 반응 완충액은 50 mM 포타슘 포스페이트 (pH 8.5), 150 mM KCl 이었다. 반응을 실온에서 30 분 동안 실시하고, L-리신을 10 mM 의 최종 농도로 첨가함으로써 중지시켰다. 커플링 반응 후, 미반응된 자유 비오틴/표지를 미정제 항체 콘쥬게이트를 겔 여과 컬럼 (Superdex 200 HI Load) 을 통과시킴으로써 또는 투석에 의해 제거하였다.
모노-비오틴화 항체 콘쥬게이트를 수득하기 위해, 0.5-1 M 암모늄 술페이트를 콘쥬게이트 용액에 첨가하였다. 용액을 50 mM 포타슘 포스페이트 (pH 7.5), 150 mM KCl, 0.5-1 M 암모늄 술페이트로 평형화된 스트렙타비딘 뮤테인 흡착제 (DE19637718 참고) 를 통과시켰다. 자신에게 커플링된/결합된 임의의 비오틴이 없는 항체는 흡착제에 결합하는 것이 불가능하고 세척제거되었다. 모노-비오틴화 항체 콘쥬게이트를 50 mM 포타슘 포스페이트 (pH 7.5), 150 mM KCl 및 2% DMSO 로 용리하였다. 항체 당 1 개 초과의 비오틴을 가진 항체 콘쥬게이트를 50 mM 포타슘 포스페이트 (pH 7.5), 150 mM KCl 및 2 mM 비오틴 ("+mSA") 으로 용리하였다.
실시예
3
HCV
코어 항체의 면역학적 검출에 대한
비오틴화
시약 중의 링커의 영향
1 개의 그리고 동일한 항-HCV (포획) 항체를 다양한 링커를 포함하는 비오틴화 시약의 사용에 의해 비오틴에 콘쥬게이션시켰다. 상이한 비오틴-링커-항체 콘쥬게이트의 성능을 자동화 cobas® e601 분석기 (Roche Diagnostics GmbH) 에서 평가하였다.
측정은 샌드위치 어세이 포맷으로 실시하였다. cobas® e601 분석기 중의 신호 검출은 전자화학발광에 기반한다. 본 샌드위치 어세이에서, 비오틴-콘쥬게이트 (즉, 포획 항체) 를 스트렙타비딘-코팅된 자석 비이드 (평균 비이드 크기 2.8 ㎛) 의 표면 상에 부동화시킨다. 검출-항체는 신호화 모이어티로서 복합체를 이룬 루테늄 양이온을 갖는다. 분석물의 존재 하에, 발색 루테늄 착물은 고체상에 가교되고 cobas® e601 분석기의 측정 셀에 포함되는 백금 전극에서 여기 후 620 ㎚ 에서 발광한다. 신호 출력은 임의의 광 단위이다. 여러 공급처로부터 구입한 HCV 코어 항원 양성 및 음성 인간 혈청 및 혈장 샘플로 측정을 수행하였다.
실험적 HCV 코어 항원 어세이를 다음과 같이 수행하였다. 50 ㎕ 의 정상 또는 HCV 항원 양성 샘플 및 항원을 방출하기 위한 전처리 시약을 함유하는 25 ㎕ 의 세제를 9 분 동안 함께 인큐베이션한 후, pH 7.0 이고 100 mM 포타슘 포스페이트 및 225 mM KCl 을 포함하는 동일한 생리학적 완충액 중의 35 ㎕ 의 2 μg/ml 포획 항체-비오틴 콘쥬게이트 및 40 ㎕ 의 1 μg/ml 검출 항체 루테늄 표지 콘쥬게이트의 첨가를 후속하였다. 부가적인 9 분 인큐베이션 시간 후, 50 ㎕ 스트렙타비딘-코팅된 상자성 마이크로입자를 첨가하고 추가 9 분 동안 인큐베이션하였다. 이후, HCV 코어 항원을 (이들 실험에서 발생된 전자화학발광 신호를 통해) 검출하였다.
표 1
상이한
HCV
포획 항체
콘쥬게이트의
비교
일반적으로, 높은 신호 대 노이즈 비 (S/N) 및 특히 백그라운드 신호에 대한 낮은 변동 계수 (CV) 는 특히 어세이에 대한 낮은 검출 한계 (어세이 민감성) 와 관련해서 중요한 어세이 성능 파라미터이다. EP 632 810 에 기재된 바와 같이, 스트렙타비딘-코팅된 마이크로입자 기반 어세이에서, 비오틴-DDS 비오틴화 시약은 더 짧은 또는 더 긴 링커를 각각 포함하는 다른 비오틴화 시약, 예컨대 비오틴-NHS 또는 비오틴-X-NHS 에 비해 바람직하다.
작업 전극 상의 비이드 분포 패턴을 평가하기 위해, 광전자 배증관을 카메라로 대체하였다. 일반적으로 작업 전극 상의 자성 포획 동안의 상자성 스트렙타비딘-코팅된 마이크로입자 및/또는 불균질 비이드 분포 패턴의 비이드 응집은 부분적 신호 손실 및 특히 증가된 CV 를 초래하는 것으로 알려져 있다. 또한 일부 샘플에 존재하는 소위 매트릭스 효과는 비이드 응집에 의해 야기되는 문제를 추가로 증가시킬 수 있다는 것이 알려져 있다.
표 1 에서의 데이터는 단일 비오틴-DDS 모이어티가 더 높은 S/N 값을 가질 때만 항체의 콘쥬게이트와 비교하는 경우 항체 당 다중 비오틴-DDS 모이어티로 콘쥬게이션된 항체를 보여준다. 그러나, 이것은 그의 단일 비오틴화 대응부와 비교하여 분석물-무함유 혈청에 대한 더 높은 CV 값의 희생을 가져온다. 게다가, 비오틴-DDS 로의 항체의 다중 비오틴화는 작업 전극 상의 자성 포획 동안 매우 불균질한 비이드 분포 패턴에 의해 명백해지는 상자성 스트렙타비딘-코팅된 마이크로입자의 비이드 응집을 유도한다 (도 3) (여기서 사용된 음성 혈청에는 매트릭스 효과가 없기 때문에, CV 에 대한 음성 영향은 오직 중간정도이다.) 엄격하게 모노-비오틴화 비오틴-DDS 콘쥬게이트는 작업 전극 상에 훨씬 더 균질한 비이트 패턴을 보여주고, 그러므로 이것은 매트릭스 효과를 줄이는 경향이 있다 (도 3).
모노-비오틴화 콘쥬게이트를 생성하기 위해 비오틴화에 대해 훨씬 더 긴 링커를 포함하는 비오틴-PEG24-NHS 를 사용하여, 신호 대 노이즈 비 및 CV 값은 각각, 증가 및 감소될 수 있었다. 비이드 패턴은 비오틴-DDS 상에 기반한 모노-콘쥬게이트와 같이, 매우 균질하다 (도 4). 놀랍게도, 비오틴-PEG24 모노-콘쥬게이트로, 신호-대-노이즈 비 뿐 아니라 변동 계수 모두와 관련하여, 매우 양호한 결과가 수득될 수 있었다. 항체 당 다중 비오틴-PEG24-NHS 비오틴화 시약으로 콘쥬게이션된 항체를 사용함으로써, 모노-비오틴화 콘쥬게이트에 대해 수득된 결과에 필적할만한 균질한 비이드 분포 패턴 및 낮은 CV 값이 수득될 수 있었다 (도 4). 신호 대 노이즈 비는 이들 실험에서 사용된 항체 당 비오틴 잔기의 범위에서 적어도 항체 당 비오틴 잔기의 수가 증가하면 상승한다.
실시예
4
트로포닌
T (
TnT
) 의 면역학적 검출에 대한
비오틴화
시약 중의 링커의 영향
하나의 그리고 동일한 항-트로포닌 T (항-TnT) (포획) 항체를 다양한 링커를 포함하는 비오틴화 시약의 사용에 의해 비오틴에 콘쥬게이션시켰다. 상이한 비오틴-링커-항체 콘쥬게이트의 성능을 Elecsys 트로포닌 T hs 어세이 키트에 대한 지침에 따라 실험 프로토콜에 기반한 자동화 cobas® e601 분석기 (Roche Diagnostics GmbH) 상에서 평가하였다.
측정을 샌드위치 어세이 포맷에서 실시하였다. cobas® e601 분석기에서의 신호 검출은 전자화학발광에 기반한다. 상기 샌드위치 어세이에서, 비오틴-콘쥬게이트 (즉, 포획 항체) 는 스트렙타비딘-코팅된 자석 비이드 (평균 비이드 크기 2.8 ㎛) 의 표면 상에 부동화된다. 검출-항체는 신호화 모이어티로서 복합체화 루테늄 양이온을 가지고 있다. 분석물의 존재 하에, 발색 루테늄 착물을 고체상에 가교시키고, cobas® e601 분석기의 측정 셀에 포함되는 백금 전극에서 여기 후 620 ㎚ 에서 발광한다. 신호 출력은 임의의 광 단위이다.
검정기로서 정의된 양의 재조합 인간 심장 TnT 로 보충된 인간 혈청으로 측정을 수행하였고, 결과를 표 2 에 제시한다.
표 2
실험
트로포닌T
-
어세이로
수득된
결과
표 2 에 제공된 데이터로부터, 긴 비오틴-PEG24-NHS 비오틴화 시약으로 제조된 포획 항체 콘쥬게이트가 비오틴과 항체 사이의 평균 비와는 관계 없이 더 짧은 비오틴-DDS 비오틴화 시약보다 우세하다는 것을 결론지을 수 있다. (실시예 1 에 설명되는 바와 같이 개념 "+mSA" 의 콘쥬게이트는 항체 당 2 개 이상의 비오틴 모이어티를 포함하는 분획을 나타낸다.)
실시예
5
HCV
코어 항원 원형 (prototype)
어세이에
대한
비오틴화
시약 중의 링커-길이의 변화
링커의 최적 길이를 측정하기 위해, 상이한 비오틴-PEG(n)-NHS 유도체를 HCV 포획 항체로 콘쥬게이션시키고, 실시예 3 에 기재된 바와 같은 HCV 코어 항원 실험 어세이에서 측정하였다. 각각의 비오틴화 시약을 위해, 모노-비오틴화 및 및 다중 비오틴화 콘쥬게이트 모두를 생성하였고 결과를 표 3 에 제시한다.
표 3
HCV
코어 항원 실험
어세이의
성능에 대한 PEG-링커 길이의 영향
표 3 으로부터 볼 수 있듯이, 신호-대-노이즈 비 (S/N) 를 통해 제시되는 바와 같은 매우 양호한 결과가 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 링커로 달성되었다. 비오틴-PEG24-NHS 비오틴화 시약의 사용에 의해 발생된 변형은 최적의 신호 대 노이즈 비의 종류를 보여주는 경향이 있었다. 그러나, 표 3 으로부터 명백하듯이, 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 링커는, 시험되고 양호한 결과를 산출하는 더 짧은 링커 뿐 아니라 더 긴 링커에 비해서 꽤 우수하다.
Claims (15)
- 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이 중의 분석물의 측정 방법으로서 (상기 마이크로입자는 결합 쌍의 제 1 파트너로 코팅됨), 방법은
a) 코팅된 마이크로입자, 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 분석물-특이적 결합제, 및 분석물을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 혼합함으로써
(상기 결합 쌍의 제 2 파트너는 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위 (PEG 12 내지 30) 를 포함하는 링커를 통해 상기 분석물-특이적 결합제에 결함됨), 분석물을 분석물-특이적 결합제를 통해 코팅된 마이크로입자에 결합시키고,
b) 결합 쌍을 통해 결합된 분석물 및 분석물-특이적 결합제를 포함하는 마이크로입자를 혼합물로부터 분리하고,
c) 마이크로입자에 결합된 분석물을 측정하는 것을 포함하는, 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이 중의 분석물의 측정 방법. - 제 1 항에 있어서, 상기 마이크로입자의 직경이 50 ㎚ 내지 20 ㎛ 인, 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이 중의 분석물의 측정 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 마이크로입자가 상자성이고, 단계 1(b) 에서의 분리가 자기력에 의한 것인, 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이 중의 분석물의 측정 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물-특이적 결합제가 적어도 50 개 아미노산의 폴리펩티드인, 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이 중의 분석물의 측정 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물-특이적 결합제가 최대 10,000 개 아미노산의 폴리펩티드인, 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이 중의 분석물의 측정 방법.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물-특이적 결합제가 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이 중의 분석물의 측정 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물이 경쟁적 어세이 포맷에서 측정되는, 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이 중의 분석물의 측정 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물이 샌드위치 어세이 포맷에서 측정되는, 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이 중의 분석물의 측정 방법.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로입자에 결합된 분석물의 상기 측정이 전기화학발광 표지의 사용에 기반하는, 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이 중의 분석물의 측정 방법.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 쌍의 제 1 파트너가 아비딘 및/또는 스트렙타비딘, 및 FimG, 각각으로부터 선택되고, 상기 결합 쌍의 제 2 파트너가 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴 및 DsF, 각각으로부터 선택되는, 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이 중의 분석물의 측정 방법.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 쌍의 제 1 파트너가 아비딘 및/또는 스트렙타비딘이고, 상기 결합 쌍의 제 2 파트너가 비오틴인, 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이 중의 분석물의 측정 방법.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 상기 콘쥬게이션된 특이적 결합제가, 분석물-특이적 결합제에 결합된 결합 쌍의 제 2 파트너 사이의 평균 몰 비가 1.1 이상인 조성물에 포함되는, 마이크로입자-기반 분석물-특이적 결합 어세이 중의 분석물의 측정 방법.
- 단일 용기 유닛의 별도의 용기 또는 분리된 구획에 결합 쌍의 제 1 파트너로 코팅된 적어도 마이크로입자 및 상기 결합 쌍의 제 2 파트너에 결합된 분석물-특이적 결합제를 포함하는 키트로서, 상기 결합 쌍의 상기 제 2 파트너가 12 내지 30 개의 에틸렌 글리콜 단위 (PEG 12 내지 30) 를 포함하는 링커를 통해 상기 분석물-특이적 결합제에 결합되는 키트.
- 제 13 항에 있어서, 상기 결합 쌍의 제 1 파트너가 아비딘 또는 스트렙타비딘이고, 상기 결합 쌍의 상기 제 2 파트너가 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴으로부터 선택되는 키트.
- 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 단일 용기 유닛의 별도의 용기 또는 분리된 구획에 검출가능하게 표지된 제 2 분석물-특이적 결합제를 추가로 포함하는 키트.
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