JP2017509897A - 多重分析法を実行するための対照 - Google Patents
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Abstract
Description
分析する試料は、好ましくは生体試料である。
試料で検出される分析物は、試料で検出および/または数量化しようとする天然または合成の任意のタイプの化合物であってもよい。
− ウイルス、例えばHIV(ヒト免疫不全ウイルス)、特にHIV−1またはHIV−2、HBV(B型肝炎ウイルス)、HCV(C型肝炎ウイルス)、HPV(ヒト乳頭腫ウイルス)、HTLV(ヒトTリンパ親和性ウイルス)、特にHTLV−IまたはHTLV−II、
− 寄生虫、例えばヒトまたはヒト以外の動物でトキソプラズマ症(特にトキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii))、マラリア(特にプラスモディウム属の寄生虫、例えば熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、卵形マラリア原虫(Plasmodium ovale)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)またはプラスモディウム・ノウレシ(Plasmodium knowlesi))またはシャガス病(特にクルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi))を引き起こすことができる寄生虫、または
− 細菌、例えばヒトまたはヒト以外の動物で梅毒(梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum))またはライム病(特にボレリア属からの細菌)を引き起こすことができる細菌
の1つまたはいくつかの抗原および/または1つまたはいくつかの抗体を含むことができる。
本明細書では、「対照化合物」は、分析する試料中に、好ましくは同じ性質の試料の全てで検出可能な濃度で天然に存在する化合物を指す。
添加剤は、試料中に存在しない、すなわち試料中に最初から存在しないか、または試料中に最初から存在する化合物に由来しない化合物または化合物のセットである。
捕捉リガンドは、固体支持体に、特にビーズのスポットまたは表面に固定された化合物である。
検出リガンドは、それが特異的である化合物の存在を明らかにすることを目的とする。
検出マーカーは、直接マーカーまたは間接マーカーであってもよい。
発色ステップ(複数可)は、検出マーカー(複数可)によって生成されるシグナルの検出に対応する。
本発明による分析方法を実行するために用いられる支持体(複数可)は、固体支持体である。
本発明は、少なくとも1つの対照スポットおよび分析物に対する少なくとも2つの検出スポットを含む少なくとも1つのコンパートメントを含む、少なくとも1つの試料の多重分析に適切な固体支持体であって、前記対照スポットは、試料の沈着を対照するためのスポット、分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのスポットおよびレポーターの沈着を対照するためのスポットからなる群から選択されることを特徴とする固体支持体に特に関する。
固体支持体がビーズである場合は、試料のための多重分析方法はビーズのセットで行われる。
− 炭素原子数1からzの、直鎖状または分枝状の(置換されたまたは無置換の)アルキル鎖、zは好ましくは1から20の整数である、
− 炭素原子数2からzの、直鎖状または分枝状のアルケニル鎖、zは好ましくは1から20の整数である、または
− アリール基)、
アルコール官能基(−OH)、カルボキシル官能基(−COOH)、イソシアネート官能基(−NCO)、チオール官能基(SH)またはエポキシ官能基からなる群から選択することができる。−COOHカルボキシル官能基をポリオレフィンに導入するために最も一般的に用いられる単量体は、アクリル酸またはメタクリル酸である。
試料の沈着の対照は、試料が固体支持体のコンパートメントのスポットの存在下に、またはビーズのセットと置かれたことを検証することを可能にする。
分析物の検出リガンドの沈着の対照は、添加剤の検出リガンドと同時に沈着した1つまたはいくつかの分析物検出リガンド(複数可)および/または添加剤と同時に沈着した1つまたはいくつかの分析物検出リガンド(複数可)が、固体支持体のコンパートメントのスポットまたはビーズのセットの存在下に置かれたことを検証することを可能にする。
− 本発明による分析方法の実行の間に試料の沈着対照の捕捉リガンドに固定される対照化合物は、前記対照化合物の特異的検出リガンドによって検出され(サンドイッチタイプの免疫学的フォーマット)、
− 分析方法の実行の間に分析物の検出リガンドの沈着対照の捕捉リガンドに固定される添加剤は、前記添加剤の特異的検出リガンドによって検出される(サンドイッチタイプの免疫学的フォーマット)。
レポーターの沈着の対照は、検出マーカーレポーターが固体支持体のコンパートメントのスポットまたはビーズのセットの存在下に置かれたことを検証することを可能にする。
したがって、本発明は、少なくとも1つの試料中の少なくともn個の分析物を検出するための多重分析方法であって、nは2以上の整数であり、前記方法は、
a)上で規定される少なくとも1つのコンパートメントを含む少なくとも1つの固体支持体、または上で規定されるビーズの少なくとも1つのセットを用意するステップ、
b)前記コンパートメントのスポットまたは前記ビーズのセットの存在下に、検出するp個の分析物のl個の検出リガンド、および適用可能であれば少なくとも1つの添加剤を置くステップであって、lは好ましくはp以上である、ステップ、
c)分析する試料を前記コンパートメントのスポット(複数可)または前記ビーズのセットの存在下に置くステップ、
d)前記コンパートメントのスポットまたは前記ビーズのセットの存在下に:
検出するm個の分析物のl’個の検出リガンド、および適用可能であれば、前記添加剤(複数可)の少なくとも1つの検出リガンドを置くステップであって、l’は好ましくはm以上である、ステップ、
e)前記コンパートメントのスポットまたは前記ビーズのセットの存在下に:
対照化合物の少なくとも1つの検出リガンドおよび検出するy個の分析物のl’’個の検出リガンドを置くステップであって、l’’は好ましくはy以上である、ステップ、
f)任意選択で少なくとも1つのレポーターを前記コンパートメントのスポットまたは前記ビーズのセットの存在下に置くステップ、
g)任意選択で、特にステップfの前記レポーターまたは前記レポーターの1つがマーカー、特に間接マーカー(例えば、酵素)に結合する場合に、ステップf)のレポーターに結合した前記マーカーの少なくとも1つの第2のレポーター(例えば、基質、例えばルミノール、イソルミノールまたはそれらの誘導体の1つ)を前記コンパートメントのスポットまたは前記ビーズのセットの存在下に置くステップ
のうち、少なくともステップa)、c)およびe)、少なくともステップa)、c)およびf)、または少なくともステップa)、b)、c)およびd)を含み、
l、l’、l’’、m、pおよびyは0以上の整数であり、m+p+yの合計は1以上である、多重分析方法に関する。
− 少なくともX個のコンパートメントを含む固体支持体または固体支持体の全てで少なくともX個のコンパートメントを有するようないくつかの固体支持体(例えば、固体支持体が1つのコンパートメントだけを含み、それが、特定の一実施形態では固体支持体自体に擬すことができて少なくともX個の固体支持体を提供する場合)、または
− ビーズの少なくともX個のセット
を提供することからなる。
実際、試料を分析物の検出リガンドの存在下に同時に置くことは有利である可能性があり、それは、分析物が分析物の捕捉抗体に既に結合している場合より、それらが特異的である分析物と溶液中でより良好に相互作用する。
− 分析物の検出リガンドの沈着の少なくとも2つの対照が用いられる場合は少なくとも2つのステップb)および少なくとも2つのステップd)、
− 試料の沈着の少なくとも2つの対照が用いられる場合は少なくとも2つのステップf)、および/または
− レポーターの沈着の少なくとも2つの対照が用いられる場合は少なくとも2つのステップf)
を含むこともできる。
本発明は、試料の多重分析を確実にするための、試料の沈着の少なくとも1つの対照、および/または分析物の検出リガンドの沈着の少なくとも1つの対照の使用にも関する。
「液体チップ」方法
原理
この実施例に記載される2つの対照は、
− SDC(「試料沈着対照」または「試料の沈着の対照」):試料さらにステップ2(コンジュゲート2の沈着、すなわちステップ2で沈着した検出リガンド)およびステップ3)(S−PEレポーターの沈着:フィコエリトリンに結合したストレプトアビジン)の沈着、ならびに
− PVC(「プロセス検証対照」または「分析物の検出リガンドの沈着の対照」):ステップ1(コンジュゲート1の沈着、すなわちステップ1で沈着した検出リガンド)、さらにステップ2(コンジュゲート2の沈着、この実施例で例示されていないので点線で示す)およびステップ3)(S−PEレポーターの沈着)の沈着
について検証することを可能にする(表1を参照)。
(i)分析システム
BioPlex 200(登録商標)アナライザー(Bio−Rad、Marnes−la−Coquette、France)を、製造業者の使用説明書に従って用いる。この免疫分析機はフローサイトメーターおよびLuminex 100(商標)検出器(Luminex Corp.、Austin、Texas、United States)を有し、超常磁性粒子の不均一なセットを用いる。直径8μmのサイズを有する粒子の各均一な群、ポリスチレン化合物およびメタクリル酸(COOH官能基)は、異なる百分率の蛍光色素(CL1およびCL2)で製造されており、粒子の各群に割り当てられてLuminex 100(商標)検出器(Luminex Corp.、Austin、Texas、United States)のレーザーによって検出可能である、特異な識別コードを生成する。免疫学的反応の後、1セットのビーズは液体シースの中心のフローセルを1個ずつ通り、同時に励起され、2つの別々のレーザーで読み取られる。測定は、各ビーズの通過と同時に実行される。
6つの別々の群のLuminex(商標)超常磁性粒子(Luminex Corp.、Austin、Texas、United States)を含むビーズのセットを用いる。ビーズのこのセットは、試料の沈着を対照するための一群のビーズ(SDCビーズ)、分析物の検出リガンドの沈着を対照するための一群のビーズ(PVCビーズ)および分析物を検出するための4群のビーズ(分析する分析物:A1、A2、A3およびA4)を含む。
対照化合物(SDC対照)の検出リガンド、pAb−抗Tf−biotは、当業者にそれ自体公知であるヘテロ二官能基試薬を用いてビオチン(Thermo Scientific、France)に結合されている抗トランスフェリンヒツジポリクローナル抗体(Bio−Rad、Barnes la Coquette、France)である。
BSA−DIG添加剤は、当業者にそれ自体公知であるヘテロ二官能基試薬を用いて担体分子、この実施例ではウシ血清アルブミン(Millipore、France)に接がれたジゴキシゲニン(Sigma、France)である。
S−PEレポーターは、当業者にそれ自体公知であるヘテロ二官能基試薬を用いてフィコエリトリン(Cyanotech、Hawaii、United States)に結合されているストレプトアビジン(Roche、Germany)である。
vi.1.超常磁性粒子の希釈剤
NaCl 150mM、EDTA 20mM、10%のウシ血清アルブミン、500μg/mLのマウスIgG(Meridian、United States)、0.10%のオクチル−n−グルコシド、0.095%のNaN3を含有するトリス緩衝液50mM、pH7.5。
vi.2.コンジュゲート1の希釈剤
NaCl 150mM、EDTA 20mM、Chaps 0.1%、グリセロール10%、0.095%のNaN3を含有するトリス緩衝液50mM、pH7.5。
vi.3.コンジュゲート2の希釈剤
NaCl 150mM、EDTA 5.6mM、1%のウシ血清アルブミン、2%のTriton、10%のヒツジ血清、500μg/mLのマウスIgG(Meridian、United States)、0.5%のProclin 300(商標)(Supelco社の商標)、15%の牛乳(100%スキム)、グリセロール10%、0.095%のNaN3を含有するクエン酸緩衝液50mM、pH6.7。
vi.4.S−PEレポーターの希釈剤
NaCl 150mM、0.1%のTween 20(商標)(Sigma社の商標)、0.5%のProclin 300(商標)(Supelco社の商標)、PEG 6000 2.75%、ウシ血清アルブミン1%、正常なヒツジ血清1%、0.095%のNaN3を含有するリン酸緩衝液、pH7.4。
vi.5.洗浄溶液
NaCl 218mM、0.1%のTween 20(商標)(Sigma社の商標)、0.002%のProclin 300(商標)(Supelco社の商標)を含有するトリス10mM緩衝液、pH7.4。
免疫反応は、1ウェルにつき355μLの最大容量を有するポリプロピレンから作製された96ウェルマイクロプレートのウェルで起こる。
用いた陰性試料(血清または血漿)は、Lilleのフランス血液機関から来る。
多重フォーマット試験プロトコールは4つの異なる分析物を分析することを含み、分析物A1およびA2のアッセイは1つの免疫時間で実行され、分析物A3およびA4のアッセイは2つの免疫時間で実行される。
1.マイクロプレートの各ウェルに、
+100μLの試料
+以下を含有するコンジュゲート1の25μlの希釈剤:
±BSA−DIG
±分析物A1およびA2の検出リガンド
+25μLの免疫反応性超常磁性粒子(粒子の混合物、ビーズのタイプにつき1.2μg:SDC、PVC±分析する分析物のビーズ)
が連続して分配される。
2.撹拌しながら混合物を37℃で40分間インキュベートする。
3.以下の洗浄ステップを実行する:磁化による固相と液相の分離および少なくとも300μlの洗浄液による3回の連続洗浄。最後の洗浄で、粒子は懸濁状態に戻される。
4.各反応ウェルに、
±pAb−抗Tf−biot対照化合物の検出リガンド
±pAb−抗DIG−biot添加剤の検出リガンド
±分析物A3およびA4の検出リガンド
を含有するコンジュゲート2の90μlの希釈剤が分配される。
5.撹拌しながら混合物を37℃で15分間インキュベートする。
6.洗浄ステップ(同上のポイント3)を実行する。
7.各反応ウェルに90μLのS−PEレポーターが分配される。
8.撹拌しながら混合物を37℃で15分間インキュベートする。
9.洗浄ステップ(同上のポイント3)を実行する。
10.120μLの洗浄液を添加している間に各反応ウェルで粒子を懸濁状態に戻し、次にマイクロプレートを撹拌する。
11.各ウェルの粒子の懸濁液を、フローサイトメーターによって吸引する。
12.各ウェルの粒子の懸濁液を、2つのレーザー光線を用いて読み取る。
13.読み取りの結果をフローサイトメーターによって直接的に処理し、相対蛍光強度(RFI)単位で記録する。
14.結果を解釈するために、各試料について閾値(「カットオフ」)に対する比を計算する。
試料のSDC比を以下の通りに計算する:
(i)単純フォーマットのSDCシステム
このシステムでは、分析物A1からA4の検出ビーズおよびそれらの検出リガンドは用いられない。
多重フォーマット(MPX)のSDCシステムでは、分析物A1からA4の検出ビーズおよび対応する検出リガンドが用いられる。
前と同様に、このフォーマットでは、分析物A1からA4の検出ビーズおよび対応する検出リガンドは用いられない。
多重フォーマットのPVCシステムでは、分析物A1からA4の検出ビーズおよび対応する検出リガンドが用いられる。
スポッティング方法
材料および方法
この実施例に記載される3つの対照は、
− SDC(「試料沈着対照」または「試料の沈着の対照」):試料、さらにステップ2(コンジュゲート2の沈着)、ステップ3(S−PODレポーターの沈着)およびステップ4(ルミノール基質の沈着)の沈着、
− PVC(「プロセス検証対照」または「分析物の検出リガンドの沈着の対照」):ステップ1(添加剤の沈着およびコンジュゲート1の沈着)、ステップ3(S−PODレポーターの沈着)およびステップ4(ルミノール基質の沈着)の沈着、ならびに
− RVC(「暴露検証対照」または「レポーターの沈着の対照」):ステップ3(S−PODレポーターの沈着)およびステップ4(ルミノール基質の沈着)の両方を対照することによる暴露ステップ
について検証することを可能にする(表8を参照)。
(i)分析システム
このシステムのために用いられる技術は、バイオチップ多重技術の革新的なナノスポッティング(下の定義を参照)であり、発色は、ホースラディッシュペルオキシダーゼの酵素によってマーキングされ、ルミノールタイプの基質によって発色されるレポーターのおかげで、化学発光による。
異なる対照スポットは
− 50μg/mLで固定化されたトランスフェリンの可溶性抗受容体マウスモノクローナル抗体(Fitzgerald、United States)を含むSDCスポット、
− 25μg/mLで固定化された可溶性抗ジゴキシゲニンマウスモノクローナル抗体(Covalab、France)を含むPVCスポット、および
− 当業者にそれ自体公知であるヘテロ二官能基試薬を用いてビオチン(Thermo Scientific、France)に結合され、1μg/mLで固定化された、抗KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)マウスモノクローナル抗体(Genway、United States)を含むRVCスポット
である。
対照化合物(SDC対照に対して)の検出リガンド、pAb−抗Tf−biotは、当業者にそれ自体公知であるヘテロ二官能基試薬を用いてビオチン(Thermo Scientific、France)に結合されている抗トランスフェリンヒツジポリクローナル抗体(Bio−Rad、Barnes la Coquette、France)である。
BSA−DIG添加剤は、担体分子、この実施例ではウシ血清アルブミン(Millipore、France)に接がれたジゴキシゲニン(Sigma、France)である。結合は、当業者にそれ自体公知であるヘテロ二官能基試薬を用いて実行される。
S−PODレポーターは、P. Nakane and A. Kawaoi (J Histochem Cytochem (1974) Vol. 22, No. 12. pp. 1084-1091)に記載される方法によってペルオキシダーゼ(Roche Germany)に結合された、当業者にそれ自体公知であるストレプトアビジン(Roche、Germany)である。
a)添加剤の希釈剤
NaCl 150mM、EDTA 20mM、500μg/mLのマウスIgG(Meridian、United States)、15%の牛乳(100%スキム)、10%のヒツジ血清、0.095%のNaN3を含有するトリス緩衝液50mM、pH7.5。
b)コンジュゲート1の希釈剤
NaCl 150mM、EDTA 20mM、Chaps 0.1%、グリセロール10%、0.095%のNaN3を含有するトリス緩衝液50mM、pH7.5。
c)コンジュゲート2の希釈剤
NaCl 150mM、EDTA 5.6mM、2%のTriton、10%のヒツジ血清、500μg/mLのマウスIgG、0.5%のProclin 300(商標)(Supelco社の商標)、15%の牛乳(100%スキム)、グリセロール10%、0.095%のNaN3を含有するクエン酸緩衝液50mM、pH6.7。
d)S−PODレポーターの希釈剤
NaCl 2053mM、0.5%のTween 20(商標)(Sigma社の商標)、0.5%のProclin 300(商標)(Supelco社の商標)、7%の牛乳(100%スキム)、グリセロール20%を含有するクエン酸緩衝液50mM、pH6.7。
e)洗浄液
NaCl 218mM、0.1%のTween 20(商標)(Sigma社の商標)、0.002%のProclin 300(商標)(Supelco社の商標)を含有するトリス10mM緩衝液、pH7.4。
f)発色基質
ELISTAR ETA C Ultra ELISA用発色基質(Cyanagen、Italy)は、2つの溶液:XLSE024Lルミノールエンハンサー溶液(A)およびXLSE024Pペルオキシド溶液(B)で構成される。
免疫反応は、1ウェルにつき392μLの最大容量を有するポリスチレンから作製された96ウェルマイクロプレートで起こる。
用いた陰性試料(血清または血漿)は、Lilleのフランス血液機関から来る。
試験プロトコールは、以下のステップを含む。
ステップ1:
1.マイクロプレートの各ウェル(スポットを含む)に、
+BSA−DIG添加剤を含有する添加剤の20μlの希釈剤、
+以下を含有するコンジュゲート1の20μlの希釈剤:
+mAb−抗DIG−biot添加剤の検出リガンド、および
+分析する分析物1、2および3の検出リガンド
+40μlの試料
が連続して分配される。
2.撹拌しながら混合物を37℃で40分間インキュベートする。
3.少なくとも400μlの洗浄液による3回の連続洗浄を実行する。
4.各反応ウェルに、
+pAb−抗Tf−biot対照化合物の検出リガンド、
+分析する分析物4および5の検出リガンド
を含有するコンジュゲート2の50μlの希釈剤が分配される。
5.撹拌しながら混合物を37℃で15分間インキュベートする。
6.洗浄ステップ(同上のポイント3)を実行する。
7.各反応ウェルに50μLのS−PODレポーターが分配される。
8.撹拌しながら混合物を37℃で15分間インキュベートする。
9.各反応ウェルに25μLの発色溶液「B」を分配する。
10.各反応ウェルに25μLの発色溶液「A」を分配する。
10.撹拌しながら混合物を37℃で1分間インキュベートする。
11.発光シグナルの獲得を、180秒間実行する。
12.読み取りの結果を画像分析システムによって直接的に処理し、相対光単位(RLU)で記録する。
13.結果を解釈するために、各試料について閾値(または「カットオフ」)に対する比を計算する。
2つの分析モードを下に例示する:
分析モード1:単一の閾値
試料のSDC比を以下の通りに計算する:
試料の2つのSDC比を以下の通りに計算する:
この実施例に記載される多重方式は、分析する5つの分析物、3つの分析物はその検出リガンドがステップ1で添加され(A1、A2およびA3)、2つの分析物はその検出リガンドがステップ2で添加され(A4およびA5)、ならびに3つのSDC、PVCおよびRVC対照を含む。
− ケース1=試料の沈着がない。
− ケース2=添加剤の沈着がない。
− ケース3=コンジュゲート1の沈着がない。
− ケース4=コンジュゲート2の沈着がない。
− ケース5=S−PODの沈着がない。
− ケース6=ルミノールの沈着がない。
ケース1および4は1未満のSDC比をもたらし、それはこれらのランクを下げた方法からの測定を無効にすることを可能にする。
ケース2および3は1未満のPVC比をもたらし、それはこれらのランクを下げた方法からの測定を無効にすることを可能にする。
ケース5および6は1未満のSDC、PVCおよびRVC比をもたらし、それはこれらのランクを下げた方法からの測定を無効にすることを可能にする。RVCシグナルは、発色ステップ(S−POD沈着およびルミノール沈着)を特異的に無効にすることを可能にする。しかし、1未満のRVC比による手法の無効化は、SDCおよびPVC対照の系統的なシグナルの不在を暗示する(表9の灰色ゾーンを参照)。この場合、試料およびコンジュゲート2の沈着(SDCによって対照される沈着)かまたは添加剤およびコンジュゲート1の沈着(PVCによって対照される沈着)が正しく起こったか判定することができない。
ケース1および4は1未満のSVC(閾値−)比をもたらし、それはこれらのランクを下げた方法からの測定を無効にすることを可能にする。ケース1に加えて、PVC(閾値+)比は1を超え、それはPVC対照に及ぼす試料の不在の間接的な影響を反映する。
ケース2および3は1未満のPVC(閾値−)比をもたらし、それはこれらのランクを下げた方法からの測定を無効にすることを可能にする。
ケース5および6は1未満のSDC、PVCおよびRVC(閾値−)比をもたらし、それはこれらのランクを下げた方法からの測定を無効にすることを可能にする。RVCシグナルは、発色ステップ(S−POD沈着およびルミノール沈着)を特異的に無効にすることを可能にする。しかし、1未満のRVC(閾値−)比による手法の無効化は、SDCおよびPVC対照の系統的なシグナルの不在を暗示する(表9の灰色ゾーンを参照)。この場合、試料およびコンジュゲート2の沈着(SDCによって対照される沈着)かまたは添加剤およびコンジュゲート1の沈着(PVCによって対照される沈着)が正しく起こったか判定することができない。
Claims (13)
- 少なくとも1つの対照スポットおよび分析物に対する少なくとも2つの検出スポットを含む少なくとも1つのコンパートメントを含む、少なくとも1つの試料の多重分析に適切な固体支持体であって、前記対照スポットは、試料の沈着を対照するためのスポット、分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのスポットおよびレポーターの沈着を対照するためのスポットからなる群から選択されることを特徴とする固体支持体。
- 前記対照スポットまたは複数の前記対照スポットの1つが、試料の沈着を対照するためのスポットまたは分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのスポットであることを特徴とする、請求項1に記載の固体支持体。
- 前記コンパートメントが、レポーターの沈着を対照するための少なくとも1つのスポットを含むことを特徴とする、請求項2に記載の固体支持体。
- 前記コンパートメントが、試料の沈着を対照するための少なくとも1つのスポットおよび分析物の検出リガンドの沈着を対照するための少なくとも1つのスポットを含むことを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 試料の沈着を対照するための前記スポットが、対照化合物の少なくとも1つの捕捉リガンドを含むことを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 分析物の検出リガンドの沈着を対照するための前記スポットが、添加剤の少なくとも1つの捕捉リガンドを含むことを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の固体支持体。
- レポーターの沈着を対照するための前記スポットが、間接マーカーまたは間接マーカーに結合した担体分子を含むことを特徴とする、請求項1または3から6のいずれか一項に記載の固体支持体。
- 少なくとも1つの対照ビーズおよび分析物に対する少なくとも2つの検出ビーズを含む、試料の多重分析に適切なビーズのセットであって、前記対照ビーズは、試料の沈着を対照するためのビーズ、分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのビーズおよびレポーターの沈着を対照するためのビーズからなる群から選択されることを特徴とするビーズのセット。
- 試料の沈着を対照するための少なくとも1つのビーズ、分析物の検出リガンドの沈着を対照するための少なくとも1つのビーズおよび任意選択でレポーターの沈着を対照するための少なくとも1つのビーズを含む、請求項8に記載のビーズのセット。
- 少なくとも1つの試料中の少なくともn個の分析物を検出するための多重分析方法であって、nは2以上の整数であり、前記方法は、
a)請求項1から7のいずれか一項に記載の少なくとも1つのコンパートメントを含む少なくとも1つの固体支持体、または請求項8または9に記載のビーズの少なくとも1つのセットを用意するステップ、
b)前記コンパートメントの前記スポットまたは前記ビーズのセットの存在下に、検出するp個の分析物のl個の検出リガンド、および適用可能であれば少なくとも1つの添加剤を置くステップであって、lは好ましくはp以上である、ステップ、
c)分析する試料を前記コンパートメントの前記スポットまたは前記ビーズのセットの存在下に置くステップ、
d)前記コンパートメントの前記スポットまたは前記ビーズのセットの存在下に、
検出するm個の分析物のl’個の検出リガンド、および適用可能であれば、前記添加剤(複数可)の少なくとも1つの検出リガンドを置くステップであって、l’は好ましくはm以上である、ステップ、
e)前記コンパートメントの前記スポットまたは前記ビーズのセットの存在下に、
対照化合物の少なくとも1つの検出リガンドおよび検出するy個の分析物のl’’個の検出リガンドを置くステップであって、l’’は好ましくはy以上である、ステップ
のうち、少なくともステップa)、c)およびe)または少なくともステップa)、b)、c)およびd)を含み、
l、l’、l’’、m、pおよびyは0以上の整数であり、m+p+yの合計は1以上である、多重分析方法。 - 少なくとも1つのレポーターを前記コンパートメントの前記スポットまたは前記ビーズのセットの存在下に置くことからなる後続のステップf)を含む、請求項10に記載の多重分析方法。
- ステップf)の前記レポーターまたは前記レポーターの少なくとも1つが間接マーカー、例えば酵素に結合していること、および前記方法が、ステップf)の前記レポーターに結合した前記間接マーカーの少なくとも1つの第2のレポーターを、前記コンパートメントの前記スポットまたは前記ビーズのセットの存在下に置くことからなる後続のステップg)を含み、前記第2のレポーターが、例えば、好ましくはルミノール、イソルミノールまたはそれらの誘導体の1つの中から選択される基質であることを特徴とする、請求項11に記載の多重分析方法。
- 試料の多重分析を確実にするための、試料の沈着の少なくとも1つの対照、および/または分析物の検出リガンドの沈着の少なくとも1つの対照、および/またはレポーターの沈着の少なくとも1つの対照の使用。
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