KR20140007449A

KR20140007449A - 심근 트로포닌의 측정법

Info

Publication number: KR20140007449A
Application number: KR1020137025027A
Authority: KR
Inventors: 요시카즈 오카무라
Original assignee: 미쓰비시 가가쿠 메디엔스 가부시키가이샤
Priority date: 2011-02-25
Filing date: 2012-02-24
Publication date: 2014-01-17
Also published as: KR101975993B1; US20130330841A1; CN103380377B; EP2679997A1; US10634681B2; JP5864530B2; EP2679997A4; EP2679997B1; JPWO2012115221A1; WO2012115221A1; CN103380377A

Abstract

심근 트로포닌과 그것에 특이적으로 결합하는 항체와 면역 복합체의 형성을 4 mmol/L 이상의 2가 양이온의 존재하에서 실시하는, 생체 시료 중의 심근 트로포닌을 면역학적으로 측정하는 방법 및, 심근 트로포닌에 특이적으로 결합하는 항체와 고농도의 2가 양이온을 함유하는 완충액을 포함한 심근 트로포닌 측정 키트를 개시한다. 상기 방법 또는 키트에 의하면, 검체의 종류에 관계없이 시료 중 간섭 물질의 영향을 받지 않고 안정적이고 고정밀도의 측정값을 얻을 수 있다.

Description

심근 트로포닌의 측정법{Method for measuring myocardial troponin}

본 발명은 검체 중의 심근 트로포닌의 고정밀도 측정 방법 및 키트에 관한 것이다.

트로포닌은 3 개의 단백질, 트로포닌 I, 트로포닌 T 및 트로포닌 C로 이루어진 근육 원섬유 단백질 복합체인 것으로 알려져 있고, 미오신 및 액틴과 상호 작용함에 의해, 칼슘 이온에 의한 근육 수축의 조절에 기여하고 있다. 상세하게는, 임펄스가 근육 내의 운동 종판(終板)의 레벨에 도달하여 활동 전위가 생성되고, 근육 소포체에 전달된다. 그리고, 칼슘 이온이 세포질 졸(ゾル)에 방출되어, 트로포닌 C에 결합한다. 이것은 트로포닌 I와 트로포닌 C의 상호 작용을 강화시키는 것으로, 트로포닌 I, T, C 복합체의 콘포메이션(コンホメ-ション)의 변화가 일어나서, 액틴 -미오신의 상호 작용으로 근육 수축 운동을 가능하게 하고 있다.

심근이 비가역적으로 손상되면, 방출된 심근 트로포닌이 혈류 중에 출현한다. 혈액 중에서는, 심근 트로포닌 I, 심근 트로포닌 C 및 심근 트로포닌 T의 3 개의 서브 유니트가 단독 또는 2 개 또는 3 개의 다른 서브 유니트로 구성된 복합체 (심근 트로포닌)를 형성하여 존재한다.

각종 심근 트로포닌을 평가하기 위해, 혈액 시료(혈청, 혈장 또는 전혈)가 통상 사용된다. 그러나, 이 선택은 사용 방법에 따라서 제한될 수 있다. 예를 들면, 혈청은 심근 트로포닌의 신속한 평가를 위한 방법으로 부적절한 생물학적 시료인 것, 또는 전혈은 정량적 분석(アッセイ)의 실시를 곤란하게 하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 헤파린 가혈장(ヘパリン加血漿) 또는 헤파린 가전혈(ヘパリン加全血)을 이용하여 실시하는 면역학적 측정에 있어서, 사용하는 방법의 성능이 매우 높은 경우에서도, 신뢰성이 부족한 결과를 종종 얻을 수 있다. 일반적으로, 혈장 중의 심근 트로포닌 농도가 그다지 높지 않은 경우, 이 문제를 만난다(비특허 문헌 1). 실제, 혈액 시료 중의 헤파린의 존재가 여러 가지 면역학적 측정 사이에 간섭하여 측정 결과에 영향을 주어, 그것에 의해 의사가 임상 진단을 수식(修飾)할 수 있음이 알려져 있다.

항응고제로서 EDTA 채혈관도 잘 이용되지만, EDTA 가혈장(加血漿) 또는 EDTA 가전혈(加全血)에 대해서도, 신뢰성이 높지 않은 결과를 줄 수 있다. 일반적으로, 혈장 중의 심근 트로포닌 I는 칼슘 이온의 존재 하에서, 심근 트로포닌 C나 심근 트로포닌 T와 복합체를 형성하고 있다. 그러나 EDTA의 존재하에서는 칼슘 이온이 킬레이트되어 버리기 때문에, 심근 트로포닌 I를 포함하는 복합체가 분해되어 버린다. 그 때문에, EDTA 가혈장 또는 EDTA 가전혈은 심근 트로포닌 I의 혈중(血中) 존재 양식의 변화에 따라, 면역학적 측정에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (비특허 문헌 2).

지금까지 심근 트로포닌 분석에서 검체 중의 간섭 물질의 영향을 회피하는 방법에 관해서, 헤파린 함유 생물학적 시료에 대해 헥사 디메트린 브로마이드 (폴리브렌)의 존재하에 실시되는 것을 특징으로 하는 면역학적 측정법이 개시되어 있다 (특허 문헌 1). 거기에서는, 헤파린에 기인하는 간섭을 회피하는 방법이며, EDTA에 대해서는 언급되어 있지 않다.

또한, 심근 트로포닌에 대해 2가 양이온을 첨가함에 의해, 심근 트로포닌 복합체의 안정화에 효과적인 것이 개시되어 있다(특허 문헌 2, 특허 문헌 3, 특허 문헌 4).

예를 들면, 특허 문헌 2는, 트로포닌 복합체의 안정 조성물의 완충액으로서 100 μmol/L ~ 100 mmol/L의 염화칼슘 또는 염화 마그네슘 농도를 함유하는 조성물을 들 수 있고, 바람직한 조성물로서는, 2 mmol/L 염화칼슘을 함유하고 있는 양태가 개시되어 있다 (단락 [0013]). 그러나, 특허 문헌 2에는, 트로포닌 분석시의 반응 액 중 (즉, 면역 복합체 형성시)의 염화칼슘 또는나 염화 마그네슘 관해서 농도의 기재는 없고, 따라서, 심근 트로포닌의 면역학적 측정의 반응액 중에서도 고농도를 유지하지 않으면 안되는 것, 또한 저농도 (예를 들면, 2 mmol/L)에서는, 검체의 종류에 따라, 정확한 값을 얻을 수 없는 경우가 있다는 것은 시사도 기재도 없다.

특허 문헌 3은, 안정화된 트로포닌 I의 바람직한 조성물로서, 염화칼슘이나 염화 마그네슘의 농도가 0.01 mmol/L ~ 10 mmol/L 인 것이 기재되어 있다. 또한 실시예 14에는 항원 항체 반응을 실시하기 전에 혈청 또는 혈장에 염화칼슘을 최종 농도 6 mmol/L가 되도록 첨가하여, 얻은 용액을 실온에서 2 시간 인큐베이트(インキュベ-ト)한 후, 4 ℃에서 하루 밤새 인큐베이트 하는 것, 이어서, 인큐베이트한 샘플을 무금속(無金屬) 분석 완충액으로, 희석 배수 2에서 최대 희석 배수 256으로 희석 공정이 개시되어 있다. 즉, 반응액 중에서는 약 3 mmol/L 이하의 염화 칼슘이 존재하게 된다. 그러나 심근 트로포닌의 면역학적 측정의 반응액 중에서도 고농도를 유지해야하는 것, 또한 저농도(예를 들면, 약 3 mmol/L)에서는, 검체의 종류에 따라, 정확한 값을 얻을 수 없는 경우가 있는 지의 시사도 개시도 없다. 즉, 특허 문헌 3의 실시예에서 사용되고 있는 트로포닌 분석 완충액 중의 염화 칼슘 농도는 2 mmol/L이다 (예를 들면, 실시예 10 ~ 12).

특허 문헌 4는, 트로포닌 복합체의 조제시의 완충액으로서, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온의 농도는 중요하지 않지만, 바람직하게는 약 20 μmol/L ~ 약 20 mmol/L이어야하며, 칼슘 및/또는 마그네슘의 대표적인 양은 약 2 ~ 5 mmol/L 인 것이 개시되어 있다. 또한 명확하지 않지만, 실시예 1 및 실시예 2에서, 복합체 조제용의 반응액 중에, 1 리터 당 약 225 밀리그램의 염화 칼슘 또는 1 ~ 3 mmol/L 칼슘 이온을 제공하기 위한 다른 칼슘염을 포함하는 것이 기재되어 있다. 그러나, 특허 문헌 4에는, 트로포닌 분석시 반응액 중의 염화칼슘 또는 염화 마그네슘에 관해서 농도의 기재는 없고, 심근 트로포닌의 면역학적 측정의 반응액 중에서도 고농도를 유지해야한다는 것, 또한 저농도 (예를 들면, 3 mmol/L)에서는, 검체의 종류에 따라, 정확한 값을 얻을 수 없는 경우가 있는 지의 시사도 기재도 없다.

이와 같이, 특허 문헌 2, 특허 문헌 3, 특허 문헌 4는, 염화칼슘이나 염화 마그네슘이, 트로포닌 복합체 함유 시료의 안정화를 위해 약 1 ~ 6 mmol/L의 농도로 첨가되는 것이 일반적인 것임을 개시한 것이며, 면역 반응 중의 측정값의 신뢰성을 향상시키는 것은 아니다.

특허 문헌 1: 특표 2002-502979호 공보 특허 문헌 2: 특개평 9-21804호 공보 특허 문헌 3: 특표평 11-505605호 공보 특허 문헌 4: 특표 2002-508839호 공보

비특허 문헌 1: P. O. Collison et al. , Ann. Cli. Biochem. (1995), 32, pp. 454-458 비특허 문헌 2: Morijana. N et al. , Biotechnol. Appl. Biochem. (2001), 33, 107-115

본 발명자들은, 후술하는 실시예에서도 상세히 서술하지만, 면역학적 수법에 의해 생체 시료 중의 심근 트로포닌을 측정하는 것을 시도했는데, 상기 생체 시료로부터 조제된 측정용의 검체의 종류가 다름에 의해, 측정값에 차이가 생기는 것을 발견했다.

본 발명은, 생체 시료 중의 심근 트로포닌을 검출하는 경우에, 다른 혈액 응고 조해제(阻害劑)를 사용함에 의해 전혈, 혈청, 혈장이라고 하는 검체의 종류에 관계없이, 검체 중의 간섭 물질의 영향을 받지 않고 안정적으로 고정밀도의 측정 값을 얻을 수 있는 측정 방법 및 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 상기와 같은 현상을 감안하여 예의 검토를 거듭한 결과, 생체 시료 중의 심근 트로포닌을 면역학적으로 측정하는 방법에 있어서, 반응액 중에 고농도의 2가 양이온이 첨가된 조건 하에서 상기 심근 트로포닌을 측정함에 의해, 검체의 종류에 관계없이, 검체 중의 간섭 물질의 영향을 받지 않고 안정적으로 고정밀도의 측정값을 얻는 것을 발견하여, 본 발명을 완성했다.

따라서, 본 발명은

(1) 생체 시료 중의 심근 트로포닌을 면역학적으로 측정하는 방법에 있어서, 심근 트로포닌과 그것에 특이적으로 결합하는 항체와의 면역 복합체의 형성을 4 mmol/L 이상의 2가 양이온의 존재하에서 실시하는 것을 특징으로하는, 상기 심근 트로포닌을 측정하는 방법,

(2) 생체 시료 중의 심근 트로포닌의 면역학적 측정에 있어서, 항응고제로서 EDTA를 첨가한 혈액 시료를 이용한 경우의 측정값과, 그것 이외의 혈액 시료를 이용한 경우의 측정값과의 괴리를 감소시키는 방법이며, 심근 트로포닌과 그것에 특이적으로 결합하는 항체와 면역 복합체의 형성을 2가 양이온의 존재 하에서 실시하는 것을 특징으로하는, 상기 방법,

(3) 상기 2가 양이온이, 칼슘 이온 또는 마그네슘 이온인, (1) 또는 (2)의 방법,

(4) 상기 2가 양이온을 검체 희석액 및/또는 항체 용액에 함유하는, (1) ~ (3) 중 어느 하나의 방법,

(5) 심근 트로포닌에 특이적으로 결합하는 제1 항체와 제2 항체를 접촉시켜, 항원 항체 반응에 의해 형성된 면역 복합체를 측정하는 (1) ~ (4) 중 어느 하나의 방법,

(6) 상기 제1 항체와 상기 제2 항체가, 다른 에피토프(エピト-プ)를 인식하는 항체인, (5)의 방법,

(7) (1) ~ (6)의 방법 중 어느 하나를 위한, 심근 트로포닌에 특이적으로 결합하는 항체와, 고농도의 2가 양이온을 함유하는 완충액을 포함하는, 상기 심근 트로포닌 측정 키트에 관한 것이다.

본 발명의 방법, 및 시약 키트를 이용하여, 생체 시료 중의 심근 트로포닌을, 검체의 종류에 관계없이, 시료 중의 간섭 물질의 영향을 받지 않고, 안정적으로 고정밀도로 잘 측정할 수 있다.

도 1은, 동일 정상인으로부터 얻은 혈청, 헤파린 가혈장, EDTA 가혈장에 심근 트로포닌 I가 첨가된 검체를, 제1 항체에 심근 트로포닌 I의 41 ~ 49 번째의 아미노산 서열을 인식하는 항체와, 제2 항체에 심근 트로포닌 I의 71 ~ 116 번째의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 이용하여, 염화칼슘 농도가 0 mmol/L, 3.3 mmol/L, 6.7 mmol/L, 10.0 mmol/L, 13.3 mmol/L, 16.7 mmol/L의 조건하에서, 각 검체를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 동일 정상인으로부터 얻은 혈청, 헤파린 가혈장, EDTA 가혈장에 심근 트로포닌 I가 첨가된 검체를, 제1 항체에 심근 트로포닌 I의 41 ~ 49 번째 아미노산 서열을 인식하는 항체와, 제2 항체에 심근 트로포닌 I의 71 ~ 116 번째의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 이용하여, 염화 마그네슘 농도가 0 mmol/L, 3.3 mmol/L, 6.7 mmol/L, 10.0 mmol/L, 13.3 mmol/L, 16.7 mmol/L의 조건하에서, 각 검체를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 동일 정상인으로부터 얻은 헤파린 가혈장, EDTA 가혈장에 심근 트로포닌 I가 첨가된 검체를, 제1 항체에 심근 트로포닌 I의 41 ~ 49 번째 아미노산 서열을 인식하는 항체와, 제2 항체에 심근 트로포닌 I의 21 ~ 30 번째 아미노산 서열을 인식하는 항체를 이용하여, 염화 마그네슘 농도가 0 mmol/L, 10.0 mmol/L, 16.7 mmol/L의 조건하에서, 각 검체를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 동일 정상인으로부터 얻은 헤파린 가혈장, EDTA 가혈장에 심근 트로포닌 I가 첨가된 검체를, 제1 항체에 심근 트로포닌 I의 41 ~ 49 번째 아미노산 서열을 인식하는 항체와, 제2 항체에 심근 트로포 닌 I의 24 ~ 40 번째 아미노산 서열을 인식하는 항체를 이용하여, 염화 마그네슘 농도가 0 mmol/L, 10.0 mmol/L, 16.7 mmol/L의 조건하에서, 각 검체를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 동일 정상인으로부터 얻은 헤파린 가혈장, EDTA 가혈장에 심근 트로포닌 I가 첨가된 검체를, 제1 항체에 심근 트로포닌 I의 41 ~ 49 번째 아미노산 서열을 인식하는 항체와, 제2 항체에 심근 트로포 닌 I의 71 ~ 116 번째의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 이용하여, 염화 마그네슘 농도가 0 mmol/L, 10.0 mmol/L, 16.7 mmol/L의 조건하에서, 각 검체를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 동일 정상인으로부터 얻은 헤파린 가혈장, EDTA 가혈장에 심근 트로포닌 I가 첨가된 검체를, 제1 항체에 심근 트로포닌 I의 41 ~ 49 번째 아미노산 서열을 인식하는 항체와, 제2 항체에 심근 트로포닌 I의 163 ~ 209 번째의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 이용하여, 염화 마그네슘 농도가 0 mmol/L, 10.0 mmol/L, 16.7 mmol/L의 조건하에서, 각 검체를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 동일 정상인으로부터 얻은 헤파린 가혈장, EDTA 가혈장에 심근 트로포닌 I가 첨가된 검체를, 제1 항체에 심근 트로포닌 I의 41 ~ 49 번째 아미노산 서열을 인식하는 항체와, 제2 항체에 심근 트로포닌 I의 175 ~ 190 번째의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 이용하여, 염화 마그네슘 농도가 0 mmol/L, 10.0 mmol/L, 16.7 mmol/L의 조건하에서, 각 검체를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 동일 정상인으로부터 얻은 헤파린 가혈장, EDTA 가혈장에 심근 트로포닌 I가 첨가된 검체를, 제1 항체에 심근 트로포닌 I의 41 ~ 49 번째 아미노산 서열을 인식하는 항체와, 제2 항체에 심근 트로포닌 I의 24 ~ 40 번째 아미노산 서열을 인식하는 항체를 이용하여, 염화칼슘 농도가 0 mmol/L, 6.7 mmol/L, 10 mmol/L의 조건하에서, 각 검체를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 동일 정상인으로부터 얻은 헤파린 가혈장, EDTA 가혈장에 심근 트로포닌 I가 첨가된 검체를, 제1 항체에 심근 트로포닌 I의 41 ~ 49 번째 아미노산 서열을 인식하는 항체와, 제2 항체에 심근 트로포 닌 I의 71 ~ 116 번째의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 이용하여, 염화칼슘 농도가 0 mmol/L, 6.7 mmol/L, 10 mmol/L의 조건하에서, 각 검체를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 동일 정상인으로부터 얻은 헤파린 가혈장, EDTA 가혈장에 심근 트로포닌 I가 첨가된 검체를, 제1 항체에 심근 트로포닌 I의 41 ~ 49 번째 아미노산 서열을 인식하는 항체와, 제2 항체에 심근 트로포닌 I의 163 ~ 209 번째의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 이용하여, 염화칼슘 농도가 0 mmol/L, 6.7 mmol/L, 10 mmol/L의 조건하에서, 각 검체를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명의 생체 시료로서는, 인간 등으로부터 채취된 심근 트로포닌을 포함 할 가능성이 있는 시료이다. 생체 시료로서는, 전혈, 혈청, 혈장 등의 혈액 시료 등을 들 수 있다. 생체 시료가 채취되는 대상은, 심근 트로포닌의 측정이 요구되는 한 한정되지 않지만, 바람직하게는, 심근 경색, 심부전 등의 심근 질환을 가지는 것이 의심되는 환자이다.

본 발명에 사용 가능한 검체로서는, 상기 생체 시료로부터 조제할 수 있는 측정용 시료이면 좋고, 예를 들면, 혈액 시료를 대상으로 한 경우에는, 혈액 응고 조해제를 사용하여 얻은 전혈, 혈청, 혈장 등의 검체를 들 수 있다. 혈액 응고 조해제로서는, 예를 들면, 헤파린, EDTA, 구연산 등을 사용할 수 있다. 이들은, 바람직하게는, 인간 등의 측정 대상으로부터 채혈을 할 때, 미리 채혈관 등에 첨가하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 대상으로 하는 심근 트로포닌은, 유리형(遊離型)의 심장형 트로포닌 I (cTnI 또는 I로 생략하는 것이 있다) 또는 심장형 트로포닌 T (cTnT 또는 T로 생략 할 수있다) 또는 심장형 트로포닌 C (cTnC 또는 C로 생략하는 것이 있다), 및 그들의 다이머(ダイマ-) (IT, IC 또는 TC)의 형태, 또는 그들의 트리머(トリマ-) (ITC)의 형태를 들 수 있다. 본 명세서에서 명시하지 않는 한, 심근 트로포닌은, 상기의 형태 중 어느 하나를 총칭하고, 심장 트로포닌 복합체는, 상기 다이머나 상기 트리머를 총칭한다.

본 발명에서 사용 가능한 면역학적 측정 방법은, 심근 트로포닌에 특이적인 항체를 사용하는 공지의 방법이면 좋다. 예를 들면, 면역 비탁법(比濁法) (TIA), 효소 면역 측정법 (EIA), 방사 면역 측정법 (RIA), 라텍스 응집 반응법, 형광 면역 측정법, 면역크로마토그래피법(イムノクロマト法)등을 들 수 있다. 구체적으로는, 반응액 중에서, 검체 중의 심근 트로포닌과 상기 심근 트로포닌에 특이적인 항체와의 면역 복합체를 형성시켜, 그 형성된 것에 의해 시그날을 적절하게 검출하여 상기 심근 트로포닌의 존재를 검출하는 방법이다. 측정계에 의해 사용하는 항체는 결정할 수 있지만, 고감도로 정량적으로 측정할 때에는, 2종류 이상의 항체를 사용하는 샌드위치 면역학적 측정법 (샌드위치 면역 분석법)을 선택할 수 있다. 샌드위치 면역학적 측정법의 방법은, 1 이상의 단계 (2 단계, 3 단계 등)로 실시해도 좋다.

예를 들면, 생체 시료 중에 포함되는 심근 트로포닌을 피검물질로서, 이를 측정하는 경우에는, 전술한 바와 같이 상기 생체 시료로부터 조제된 검체를, 다시 검체 희석액으로 측정용 검체로 조제하여, 심근 트로포닌에 특이적으로 결합하는 항체 (제1 항체)를 담지시킨 불용성 담체, 및 표지 물질로 표지화된 제1 항체와는 다른 심근 트로포닌에 특이적으로 결합하는 항체 (제2 항체)를 혼합하여 면역 복합체를 형성시키고, 세정에 의해 미반응의 항체 및 심근 트로포닌을 제거 (B/F 분리)한 후, 불용성 담체에 결합된 표지 물질의 양을 측정함으로써 수행할 수 있다.

상기의 불용성 담체는, 당해 기술에서 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수있다. 불용성 담체의 재료로서는, 예를 들어, 라텍스, 고무, 폴리 에틸렌, 폴리 프로필렌, 폴리 스티렌, 스티렌-부타디엔 공중합체, 폴리 염화비닐, 폴리 비닐아세테이트, 폴리 아크릴아미드, 폴리 메타크릴레이트, 스티렌-메타크릴레이트 공중합체, 폴리 글리시딜 메타크릴레이트, 아크롤레인-에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 공중 합체, 폴리 비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF), 실리콘 등의 고분자 재료; 아가로스(アガロ-ス); 젤라틴; 적혈구; 실리카겔, 유리, 불활성 알루미나, 자성체 등의 무기 재료 등을 들 수 있다. 이들의 1 종 또는 2 종 이상을 조합해도 좋다.

또한, 불용성 담체의 형상으로서는, 마이크로타이터 플레이트(マイクロタイタ-プレ-ト), 시험관, 비즈, 입자, 나노 입자 등을 들 수 있다. 입자로서는, 자성 입자, 폴리스티렌 라텍스와 같은 소수성 입자, 입자 표면에 아미노기, 카르복실기 등의 친수기를 갖는 공중합 라텍스 입자, 적혈구, 젤라틴 입자 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 신속 간편한 B/F 분리를 실현하는 관점에서는 자성 입자가 특히 바람직하며, 구체적으로 예를 들어, 사산화삼철 (Fe₃O₄), 삼산산화철 (Fe₂O₃), 각종 페라이트(フェライト), 철, 망간, 니켈, 코발트, 크롬 등의 금속, 코발트, 니켈, 망간 등의 합금으로 구성된 미립자 등의 자성 입자가 바람직하게 사용된다. 또한, 이러한 자성 입자를 폴리스티렌 등의 고분자 라텍스나, 젤라틴, 리포좀 등의 내부에 포함된 형태로 조제하거나, 표면에 고정화한 것을 바람직하게 사용할 수 있다.

이러한 불용성 담체에 제1 항체를 고정화시키는 방법은, 당해 기술에서 공지이다. 상기 고정화는 예를 들면 물리적 흡착법, 공유 결합법, 이온 결합법, 이들의 조합 등에 의해 실시할 수 있다.

표지 물질은, 통상의 면역학적 측정법에서서 사용할 수 있는 표지 물질이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 효소, 형광 물질, 방사성 동위 원소, 불용성 입상 물질 등을 들 수 있다. 상기 표지용의 효소로서는, 알칼리 포스파타아제, 퍼록시다아제, 글루코스 옥시다아제, 티로시나아제, 산성 포스파타아제 등을 들 수 있다. 형광 물질로서는, 플루오레세인 이소티오시아네이트(フルオレセインイソチオシアネ-ト) (FITC), 그린 형광 단백질 (GFP), 루시페린(ルシフェリン) 등을 들 수 있다. 방사성 동위 원소로서는, ¹²⁵I, ¹⁴C, ³²P 등을 들 수 있다.

또한, 표지 물질이 효소인 경우, 상기 효소에 대한 기질(基質)을 사용하여 발광, 형광 또는 발색 반응을 실시함에 의해, 표지 물질을 측정 할 수 있다. 예를 들어, 효소가 알칼리 포스파타아제인 경우, 기질로서는 CDP-star (등록 상표) (4 - 클로로-3-(메톡시스피로{1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로[3.3.1.1^3,7] 데칸}-4-일)페닐인산 2나트륨), CSPD (등록 상표) (3-(4-메톡시스피로{1,2-디옥세탄-3,2-(5'-클로로) 트리시클로[3.3.1.1^3,7]데칸}-4-일)페닐인산 2나트륨), AMPPD(등록상표) (아다만틸 메톡시 페닐포스포릴 디옥세탄(アダマンチルメトキシフェニルホスホリルジオキシセタン)), APS-5 등의 화학 발광 기질; 4-메틸 운베리페릴 포스페이트 (4-methylumbelliferylphosphate) 등의 형광 기질; p-니트로페닐 포스페이트, BCIP (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-인산(5－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－リン酸)), NBT (4-니트로블루 테트라조리움 클로라이드(４－ニトロブル-テトラゾリウムクロリド)), INT (요오드니트로 테트라조리움) 등의 발색 기질을 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 심근 트로포닌에 특이적으로 결합하는 항체는, 심근 트로포닌의 아미노산 서열을 에피토프(エピト-プ)로서 인식하는 모노클론 항체, 또는 폴리클론 항체이면 특별히 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면, 심근 트로포닌 I의 13 ~ 22번째, 15 ~ 25번째, 18 ~ 22번째, 16 ~ 20번째, 18 ~ 28번째, 21 ~ 30번째, 22 ~ 31번째, 23 ~ 29번째, 24 ~ 40번째, 25 ~ 35번째, 25 ~ 40번째, 26 ~ 35번째, 27 ~ 32번째, 27 ~ 39번째, 27 ~ 40번째, 27 ~ 73번째, 30 ~ 100번째, 31 ~ 34번째, 41 ~ 49번째, 41 ~ 56번째, 56 ~ 61번째, 71 ~ 116번째, 80 ~ 110번째, 83 ~ 93번째, 85 ~ 92번째, 85 ~ 95번째, 87 ~ 91번째, 88 ~ 94번째, 117 ~ 126번째, 122 ~ 139번째, 130 ~ 145번째, 137 ~ 148번째, 143 ~ 152번째, 148 ~ 158번째, 163 ~ 209번째, 163 ~ 210번째, 169 ~ 178번째, 175 ~ 190번째, 186 ~ 192번째 또는 190 ~ 196번째 아미노산 서열을 인식하는 항체를 들 수 있다. 바람직하게는, 심근 트로포닌 I의 아미노산 서열예 21 ~ 30번째, 24 ~ 40번째, 41 ~ 49번째, 71 ~ 116번째, 163 ~ 209번째, 175 ~ 190번째를 인식하는 항체를 들 수 있다.

이들 항체는, 공지의 방법에 따라, 예를 들면, 인간 심장에서 정제한 트로포닌 I나 트로포닌 복합체, in vitro로 제작한 조합된(コンビナント) 트로포닌 I 등을 항원으로 하여, 동물에 면역하여 제작하고 또한, 에피토프를 결정할 수 있다. 에피토프는, 항체가 인식하는 가장 작은 영역뿐만 아니라, 항체가 인식 가능한 영역으로 확인(同定)된 것을 의미한다. 또한 공지의 방법으로 조제 가능한 Fab 등의 항체 프래그먼트인 것도 좋다. 또한 이러한 항체는, Hytest 사, MedixBiochemica 사, Meridian Life science 사, DAKO 사, Fitzgerald 사, Biospacific 사 등에서 적절하게 구입할 수 있다.

본 발명의 측정에서, 2 종류의 항체를 사용하는 경우, 생체 시료 중의 심근 트로포닌과 면역 복합체를 형성할 수 있다면, 한정하는 것은 아니지만, 제1 항체와 제2 항체가 인식하는 에피토프가 다른 것이 바람직하다. 또한 모노클론 항체와 폴리클론 항체는 적절히 조합하여 사용할 수 있다. 또한 제1 항체 및 제2 항체는, 각각 1 종류에 한정하지 않고 2 종류 이상을 병용할 수 있다.

본 발명의 2가 양이온의 첨가는, 상기의 면역학적 측정법에서, 심근 트로포닌과 상기 심근 트로포닌에 특이적으로 결합하는 항체의 적어도 첫 번째 면역 복합체 형성시 (반응액 중)에 존재하도록 실시되면 좋다. 구체적으로는, 면역 복합체 형성시 (반응액 중)에 동시에 첨가 되어도 좋지만, 복합체 형성 전 (상기 항체와 심근 트로포닌 함유 검체를 접촉하기 전에)에, 검체에 첨가되어도 좋다 .

또한, 첨가되는 2가 양이온은, 공지의 완충액에 용해되어 용액으로 조제된다. 단독으로 조제되어도 좋지만, 완충제의 다른, 검체의 전처리나, 반응시에 필요한 공지의 물질과 함께 조제되어도 좋다. 2가 양이온은, 상기와 같이, 적어도 면역 복합체 형성시 (반응액 중)에 첨가되어 있으면 좋기 때문에, 그 때에 존재시킬 수 있는 완충액 등에 함유시킬 수 있다. 면역 복합체 형성시에 존재할 수 있는 완충액등 으로서는, 사용하는 측정 방법이나 장치에 의해 적절하게 설정 가능하나, 예를 들어 검체 희석액이나 항체 용액 (항체 고상(固相) 입자액이나 표지 항체액 등) 등을 들 수 있다. 또한 복수의 완충액에 첨가하여도 좋다.

본 발명의 2가 양이온으로는, 칼슘 이온, 마그네슘 이온을 들 수 있다. 상기 이온이, 반응액 중에서 이온으로 존재할 수 있도록 공급되면 어떤 형태로 첨가되어도 좋지만, 바람직하게는 염이다. 구체적으로는, 염화 칼슘, 염화 마그네슘을 들 수 있다.

본 발명의 2가 양이온의 농도로서는, 상기 면역 복합체 형성시의 농도로서, 4 mmol/L 이상, 바람직하게는 5 mmol/L 이상, 보다 바람직하게는 6 mmol/L 이상, 보다 바람직하게는 8 mmol/L 이상, 보다 바람직하게는 10 mmol/L 이상, 보다 바람직하게는 12 mmol/L 이상, 보다 바람직하게는 15 mmol/L 이상, 또한 500 mmol/L 이하, 바람직하게는 100 mmol/L 이하, 보다 바람직하게는 50 mmol/L 이하, 더욱 바람직하게는 20 mmol/L 이하의 범위로부터 적절히 조합하여 선택된다. 본 발명에서는, 생체 시료 중의 2가 양이온의 존재에도 불구하고, 반응액 중의 2가 양이온이 상기 농도 범위로 되도록 존재하도록 놓는 것이다. 또한, 반응액 중의 2가 양이온 농도를 너무 높이면, 항원 항체 반응이 억제(조해)되어 목적의 측정이 정밀하게 할 수 없게되므로, 주의가 필요하다. 또한, 본 발명에 따라 검체의 종류에 관계없이 안정적으로 고정밀도로 생체 시료 중의 심근 트로포닌을 측정하기 위해, 검체에 포함된 심근 트로포닌의 양이나 사용하는 2가 양이온에 의해, 첨가하는 농도를 결정하는 것은 설계의 범위이다.

본 발명의 2가 양이온의 상기 농도는, 종래법에서의 심근 트로포닌의 면역 학적 측정의 반응액 중에 포함되는 2가 양이온의 농도보다 고농도이다. 종래법과 같이, 면역 복합체 형성시에 2가 양이온이 포함되어 있지 않거나, 또는, 포함되어 있어도 저농도인 경우에는, 후술의 실시예에 구체적 실험 데이터를 볼 수 있듯이, 항응고제로 EDTA를 추가한 혈액 시료 (예를 들어, EDTA 가혈장, EDTA 가전혈, 특히는 EDTA 가혈장)를 이용한 경우의 측정값과, 그것 이외의 혈액 시료 (예를 들면, 혈청, 헤파린 가혈장, 구연산 가혈장, 전혈)을 이용한 경우의 측정값과의 사이에 괴리가 발생한다. 한편, 면역 복합체 형성시에 고농도의 2가 양이온이 존재하는 경우에는, 측정값의 차이가 줄어들거나 또는 실질적으로 일치한다. 본 발명자가 금회 처음으로 발견한, EDTA 첨가의 유무에 기초하여 검체의 종류 차이에 의해 생기는 이러한 거동의 차이는, 에피토프가 다른 여러 종의 모노클론 항체를 사용하여도 공통으로 인정되는 현상이며 (후술의 실시예 3 및 4 참조), 특별한 모노클론 항체에 특유의 현상이 아니다.

본 발명의 2가 양이온의 농도는, 후술하는 실시예와 같이, EDTA를 첨가한 혈액 시료와, 그것 이외의 혈액 시료를 준비하고, 복수의 다른 농도의 2가 양이온의 존재하에서, 각 혈액 샘플 중의 심근 트로포닌 양을 측정하고, 두 시료의 측정값이 일치하는 2가 양이온의 농도 범위를 파악함으로써, 쉽게 결정할 수 있다. 즉, 본 발명의 2가 양이온의 농도는, 항응고제로서 EDTA를 첨가한 혈액 시료를 이용한 경우의 측정값과, 그것 이외의 혈액 시료를 이용한 경우의 측정값과 일치하는 농도 범위에서 선택할 수 있다.

본 발명의 키트는, 본 발명의 방법을 실시하기 위해 사용될 수 있으며, 심근 트로포닌에 특이적으로 결합하는 항체와, 2가 양이온을 함유하는 완충액을 포함한다.

심근 트로포닌에 특이적으로 결합하는 항체로는, 전술한 공지의 항체를 사용할 수 있고, 모노클론 항체 또는 폴리클론 항체의 어느 하나이어도 가능하다. 또한 심근 트로포닌에 특이적 결합능을 유지하는 항체 단편, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')₂, 또는 Fv로서, 키트에 사용할 수도 있다.

또한, 상기 항체는, 그대로의 상태에서 키트에 사용할 수도 있고, 이용하는 면역학적 수법에 기초하여, 그것에 적합한 형태, 예를 들면, 라텍스 응집 면역 측정법을 이용하는 것이면, 라텍스 담체에 고정한 상태에서, 자성 입자 등을 이용한 고감도 측정법을 사용하는 것이면, 자성 입자에 고정한 상태에서, 면역 크로마토그래피법 등의 기판을 이용하는 방법이라면, 기판에 고정된 상태에서, 표지 물질 (예를 들면, 효소, 형광 물질, 화학 발광 물질, 방사성 동위 원소, 비오틴, 아비딘)에 의한 표지의 필요가 있다면, 표지화한 상태에서, 키트에 사용할 수 도 있다.

상기 2가 양이온을 포함하는 완충액으로서는, 전술한 것을 참조하면 좋지만, 예를 들면, 염화칼슘, 염화 마그네슘 등의 염으로 조제된 용액이다. 바람직하게는 검체 희석액으로 조제된 것이면 좋다.

또한, 본 발명의 키트는, 본 발명의 키트를 사용하는 면역학적 측정법의 실시 수순에 대한 설명, 키트 자체의 보존·취급 등에 대한 주의 사항 등이 기재된 설명서를 포함할 수 있다 .

[실시예]

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

《실시예 1: 심근 트로포닌 측정용 시약의 제작 및 측정법》

실시예 1-1: 심근 트로포닌 측정용 시약의 제작과 피검 시료의 조제

심근 트로포닌의 측정용 시약으로서, 심근 트로포닌 I (cTnI) 측정용 시약을 제작하였다.

·제1 항체 용액: 자성 입자(JSR 사)에 cTnI의 아미노산 서열 41 ~ 49번째를 에피토프로서 인식하는 항체 (19C7 : Hytest 사)를 결합한 자성 입자 용액을 사용하였다.

·제2 항체 용액 : cTnI의 아미노산 서열 71 ~ 116번째를 에피토프로서 인식하는 항체 (DAKO 사)를 말레이미드 법에 의해 알칼리 포스파타아제(ALP) 표지한 표지 항체 용액을 사용하였다.

·발광 기질 용액: CDP-star (어플라이바이오시스템 사 제품)를 사용했다.

·검체 희석액: 0.1 mol/L Tris·HCl(8.2), 0.1 % BSA, 0.15 mol/L NaCl, 염화칼슘 또는 염화 마그네슘을 포함하는 완충액을 사용했다.

·B/F 세정액: 0.01 mol/L MOPS(7.5), 0.15 mol/L NaCl, 0.05 % Triton X-100을 포함하는 완충액을 사용했다.

다음에 이들 용액을, 후술의 자동 면역 측정 장치에 싣도록(收載) 상기 자동 면역 측정 장치의 자동 측정용 카트리지에 봉입했다.

피검 시료는, 정상인으로부터 얻은 혈청, 헤파린 가혈장, EDTA 가혈장에 심근 트로포닌 복합체 (I-T-C) (Hytest 사)를 약 0.7 ng/mL가 되도록 첨가하여 제작 했다.

실시예 1-2: 심근 트로포닌 측정용 시약의 측정법

심근 트로포닌의 측정에는, 특허 제 3115501 호 공보 등에 개시된 것과 같은 자성 입자를 이용한 면역 측정을 자동으로 수행 할 수 있는 자동 면역 측정 장치를 사용하였다. 상기 장치는 액체의 흡인·토출 라인으로서 배치된 칩 내에서 자력에 의해 효과적으로 B/F 분리할 수 있고, 높은 세정 효율을 보여준다. 상기 장치의 측정 스텝은 하기와 같다.

또한, 검색은, 광전자 증배관 (PMT)에 의해 검출되는 화학 발광 기질의 발광 카운트를 측정결과로 했다.

자동 면역 측정 장치에 의한 측정

자동 측정용 카트리지에, 시료, 시료 희석액, 자성 입자 용액 (제1 항체가 담지되어 있다), B/F 분리용 세정액, 제2 항체 용액, 기질 용액 등을 충진하고, 장치에 세트했다.

이하, 통상의 운전 방법에 따라, 각 작업이 수행된다.

(1) 희석액을 이용하여 임의의 희석 배율로 조정된 시료 용액, 자성 입자 용액 및 제2 항체 용액을 혼합하고, 항원 항체 반응을 진행시켜 면역 복합체를 생성시킨다.

(2) 미반응의 물질을 제거하기 위해 B/F 분리를 수행한다. 먼저, 액체 흡인 라인으로 세트된 칩을 통해 반응액을 흡인하고, 자석을 칩 외벽면에 접촉시켜 자성 입자를 포집한다. 다음에, 자성 입자가 칩 내벽면에 흡착 유지된 상태에서 용액을 토출하여 분리한 후, 다른 반응 용기에 충진된 B/F 분리용의 세정액을 흡입·토출하여 세정을 수행한다.

(3) 상기 칩의 외벽면으로부터 자석을 이탈시켜 자력의 영향을 없앤 후, 기질 용액을 흡인·토출하고, 칩 내벽면에 흡착 유지된 자성 입자를 분산시켜 효소 반응을 수행한다.

(4) PMT에 의해 발광량을 측정한다.

《실시예 2: 반응액으로의 염화칼슘 또는 염화 마그네슘 첨가에 의한 심근 트로포닌의 반응성에의 영향》

염화칼슘 또는 염화 마그네슘을, 반응액 중에 각 농도 (0, 3.3, 6.7, 10.0, 13.3, 16.7 mmol/L)가 되도록 시료 희석액에 첨가한 것 이외는 실시예 1에 따라 실행했다.

염화칼슘의 결과를 도 1, 염화 마그네슘의 결과를 도 2에 나타낸다. 그 결과, 염화칼슘 또는 염화 마그네슘의 첨가가 종래 사용되는 저농도이고, 혈청 및 헤파린 가혈장과 EDTA 가혈장에서는, 심근 트로포닌의 반응성이 다른 것으로 나타났다. 또한 염화칼슘은 6.7 mmol/L 이상, 염화 마그네슘은 13.3 mmol/L 이상, 첨가 됨으로써, 혈청 및 헤파린 가혈장은 EDTA 가혈장의 심근 트로포닌의 반응성이 일치하는 것으로 확인되었다.

이상에 의해, 고농도의 염화칼슘 또는 염화 마그네슘을 반응액 중에 첨가함에 의해, 어떤 피검 시료에서도, 마찬가지로 안정적으로 심근 트로포닌을 측정할 수 있는 것을 알 수 있다. 또한 심근 트로포닌 복합체(I-T-C)는 EDTA 가혈장에서는 칼슘 이온이 킬레이트화되어 버리기 때문에, 복합체가 분해되고 있다고 생각된다. 혈청 및 헤파린 가혈장은, 심근 트로포닌 복합체(I-T-C)가 분해되지 않은 상태에도 불구하고, 반응액 중의 2가 양이온 농도를 높이는 것에 의해 EDTA 가혈장의 반응성과 일치하기 때문에, 여기에서 얻어진 결과는 의외의 결과라고 생각된다. 칼슘 이온은 심근 트로포닌 C에 결합하는 것으로 알려져 있지만, 그 결합 부위는 복수 존재한다. 이때문에, 심근 트로포닌 I, 심근 트로포닌 T 및 심근 트로포닌 C의 상호 작용은, 칼슘 이온의 농도에 의해 결합 상태가 변화하는 것으로 생각된다. 본 발명의 효과는, 2가 양이온을 과다하게 첨가하는 것으로, 심근 트로포닌 복합체의 분자 구조의 변화를 주고, 유리형(遊離型) 심근 트로포닌 I와 같은 효과를 얻을 수 있는 구조로 변화시키는 가능성도 생각된다.

《실시예 3: 효소 표지 항체의 차이에 있어서 반응액에의 염화 마그네슘 첨가에 의한 심근 트로포닌의 반응성에의 영향》

제2 항체 용액을 이하의 항체로 변경한 것 및 반응액에 첨가하는 염화 마그네슘 농도 이외는 실시예 1의 방법에 따라 실시했다. 제2 항체 용액으로서, 심근 트로포닌 I의 아미노산 서열 21 ~ 30번째 (MedixBiochemica 사), 24 ~ 40번째 (Biospacific 사), 71 ~ 116번째 (DAKO 사), 163 ~ 209번째 (DAKO 사), 175 ~ 190번째 (MedixBiochemica 사)를 에피토프로서 인식하는 항체 용액 5개를 각각 제작 하였다. 반응액에 첨가하는 염화 마그네슘 농도는 0, 10, 16.7 mmol/L에서 실시했다.

제2 항체 용액으로서, 심근 트로포닌 I의 아미노산 서열 21 ~ 30번째, 24 ~ 40번째, 71 ~ 116번째, 163 ~ 209번째, 175 ~ 190번째를 에피토프로하는 항체를 사용한 결과를 각각 도 3, 도 4, 도 5, 도 6, 도 7에 나타낸다. 또한 도 2와 도 5는 동일한 항체의 조합 결과이다. 그 결과, 실시예 2와 항원 인식 부위가 다른 제2 항체 용액을 이용한 경우에도, 실시예 2의 조합과 같이, 염화 마그네슘 농도를 10 mmol/L 이상으로 한 것으로, 혈청 및 헤파린 가혈장은 EDTA 가혈장의 심근 트로포닌의 반응성을 일치시킬 수 있는 것으로 확인되었다.

《실시예 4: 효소 표지 항체의 차이에 있어서 반응액에의 염화 칼슘 첨가에 의한 심근 트로포닌의 반응성에의 영향》

제2 항체 용액을 이하의 항체로 변경한 것 및 반응액에 첨가하는 염화 칼슘 농도 이외는, 실시예 1에 따라 실시했다. 제2 항체 용액으로서 심근 트로포닌 I의 아미노산 서열 24 ~ 40번째, 71 ~ 116번째, 163 ~ 209번째를 에피토프로서 인식하는 항체 용액 3개를 각각 제작하였다. 반응액에 첨가하는 염화 칼슘 농도는 0, 6.7, 10 mmol/L에서 실시했다.

제2 항체 용액으로서 심근 트로포닌 I의 아미노산 서열 24 ~ 40번째, 71 ~ 116번째, 163 ~ 209번째를 에피토프로하는 항체를 사용한 결과를 각각 도 8, 도 9, 도 10에 나타낸다. 또한 도 1과 도 9는 동일한 항체의 조합 결과이다. 그 결과, 실시예 2와 항원 인식 부위가 다른 제2 항체 용액을 이용한 경우에도, 실시예 2의 조합처럼, 염화 칼슘 농도를 6.7 mmol/L 이상으로하여 혈청 및 헤파린 가혈장은 EDTA 가혈장의 심근 트로포닌의 반응성을 일치시킬 수 있는 것으로 확인되었다.

실시예 3 및 실시예 4의 결과에서, 반응액의 2가 양이온의 첨가는, 심근 트로포닌 I의 아미노산 서열 21 ~ 30번째, 24 ~ 40번째, 71 ~ 116번째, 163 ~ 209번째, 175 ~ 190번째 중 어느 하나에 특정된 구조 변화에 의한 것은 아닌 것이 시사되었다. 따라서, 종래 생각되었던 2가 양이온의 첨가에 의한 심근 트로포닌 복합체의 안정화와는 다른 작용에 의해, 고농도의 2가 양이온의 첨가가, 혈청 및 헤파린 가혈장은 EDTA 가혈장의 심근 트로포닌의 반응성을 일치시킬 수 있다고 추측되었다.

(산업상 이용 가능성)

본 발명은 심근 트로포닌을 검출하는 경우에, 검체의 종류에 관계없이, 검체 중 간섭 물질의 영향을 받지 않고 안정적으로 고정밀도로 측정 결과를 얻을 수있다. 심근 트로포닌은, 심근 경색 등의 심근 장애의 지표로 사용되므로, 간편하고 신속하게 측정될 필요가 있고, 검사실뿐만 아니라 POCT 분야 등에서도 측정된다. 예를 들면, 혈액 시료를 대상으로 하면, 상기 시료의 채취에 사용되는 용기는 다양하기 때문에, 얻어진 검체의 종류에 관계없이, 안정적이며 고정밀도로 측정 결과를 얻을 수 있게 되는 본 발명은 특히 유용하다.

이상, 본 발명을 특정 태양에 따라 설명했지만, 당업자에게 자명한 변형이나 개량은은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims

생체 시료 중의 심근 트로포닌을 면역학적으로 측정하는 방법에 있어서, 심근 트로포닌과 그것에 특이적으로 결합하는 항체와 면역 복합체의 형성을 4 mmol/L 이상의 2가 양이온의 존재하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 심근 트로포닌을 측정하는 방법.
생체 시료 중의 심근 트로포닌의 면역학적 측정에 있어서, 항응고제로서 EDTA를 첨가한 혈액 시료를 이용한 경우의 측정값과, 그것 이외의 혈액 시료를 이용한 경우의 측정값 사이의 괴리를 감소시키는 방법이며, 심근 트로포닌과 그것에특이적으로 결합하는 항체와의 면역 복합체의 형성을 2가 양이온의 존재 하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 2가 양이온이 칼슘 이온 또는 마그네슘 이온인, 방법.
청구항 1 내지 청구항 3의 어느 한 항에 있어서, 상기 2가 양이온을 검체 희석액 및/또는 항체 용액에 함유하는, 방법.
청구항 1 내지 청구항 4의 어느 한 항에 있어서, 심근 트로포닌에 특이적으로 결합하는 제1 항체와 제2 항체를 접촉시켜, 항원 항체 반응에 의해 형성된 면역 복합체를 측정하는, 방법
청구항 5에 있어서, 상기 제1 항체와 상기 제2 항체가, 다른 에피토프를 인식하는 항체인, 방법.
청구항 1 ~ 6 중 어느 한 항에 기재된 방법을 위해, 심근 트로포닌에 특이 적으로 결합하는 항체와 고농도의 2가 양이온을 함유하는 완충액을 포함하는, 심근 트로포닌 측정 키트.