JP5864530B2 - 心筋トロポニンの測定法 - Google Patents
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Description
本発明は、生体試料中の心筋トロポニンを検出する場合に、異なる血液凝固阻害剤の使用による全血、血清、血漿といった検体の種類に関わらず、検体中の干渉物質の影響を受けることなく安定的で高精度な測定値を得ることができる測定方法及びキットを提供することを目的とする。
(1)生体試料中の心筋トロポニンを免疫学的に測定する方法において、心筋トロポニンとそれに特異的に結合する抗体との免疫複合体の形成を4mmol/L以上の2価陽イオンの存在下で行うことを特徴とする、該心筋トロポニンを測定する方法、
(2)生体試料中の心筋トロポニンの免疫学的測定において、抗凝固剤としてEDTAを添加した血液試料を用いた場合の測定値と、それ以外の血液試料を用いた場合の測定値との乖離を減少させる方法であって、心筋トロポニンとそれに特異的に結合する抗体との免疫複合体の形成を2価陽イオンの存在下で行うことを特徴とする、前記方法、
(3)前記2価陽イオンが、カルシウムイオン又はマグネシウムイオンである、(1)又は(2)の方法、
(4)前記2価陽イオンを検体希釈液及び/又は抗体溶液に含有する、(1)〜(3)のいずれかの方法、
(5)心筋トロポニンに特異的に結合する第1抗体と第2抗体を接触させ、抗原抗体反応により形成された免疫複合体を測定する、(1)〜(4)のいずれかの方法、
(6)前記第1抗体と前記第2抗体が、異なるエピトープを認識する抗体である、(5)の方法、
(7)(1)〜(6)のいずれかの方法のための、心筋トロポニンに特異的に結合する抗体と、高濃度の2価陽イオンを含有する緩衝液を含む、該心筋トロポニン測定キット
に関する。
《実施例1:心筋トロポニン測定用試薬の作製と測定法》
実施例1−1:心筋トロポニン測定用試薬の作製と被検試料の調製
心筋トロポニンの測定用試薬として、心筋トロポニンI(cTnI)測定用の試薬を作製した。
・第1抗体溶液:磁性粒子(JSR社)にcTnIのアミノ酸配列41〜49番目をエピトープとして認識する抗体(19C7:Hytest社)を結合した磁性粒子溶液を用いた。
・第2抗体溶液:cTnIのアミノ酸配列71〜116番目をエピトープとして認識する抗体(DAKO社)をマレイミド法によりアルカリホスファターゼ(ALP)標識した標識抗体溶液を用いた。
・発光基質溶液:CDP−star(アプライドバイオシステム社製)を使用した。
・検体希釈液:0.1mol/L Tris・HCl(8.2)、0.1% BSA、0.15mol/L NaCl、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムを含む緩衝液を使用した。
・B/F洗浄液:0.01mol/L MOPS(7.5)、0.15mol/L NaCl、0.05% Triton X−100を含む緩衝液を使用した。
被検試料は、健常人から取得した血清、ヘパリン加血漿、EDTA加血漿に心筋トロポニン複合体(I−T−C)(Hytest社)を約0.7ng/mLになるように添加し作製した。
心筋トロポニンの測定には、特許第3115501号公報等に開示されているものと同様の磁性粒子を用いた免疫測定を自動的に行うことのできる自動免疫測定装置を用いた。該装置は、液体の吸引・吐出ラインとして配設されたチップ内で磁力により効果的にB/F分離を行うことができ、高い洗浄効率を示す。該装置の測定ステップは下記のとおりである。
なお、検出は、光電子増倍管(PMT)により検出される化学発光基質の発光カウントを測定結果とした。
自動測定用カートリッジに、試料、試料希釈液、磁性粒子溶液(第1抗体が担持されている)、B/F分離用の洗浄液、第2抗体溶液、基質溶液等を充填し、装置にセットする。
以下、通常の運転方法に従い、各操作が行われる。
(1)希釈液を用いて任意の希釈倍率に調整された試料溶液、磁性粒子溶液、および、第2抗体溶液を混合し、抗原抗体反応を行わせて免疫複合体を生成させる。
(2)未反応の物質を除去するためにB/F分離を行う。まず、液体吸引ラインとしてセットされたチップを通じて反応液を吸引し、磁石をチップ外壁面に接触させて磁性粒子を捕集する。次に、磁性粒子がチップ内壁面に吸着保持された状態で溶液を吐出して分離を行った後、別の反応容器に充填されたB/F分離用の洗浄液を吸引・吐出して洗浄を行う。
(3)前記チップの外壁面から磁石を離脱させて磁力の影響をなくした後に、基質溶液を吸引・吐出し、チップ内壁面に吸着保持された磁性粒子を分散させ、酵素反応を行わせる。
(4)PMTにより発光量を測定する。
塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムを、反応液中に各濃度(0、3.3、6.7、10.0、13.3、16.7mmol/L)になるように試料希釈液に添加したこと以外は、実施例1に従って行った。
塩化カルシウムの結果を図1、塩化マグネシウムの結果を図2に示す。その結果、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムの添加が従来使用されている低濃度だと、血清およびヘパリン加血漿とEDTA加血漿では、心筋トロポニンの反応性が異なることがわかった。さらに、塩化カルシウムは6.7mmol/L以上、塩化マグネシウムは13.3mmol/L以上、添加されることにより、血清およびヘパリン加血漿はEDTA加血漿の心筋トロポニンの反応性が一致することが確認された。
第2抗体溶液を以下の抗体に変更したこと及び反応液に添加する塩化マグネシウム濃度以外は、実施例1の方法に従い行った。第2抗体溶液として、心筋トロポニンIのアミノ酸配列21〜30番目(MedixBiochemica社)、24〜40番目(Biospacific社)、71〜116番目(DAKO社)、163〜209番目(DAKO社)、175〜190番目(MedixBiochemica社)をエピトープとして認識する抗体溶液5つをそれぞれ作製した。反応液に添加する塩化マグネシウム濃度は、0、10、16.7mmol/Lで実施した。
第2抗体溶液を以下の抗体に変更したこと及び反応液に添加する塩化カルシウム濃度以外は、実施例1に従い行った。第2抗体溶液として、心筋トロポニンIのアミノ酸配列24〜40番目、71〜116番目、163〜209番目をエピトープとして認識する抗体溶液3つをそれぞれ作製した。反応液に添加する塩化カルシウム濃度は0、6.7、10mmol/Lで実施した。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (7)
- 生体試料中の心筋トロポニンを免疫学的に測定する方法において、心筋トロポニンとそれに特異的に結合する抗体との免疫複合体の形成をカルシウムイオン又はマグネシウムイオンの存在下で行い、カルシウムイオンの場合は6.7mmol/L以上の塩化カルシウムの存在下で、あるいは、マグネシウムイオンの場合は13.3mmol/L以上の塩化マグネシウムの存在下で行うことを特徴とする、該心筋トロポニンを測定する方法。
- 生体試料中の心筋トロポニンの免疫学的測定において、抗凝固剤としてEDTAを添加した血液試料を用いた場合の測定値と、それ以外の血液試料を用いた場合の測定値との間の乖離を減少させる方法であって、心筋トロポニンとそれに特異的に結合する抗体との免疫複合体の形成をカルシウムイオン又はマグネシウムイオンの存在下で行うことを特徴とする、前記方法。
- 前記カルシウムイオン又はマグネシウムイオンを検体希釈液及び/又は抗体溶液に含有する、請求項1又は2に記載の方法。
- 心筋トロポニンに特異的に結合する第1抗体と第2抗体を接触させ、抗原抗体反応により形成された免疫複合体を測定する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1抗体と前記第2抗体が、異なるエピトープを認識する抗体である、請求項4に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法のための、心筋トロポニンに特異的に結合する抗体と、高濃度のカルシウムイオン又はマグネシウムイオンを含有する緩衝液を含む、該心筋トロポニン測定キットであって、前記緩衝液中のカルシウムイオン又はマグネシウムイオンの濃度が、反応液中に添加した場合に、カルシウムイオンの場合は6.7mmol/L以上、あるいは、マグネシウムイオンの場合は13.3mmol/L以上になる濃度である、前記キット。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法のための、心筋トロポニンに特異的に結合する抗体と、8mmol/L以上のカルシウムイオンを含有する緩衝液、あるいは、15mmol/L以上のマグネシウムイオンを含有する緩衝液とを含む、該心筋トロポニン測定キット。
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