JP6441407B2 - 非特異的結合を減少させるためのイムノアッセイ方法及び試薬 - Google Patents

Description

(関連出願の参照）
本出願は、２０１１年５月２０日に出願された米国仮出願第６１／４８８，４２１号の優先権を主張するものであり、その出願は参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は一般に、被験試料中の標的分析物を検出するためのイムノアッセイ方法、試薬及びキットに関し、詳細には、非特異的抗原−抗体相互作用を減少させることによって試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの測定を改善するためのイムノアッセイ方法、試薬及びキットに関する。

イムノアッセイ技術は、数十年前から知られており、現在では医学の分野において、被験試料中の標的分析物を検出する様々な診断目的でよく使用されている。イムノアッセイは、抗体がその対応する抗原に高特異的に結合することを利用するものであり、抗原は標的分析物である。典型的には、抗体又は抗原のいずれかの数量化は、放射標識又は蛍光標識などの何らかの形態の標識によって実現されている。サンドイッチイムノアッセイは、試料中の標的分析物を抗体部位（固体担体に結合されていることが多い）に結合させ、捕捉された分析物に標的抗体を結合させ、次いで結合された標識抗体の量を測定することを含む。このアッセイにおいては、分析物が試料中に存在しなければ標識抗体は結合しないので、標識は標的分析物の濃度に比例したシグナルを発生する。

イムノアッセイ方法は、様々な形式のいずれかで実施できる。典型的なヘテロジニアスサンドイッチイムノアッセイ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）は担体として固相を使用し、標的分析物上の少なくとも１つのエピトープと反応性の第１の抗体（捕捉抗体）がこれに結合される。第２の抗体（検出抗体）もまた、標的分析物上の少なくとも１つのエピトープと反応性であり、検出可能な標識にコンジュゲートさせることができ、この標識は、捕捉された標的分析物に検出抗体が結合した後に測定されるシグナルを生じる。

デスカルボキシプロトロンビン（ＤＣＰ）としても知られるＰＩＶＫＡ−ＩＩ（「ビタミンＫ依存性凝固因子前駆体ＩＩ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ−ＩＩ）」）は、肝細胞癌（ＨＣＣ）の診断及び予後の決定に有用な腫瘍マーカーである。ＰＩＶＫＡ−ＩＩは、ビタミンＫ欠乏症又はワルファリンを使用している患者にも存在する。臨床症状が発生する前に診断を確定するためには、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ検出方法の感度が重要となり得る。ＰＩＶＫＡ−ＩＩのイムノアッセイは利用可能であるが、使用される抗体と、試料中に存在する可能性があるＰＩＶＫＡ−ＩＩ以外の抗体との非特異的な結合相互作用が、通常使用されるカットオフレベルあたりで感度及び精度を低減する。

非特異的な抗体／抗原相互作用は、偽陽性の診断結果のリスク及び個人が時宜を得た正確な診断を得られないリスクを増加させる可能性がある。したがって、ＰＩＶＫＡ−ＩＩイムノアッセイの感度及び精度を改善するための方法が必要とされている。

（発明の概要）
一態様において、本開示は、被験試料のＰＩＶＫＡ−ＩＩを測定するための方法であって、スキムミルク、サポニン、ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２及びスルホベタイン両性イオン界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１種の添加剤の存在下で被験試料を抗プロトロンビン抗体と反応させるステップを含む方法を提供する。添加剤は、抗体及び有効量の少なくとも１種の添加剤を含むイムノアッセイ試薬の形態で提供できる。抗体は、例えば、抗プロトロンビンモノクローナル抗体、例えば、ＭＣＡ１−８などを含み得る。

別の態様において、本開示は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩの特異的結合アッセイの感度を改善するための方法であって、特異的結合アッセイが、ＰＩＶＫＡ−ＩＩを特異的に結合し得る第１の抗体に結合されたＰＩＶＫＡ−ＩＩを含む第１の複合体を生成する第１の反応、及び検出可能な標識にコンジュゲートされた、ＰＩＶＫＡ−ＩＩを特異的に結合し得る第２の抗体と第１の複合体を接触させることを含む第２の反応を含み、前記方法が、スキムミルク、サポニン、ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２及びスルホベタイン両性イオン界面活性剤からなる群から選択される少なくとも２種の化合物の有効量を第２の反応に添加するステップを含む方法を提供する。前記方法において、有効量の少なくとも２種の化合物を第２の反応に添加するステップは、例えば、第２の反応に希釈剤を添加することを含むことができ、希釈剤は、第２の抗体及び有効量の少なくとも２種の化合物を含む。第２の抗体は、例えば、抗プロトロンビンモノクローナル抗体、例えば、ＭＣＡ１−８などを含む。

任意の前記方法において、特異的結合アッセイとも称されるイムノアッセイは、固相上で行うことができる。固相は、磁性又は常磁性微小粒子を含み得る。任意の前記方法において、少なくとも２種、少なくとも３種又は少なくとも４種の添加剤を使用できる。例示的な方法において、２種の添加剤を使用し、これらはスキムミルク及びサポニンである。任意の前記方法において、スルホベタイン両性イオン界面活性剤は、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６（ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１８（ｎ−オクタデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）ＡＳＢ−１４（Ａｍｉｄｏｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ−１４）及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）ＡＳＢ−１６（Ａｍｉｄｏｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ−１６）からなる群から選択し得る。例えば、例示的な方法において、スキムミルク、サポニン及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）が、選択される添加剤である。あるいは、選択される添加剤は、スキムミルク、サポニン及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６（ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）であってもよい。別の選択肢において、選択される添加剤は、スキムミルク、サポニン及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１８（ｎ−オクタデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）である。さらに別の選択肢において、選択される添加剤は、スルホベタイン両性イオン界面活性剤並びにＣａＣｌ_２及びＭｇＣｌ_２の一方であり、スルホベタイン両性イオン界面活性剤は、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６（ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１８（ｎ−オクタデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）からなる群から選択される。任意の前記方法において、イムノアッセイは、競合イムノアッセイを含み得る。イムノアッセイは、自動又は半自動測定装置中で実施し得る。イムノアッセイは、例えば、サンドイッチアッセイを含み得る。

別の態様において、本開示は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩの特異的結合アッセイの感度を改善するためのイムノアッセイ試薬であって、スキムミルク、サポニン、ＣａＣｌ_２及びＭｇＣｌ_２並びにスルホベタイン両性イオン界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１種の添加剤の有効量を含む試薬を提供する。イムノアッセイ試薬は、少なくとも２種、少なくとも３種又は少なくとも４種のこれらの添加剤を含み得る。

別の態様において、本開示は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのイムノアッセイを行うためのキットであって、ＰＩＶＫＡ−ＩＩを特異的に結合し得る特異的結合試薬、並びにスキムミルク、サポニン、ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２及びスルホベタイン両性イオン界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１種又は少なくとも２種、少なくとも３種若しくは少なくとも４種の添加剤を含むキットを提供する。キットにおいて、２種以上の添加剤は、イムノアッセイ試薬中で合わせることができる。キットは、被験試料と抗体とを、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種又は少なくとも４種の添加剤の存在下で反応させるための説明書及び被験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を数量化するための説明書をさらに含み得る。キットは、固相をさらに含んでいてもよく、固相は、微小粒子、例えば、磁性又は常磁性微小粒子を含み得る。

標識抗プロトロンビンモノクローナル抗体（ＭＣＡ１−８ＩｇＧ／Ｆ（ａｂ’）２）コンジュゲートを用いる、被験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを測定するためのサンドイッチイムノアッセイ形式の模式図である。 添加剤を含有しないコンジュゲート希釈剤を用いる又はコンジュゲート希釈剤中の添加剤としてサポニン、スキムミルク若しくはＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６を含有する希釈剤を用いる、図１の形式に従って実施されるイムノアッセイの感度を比較する棒グラフである。 添加剤を含有しないコンジュゲート希釈剤を用いる又はコンジュゲート希釈剤中の添加剤としてサポニン、スキムミルク及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６の組合せを含有する希釈剤を用いる、図１の形式に従って実施されるイムノアッセイの感度を比較する棒グラフである。 添加剤を含有しないコンジュゲート希釈剤を用いる又はサポニン、スキムミルク及び試験されるいくつかのスルホベタイン型両性イオン界面活性剤のうちの１つの組合せを含有する希釈剤を用いる、図１の形式に従って実施されるイムノアッセイの感度を比較する棒グラフである。 コンジュゲート中の標識抗体としてＭＣＡ１−８ＩｇＧ、ＭＣＡ１−８Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ３−４７５０ ＩｇＧ若しくはＦ３−６５４２ ＩｇＧのいずれかを用い、及び添加剤を含有しないコンジュゲート希釈剤又はｐＨ５．５及びｐＨ６．０の、３０ｍＭのＣａＣｌ_２若しくは３０ｍＭのＭｇＣｌ_２のいずれかを含有する希釈剤を用いる、図１の形式に従って一般的に実施されるイムノアッセイの感度を比較する棒グラフである。 コンジュゲート希釈剤がコンジュゲート希釈剤への添加剤としてスキムミルクの種々の構成成分のうちの１種を含有する場合に、コンジュゲート中の標識抗体としてＭＣＡ１−８ＩｇＧ又はＭＣＡ１−８Ｆ（ａｂ’）２を用いる、図１の形式に従って実施されるイムノアッセイの感度を比較する２つの棒グラフを含む模式図である。 ７種の金属塩化物塩のうち１種を１５０ｍＭ含有するコンジュゲート希釈剤を用いる、図１の形式に従って実施されるイムノアッセイの感度を比較する棒グラフである。

本開示は、被験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出及び測定するためのイムノアッセイの特異性を改善する、改善されたアッセイ方法、試薬及びキットを提供する。本明細書に記載した方法は１つには、特定の添加剤が、単独で又は組合せて、抗プロトロンビンＭＡｂを含有するコンジュゲート希釈剤中に含まれる場合に、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのイムノアッセイの感度を改善し得るという発見に基づく。特に、添加剤であるスキムミルク、サポニン、スルホベタイン両性イオン界面活性剤、ＣａＣｌ_２及びＭｇＣｌ_２は、単独で又は任意の組合せで使用された場合に、ＰＩＶＫＡ−ＩＩの特定のイムノアッセイの感度を改善することが判明した。

本明細書に記載したアッセイ方法は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩを特異的に結合し得る特異的結合試薬を用いる任意のアッセイ系、例えば、磁性又は常磁性表面などの固相に結合されたこのような結合試薬を用いて行われるイムノアッセイに適用でき、自動及び半自動イムノアッセイ系においても有効に実施できる。

Ａ．定義
このセクション及び本明細書の開示全体において使用されるセクションの表題は、限定的なものではない。

本明細書中で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないことが明白な場合を除き、複数形を含む。本明細書中で数値範囲を記載する場合には、同じ精度でその範囲内の各数値を明確に想定する。例えば、６−９の範囲では、６及び９に加えて数値７及び８を想定し、６．０−７．０の範囲では、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０を明確に想定する。

本明細書中で使用される用語「約」は、表示された値からのほぼ＋／−１０％の変動を指す。このような変動は常に、それが明確に言及されているか否かにかかわらず、本明細書中に示された任意の所与の値に含まれることを理解すべきである。

本明細書中で特に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。

ａ）分析物
本明細書中で使用される用語「分析物」は、試料（即ち、生体試料）中に存在し得る、検出すべき物質を指す。分析物は、天然に存在する特異的結合パートナーを有する又は特異的結合パートナーを調製し得る任意の物質であることができる。したがって、分析物は、イムノアッセイにおいて１種以上の特異的結合パートナーと結合できる物質である。本明細書において記載される分析物の一例は、内在性抗原、これに限定されるものではないが例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩである。ＰＩＶＫＡ−ＩＩは、例えば肝細胞癌（ＨＣＣ）の尺度又はその発症リスクの尺度として評価し得る抗原である。

ｂ）結合パートナー
本明細書中で使用される用語「結合パートナー」は、結合対、即ち、分子の１つが第２の分子に結合する分子の対のメンバーである。互いに特異的に結合する結合パートナーは、「特異的結合パートナー」と称される。イムノアッセイでよく使用される抗原と抗体の結合パートナーに加えて、他の特異的結合パートナーとしては、例えば、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子とレセプター分子、補因子と酵素、酵素阻害剤と酵素などが挙げられる。さらにまた、特異的結合パートナーとしては、元の特異的結合パートナーの類似体であるパートナー、例えば、分析物−類似体を挙げることができる。免疫反応性特異的結合パートナーとしては、抗原、抗原断片、モノクローナル及びポリクローナルの両方の抗体及び抗体断片、並びにそれらの複合体、例えば、組換えＤＮＡ方法によって形成されるものが挙げられる。

ｃ）エピトープ
本明細書中において同義で使用される用語「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ、ｅｐｉｔｏｐｅｓ）」又は「対象のエピトープ」は、認識され及びその特異的結合パートナーの相補的部位に結合し得る任意の分子上の部位を指す。分子と特異的結合パートナーは、特異的結合対の部分である。例えば、エピトープは、ポリペプチド、タンパク質、ハプテン、炭水化物抗原（例えば、これらに限定されるものではないが、糖脂質、糖タンパク質又はリポ多糖）又は多糖であることができ、その特異的結合パートナーは、これに限定されるものではないが、自己抗体であり得る抗体であることができる。典型的には、エピトープは、より大きい抗原断片（即ち、抗体と結合し得る領域又は断片）内に含まれ、特異的結合パートナーと接触することが知られているまさにその残基を指す。抗原断片は、２つ以上のエピトープを含み得る。

ｄ）特異的結合
本明細書中で使用される用語「特異的結合」、「特異性」及び「特異的に結合する」は、対として互いに選択的に反応する能力を有する２つの分子（例えば、抗原と抗体）間の相互作用を特徴付ける。「に特異的に結合する」という表現は、その標的抗原（内在性抗原、例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）に特異的に結合するが、他の実体には特異的に結合しない抗体の能力を指す。分析物に特異的に結合する抗体又は抗体断片は、例えば、診断イムノアッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（「ＲＩＡ」）及び酵素結合免疫吸着測定法（「ＥＬＩＳＡ」））（例えば、Ｐａｕｌ編、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３３２−３３６頁（１９８９年）を参照のこと）、ＢｌＡｃｏｒｅ（登録商標）（スウェーデン）、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄ．）から入手可能）又は当業者に知られている他の技術によって同定し得る。用語「特異的に結合する」は、標的分子／配列に関する結合の優先傾向（例えば、親和性）が、非特異的標的分子（例えば、特異的に認識される部位を欠いているランダムに産生された分子）に比較して、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも１０倍又は少なくとも２０倍であることを示す。

ｅ）固相
本明細書中で使用される「固相」は、不溶性であるか又はその後の反応によって不溶性にされ得る任意の材料を指す。固相は、捕捉剤を引きつけて固定化するその固有の能力で選択し得る。あるいは、固相は、捕捉剤を引きつけて固定化する能力を有する連結剤が固着されていることも可能である。連結剤としては、例えば、捕捉剤自体とは又は捕捉剤にコンジュゲートされている帯電物質とは反対の極性に帯電している帯電物質を挙げることができる。一般に、連結剤は、固相に固定化される（付着される）及び結合反応によって捕捉剤を固定化する能力を有する任意の結合パートナー（好ましくは特異的な）であることができる。連結剤は、アッセイの実施前に又はアッセイの実施中に、固相材料への捕捉剤の間接的な結合を可能にする。固相は、例えば、プラスチック、誘導化プラスチック、磁性又は非磁性金属、ガラス又はケイ素、例えば、試験管、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微小粒子、チップなど、及び当業者に知られている他の立体構造であることができる。

ｆ）微小粒子
本明細書中で使用される用語「微小粒子」は、超遠心分離法によって回収可能な小さい粒子を指す。微小粒子は典型的には、約１ミクロン以下のサイズの平均直径を有する。

ｇ）検出可能な標識
本明細書中で使用される用語「検出可能な標識」は、その部分に結合された１つ以上の分子の状態の変化の光指示、電気指示又は他の物理的指示によって測定可能なシグナルを発生する任意の部分を指す。このような物理的インジケーターは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電磁的、放射化学的及び化学的手段、これらに限定されるものではないが例えば、螢光、化学蛍光、化学発光などを包含する。標識された検出剤に関連して使用される「直接標識」は、任意の手段によって検出剤に付着される検出可能な標識である。標識された検出剤に関連して使用される「間接標識」は、検出剤を特異的に結合する検出可能な標識である。したがって、間接標識は、検出剤の部分の特異的結合パートナーである部分を含む。ビオチン及びアビジンは、ビオチン化抗体を標識アビジンと接触させて、間接的に標識された抗体を生成させることによって使用される、このような部分の例である。好ましい検出可能な標識としては、アクリジニウム化合物、例えば、米国特許第５５４３５２４号、第５，５６５，５７０号、第５，７８３，６９９号、Ｅ−ＰＡ８３０６２９に開示されたようなもの、及びＷＯ２００８／１２４７４９に記載されたアクリジニウム−９−カルボン酸フェニルエステルが挙げられる。指示薬を使用して検出可能な標識と接触させて、検出可能なシグナルを生成してもよい。したがって、例えば、従来の酵素標識において、酵素で標識された抗体を基材（指示薬）と接触させて、検出可能なシグナル、例えば、着色した反応生成物を生成することができる。

ｈ）抗体
本明細書中で使用される「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされる１種以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそれらの断片、並びに免疫グロブリン遺伝子配列から設計された分子を包含する。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κ又はλに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ又はεに分類され、それらはそれぞれ、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを規定する。

典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識を主に担う約１００から１１０個又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。用語「可変軽鎖（ＶＬ）」及び「可変重鎖（ＶＨ）」はそれぞれ、これらの軽鎖及び重鎖を指す。

抗体は、完全型免疫グロブリン（ｉｎｔａｃｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）として、又は種々のペプチダーゼによる消化によって生成された多数の、特徴がはっきりした断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下で抗体を消化して、Ｆａｂの二量体であるＦ（ａｂ’）２を生成する。Ｆａｂ自体は、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に結合された軽鎖である。Ｆ（ａｂ’）２は、穏やかな条件下で還元させて、ヒンジ領域のジスルフィド結合を分解し、それによってＦ（ａｂ’）２二量体をＦａｂ’単量体に変換することができる。Ｆａｂ’単量体は本質的に、ヒンジ領域の部分を有するＦａｂである（他の抗体断片のより詳細な説明については、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９３年）を参照のこと）。種々の抗体断片が完全抗体（ｉｎｔａｃｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の消化によって規定されるが、当業者ならば、このようなＦａｂ’断片を、化学的に又は組換えＤＮＡ方法を利用することによって新たに合成し得ることがわかる。

したがって、本明細書中で使用される用語「抗体」はまた、全抗体（ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の修飾によって生成される又は組換えＤＮＡ方法を用いて新たに合成された抗体断片を含む。好ましい抗体としては、一本鎖抗体（一本鎖ポリペプチドとして存在する抗体）、より好ましくは、可変重鎖及び可変軽鎖が結合されて（直接又はペプチドリンカーを介して）連続ポリペプチドを形成している一本鎖Ｆｖ抗体（ｓＦｖ又はｓｃＦｖ）が挙げられる。一本鎖Ｆｖ抗体は、共有結合によって連結されているＶＨ−ＶＬヘテロ二量体であり、直接結合されている又はペプチドコードリンカーによって結合されているＶＨ−及びＶＬ−コード配列を含む核酸から発現させることができる。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８年）ＰＲＯＣ．ＮＡＴ．ＡＣＡＤ．ＳＣｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９−５８８３頁。ＶＨ及びＶＬは一本鎖ポリペプチドとして互いに接続され、ＶＨドメインとＶＬドメインは非共有結合によって会合する。ｓｃＦｖ抗体、及び抗体Ｖ領域からの、天然では凝集しているが化学的に分離された軽ポリペプチド鎖及び重ポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造と実質的に類似した三次元構造に折り畳まれた分子に変換する多くの他の構造は、当業者に知られている（例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、第５，１３２，４０５号及び第４，９５６，７７８号を参照のこと）。

ｉ）被験試料
本明細書中で使用する用語「被験試料」は一般に、標的分析物、即ち、対象の分析物、例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩについて試験される及び／又はそれを含有することが疑われる生物材料を指す。生物材料は、任意の生物源に由来し得るが、好ましくは、標的分析物を含有する可能性が高い生体液である。生物材料の例としては、対象の分析物を含有し得るであろう、便、全血、血清、血漿、赤血球、血小板、気管支洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｌａｖａｇｅ）、骨髄穿刺液、胸水、間質液、唾液、接眼レンズ液、脳脊髄液、汗、尿、腹水液、粘液、鼻汁、痰、滑液、腹水、膣液、月経分泌物、羊水、精液並びに腫瘍組織又は任意の他の身体構成成分若しくは任意の組織培養上清が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載された方法の例示的な被験試料は、全血、血清又は血漿に由来する。被験試料は、ルーチン方法によって、これらに限定されるものではないが例えば、静脈穿刺、組織生検、例えば、針生検、スワブ、ワイプ及び体液採取によって得ることができる。被験試料は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトから得られる。

被験試料は、生物源から得られたまま直接使用してもよいし、試料の性質を変更するための前処理後に使用してもよい。例えば、このような前処理としては、血液からの血漿の調製、粘稠な体液の希釈などを挙げることができる。前処理の方法はまた、遠心分離、濾過、沈殿、希釈、蒸留、混合、濃縮、干渉構成要素の不活性化、試薬の添加、溶解などを含み得る。このような前処理方法が被験試料に関して使用される場合には、このような前処理方法は、標的分析物が、未処理被験試料（例えば、即ち、このような前処理方法に供されていない被験試料）中における濃度と比例した濃度で被験試料中に残るようなものである。

Ｂ．ＰＩＶＫＡ−ＩＩのイムノアッセイ
ｉ．イムノアッセイ
ＰＩＶＫＡ−ＩＩは、患者の肝細胞がん（ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ）（肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）又はＨＣＣとも称される）の臨床診断の一部として測定されることが多い。典型的には、ＰＩＶＫＡ−ＩＩは、血清又は血漿試料から測定し、イムノアッセイに供する。イムノアッセイは、例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ特異的モノクローナル又はポリクローナル抗体が吸着される固相上で、例えば、電磁ビーズ、ガラスビーズ、プラスチックプレート、ラテックスなどの上で実施し得る。次に、コーティングされた固相を血清又は血漿で接触させて第１の反応を引き起こし、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原と抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体との複合体を形成する。結合抗原対遊離抗原（Ｂ／Ｆ）を分離するための反応混合物の洗浄後、検出可能な標識、これらに限定されるものではないが例えば、酵素、蛍光材料又は放射性同位体で標識されたヒトプロトロンビン特異的ポリクローナル又はモノクローナル抗体を添加することによって第２の反応を実施する。Ｂ／Ｆ分離のための２回目の洗浄後、抗原抗体反応によって形成された免疫複合体に結合された検出可能な標識の吸光度又は発光を測定して、血清又は血漿中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を決定する。

特にプロトロンビン特異的抗体の、試料中に存在し得るＰＩＶＫＡ−ＩＩ以外の抗原との非特異的相互作用は、前記アッセイを妨げ、その感度を低減する可能性がある。抗体の不純物、トロンビンの目標抗原（ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）との類似性のため、又は擬陽性の検出、したがって不正確な測定を生じ得る、固相（電磁ビーズ、ガラスビーズなど）への他の抗原の物理的吸着のため、非特異的な相互作用が起こり得る。

本明細書に記載されるように、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのイムノアッセイの感度及び特異性は、イムノアッセイ試薬中に特定の添加剤を含めることによって改善し得る。したがって、本開示は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのイムノアッセイの感度を改善するための方法を提供する。これらの方法において、添加剤は、スキムミルク、サポニン、ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２及びスルホベタイン両性イオン界面活性剤から選択される少なくとも１種を含む。ＰＩＶＫＡ−ＩＩを含有し得る被験試料を、ＰＩＶＫＡ−ＩＩを特異的に結合し得る抗プロトロンビン抗体と接触させるイムノアッセイ反応に、この１種以上の添加剤を添加する。感度の最良の改善を得るために、少なくとも２種又は少なくとも３種の添加剤がアッセイに使用される。添加剤は反応に別個に添加してもよいし、アッセイ希釈剤などの単一組成物で、特に例えば、標識抗プロトロンビン抗体、例えば、サンドイッチアッセイ形式において検出試薬として使用されるモノクローナル抗体を含有するコンジュゲート希釈剤で、提供してもよい。したがって、本明細書に記載したＰＩＶＫＡ−ＩＩイムノアッセイ方法において、試料の実質的な希釈にも頼らず、大量のアッセイ緩衝液も使用せずに、被験試料中に存在し得る物質を阻害する影響を阻害又は排除することが可能である。同時に、改善されたＰＩＶＫＡ−ＩＩイムノアッセイは、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの感度及び信頼度の高い測定を簡単に及び簡便に提供する。これは、イムノアッセイが、全自動又は半自動系で実施される及び大量の試料が短期間で試験される場合に特に有利である。

本明細書に記載された方法はＰＩＶＫＡ−ＩＩイムノアッセイ、試薬及びキットに関連するが、これらの方法は、これらの方法をより一般的に、他の標的分析物のイムノアッセイに適用し得ること、及び被験試料と対象の抗原に対する抗体とを反応させるときに、本明細書中に記載された少なくとも１種の添加剤を含ませると、被験試料中の他の標的分析物の測定感度を改善できることが期待される。

本開示の方法はまた、種々のイムノアッセイ形式のいずれにも適用し得る。これらの形式は、分析物である抗原（例えば、ＰＩＶＫＡ−Ｉ１）が抗プロトロンビン抗体と反応する特異的結合反応に本明細書に記載された１種以上の添加剤を含ませるように簡単に変更される。イムノアッセイの一般的な総説については、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ ３７巻：ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＩＮ ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｓａｉ編Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３年）並びにＢＡＳＩＣ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ 第７版、Ｓｔｉｔｅｓ及びＴｅｒｒ編（１９９１年）（これらの開示全体を、参照により本明細書に組み込む）を参照のこと。本明細書に記載された方法は、感度が非特異的相互作用によって負の影響を受ける可能性がある特異的抗原抗体反応を利用するならば、任意のイムノアッセイ形式に適用し得る。したがって、ルーチン的に使用される任意のイムノアッセイ形式、これらに限定されるものではないが例えば、競合イムノアッセイ形式及び非競合イムノアッセイ形式、例えば、サンドイッチ形式に適用し得る。非競合イムノアッセイにおいて、分析物の量は、抗体に結合された分析物の量の、被験試料中に存在する分析物の濃度との既知の正相関に従って測定し得る。

イムノアッセイは、標的分析物／抗原、例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する結合パートナーである捕捉剤を使用し得る。本開示のイムノアッセイ方法に有用な捕捉剤は、標的分析物（例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）に結合するもの、例えば、標的分析物に特異的な抗体を含む。捕捉剤は、固相に付着させることができる。固相が使用される場合には、固相に付着された捕捉剤が標的分析物に結合すると、固相に付着された複合体が形成される。特異的結合パートナーである標識検出剤も使用できる。特異的結合パートナーは、例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩなどの標的分析物を特異的に結合し得る抗体であり、検出可能な標識（これらに限定されるものではないが例えば、酵素、蛍光材料又は放射性同位体）で直接的に又は間接的に標識されている。検出剤中の特異的結合パートナーは、例えば、抗プロトロンビン抗体であることができ、それは例えば、抗プロトロンビンモノクローナル抗体であることができる。検出試薬と固相に付着された複合体が反応すると、標的分析物が２つの抗体試薬の間に結合されている「サンドイッチ」が形成される。結合された実体は、必要ならば、遊離標識抗体から、典型的には洗浄によって分離され、結合標識からのシグナルが、反応性抗体に結合された抗体を含む複合体の検出によって検出／数量化される。サンドイッチイムノアッセイの例示的な形式において、分析物の検出は、固相に付着された複合体からのシグナルの検出を含む。

図１は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩを測定するための例示的なイムノアッセイ形式を示す。この形式において、ＰＩＶＫＡ−ＩＩは、２段階の化学発光サンドイッチ形式によって測定される。例えば、標的分析物、例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩを含有する被験試料（「検体」）は第１の抗体と接触し、第１の抗体は標的分析物を捕捉する。図１で示されるように、第１の抗体は、例えば、抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩモノクローナル抗体、例えば、米国特許出願第１２／４０１，３６１号（米国特許出願公開第２０１０／０２３３１７５号として公開されている）に記載されている３Ｃ１０であってもよい。第１の抗体は場合によって、図１に示されるように、微小粒子などの固相にコーティングされている。洗浄により遊離非結合抗原を除去した後、第１の複合体が、第１の抗体に結合された標的分析物（即ち、抗原、例えばＰＩＶＫＡ−ＩＩ）よって形成される。次に、第１の複合体が、ＰＩＶＫＡ−ＩＩを特異的に結合し得る標識された第２の抗体と接触させる。図１に示されるように、ヒトプロトロンビン特異的抗体、好ましくは本明細書の他の場所に記載された検出可能な標識で標識されたモノクローナル抗体を添加することによって、第２の反応を実施し得る。図１で示されるように、例えば、抗プロトロンビン抗体は抗プロトロンビンモノクローナル抗体ＭＣＡ１−８ＩｇＧ（Ａｔｔｏ Ｍｏｌ Ｉｎｃ．、東京都豊島区西池袋３−２３−７西池サンケイビル５階（日本）から入手可能）、又はＭＣＡ１−８Ｆ（ａｂ’）２であることができ、標識はアクリジニウム化合物であることができる。標識された第２の抗体の第１の複合体への結合が起こるのに十分な時間を取った後、得られた第２の複合体は、第１の抗体、抗原（標的分析物ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）及び場合によって固相に結合された第２の抗体からなる。第２の洗浄により非結合抗原を除去後、シグナル、例えば、検出可能な標識によって発生される吸光度又は発光が測定される。この場合、標識された第２の抗体によって発生されるシグナルは、免疫検出複合体（ｋ２）の解離速度に対する免疫検出複合体の形成速度（ｋ１）によって決定される標的分析物の濃度に比例する。

例えばＰＩＶＫＡ−ＩＩを含む分析物は、競合イムノアッセイでも測定し得る。この場合、シグナルは、被験試料中に存在する分析物の濃度と逆相関する。例示的な競合形式において、被験試料は抗体と接触させるが、抗体は固相に付着されていてもいなくてもよく、被験試料は競合標識抗原とも接触させる。標識抗原は、間接的に標識しても、直接的に標識してもよい。このステップは、抗体への標識抗原及び分析物抗原の特異的結合に十分な条件下で実施される。標識抗原及び分析物抗原は、抗体への結合に関して互いに競合する。したがって、被験試料中の分析物抗原（例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）のレベルが高いほど、抗体への標識抗原の結合が少ない。被験試料は、標識抗原及び抗体と同時に又は逐次的に、任意の順序で接触させることができる。この型の競合イムノアッセイは、固相に付着された抗体を用いても簡便に実施し得る。この場合、被験試料中に存在する分析物抗原の抗体への結合は、固相に付着された複合体を形成し、検出は、固相に付着された複合体からのシグナルの検出を伴う。結合された実体は、必要ならば、遊離標識抗原から、典型的には洗浄によって分離され、あらゆる結合標識（分析物抗原に取って代わる）からのシグナルが検出される。

本明細書に記載されたＰＩＶＫＡ−ＩＩイムノアッセイの感度を改善するために、ＰＩＶＫＡ−ＩＩイムノアッセイは、ＰＩＶＫＡ−ＩＩを含有することが疑われる被験試料とＰＩＶＫＡ−ＩＩを特異的に結合し得る抗体とを、本明細書に記載した１種以上の添加剤の存在下、被験試料中に存在するあらゆるＰＩＶＫＡ−ＩＩに抗体を結合させるのに十分な条件下で接触させることによって変更し得る。ＰＩＶＫＡ−ＩＩは、反応性抗体に結合されたＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を含む複合体を検出することによって、検出／数量化される。

後述される選択添加剤をイムノアッセイ希釈剤に添加すると、背景の非特異的結合を低減し、抗原抗体相互作用を増強することができる。本明細書に記載されるように、添加剤を使用すると、ＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイの感度を改善できる。本明細書に記載されたイムノアッセイにおいて単独で又は組合せて使用し得る添加剤としては、スキムミルク、サポニン、ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２及びスルホベタイン両性イオン界面活性剤が挙げられる。任意のスルホベタイン型界面活性剤、これらに限定されるものではないが例えば、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１４、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）ＡＳＢ−１４及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）ＡＳＢ−１６の名称で販売されているそれらのスルホベタイン界面活性剤、好ましくは、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１４、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１８を使用し得る。例示的な方法において、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６が使用される。参照の都合上、文献中における慣行を踏まえて、これらのスルホベタイン界面活性剤を指すために、本明細書中では商品名が使用されるが、それらの対応する化学名は、以下の通りである。

Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−８ ３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホネート
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１０ ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１２ Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネート
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１４ ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６ ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１８ ｎ−オクタデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）からＡｎｚｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１８としても販売されている）
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）ＡＳＢ−１４ 「Ａｍｉｄｏｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ−１４」；３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ］プロパンスルホネート
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）ＡＳＢ−１６ 「Ａｍｉｄｏｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ−１６」。

ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｇｒｏｕｐ ｏｆ Ｍｅｒｃｋ ＣｈｅｍｉｃａｌｓによってＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）の名称で販売されているＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標）ブランドの合成両性イオンブランド界面活性剤を含むスルホベタイン型両性イオン界面活性剤が、複数の商業的供給源から入手可能である。Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）型界面活性剤はまた、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む複数の他の商業的供給源から及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）からＡｎｚｅｒｇｅｎｔ（登録商標）の名称で入手可能である。ＡＳＢ界面活性剤はまた、例えば、Ｍ．Ｃｈｅｖａｌｌｅｔら、ＥＬＥＣＴＲＯＰＨＯＲＥＳＩＳ１９：１９０１（１９９８年）にも記載されている。

「スキムミルク」は、クリームが除去されることによりバター脂を１％未満しか含有しないあらゆる牛乳を指す。サポニンは、制御された製造方法によって調製されたあらゆる市販の植物由来サポニン、例えば、シャボンノキ（ｓｏａｐ ｂａｒｋ ｔｒｅｅ）（キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ））及び他の供給源から作られたもの並びに例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及びＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）から入手可能なものなどであることができる。サポニンは典型的には、結晶性粉末として提供される。添加剤として含まれる場合、各添加剤の量は下記表１に示される。表１において、あらゆる固体（例えば、粉末の）添加剤の量は％ｗ／ｖとして示され、液体添加剤の量は％ｗ／ｖ又は％ｖ／ｖを含む。

ｉｉ．抗体
本明細書に記載されるイムノアッセイ方法において有用な抗体としては、ポリクローナル及びモノクローナル抗体が挙げられる。ポリクローナル抗体は、好適な非ヒト哺乳動物（例えば、マウス又はウサギ）に免疫原を注射（例えば、皮下注射又は筋肉内注射）することによって産生される。一般に、免疫原は、標的抗原に対して比較的高い親和性を有する高力価の抗体の産生を誘発するはずである。

これらの方法は、抗体が対象の分析物（例えばＰＩＶＫＡ−ＩＩ）との特異的反応性を示しさえすれば、ポリクローナル若しくはモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、親和性成熟抗体（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）若しくは前記抗体の断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦａｂ’２断片）、又はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び活性部位のみが遺伝子組換えによって取り出された抗体断片の組合せを含む試薬を利用するイムノアッセイに適用し得る。当業者ならば、抗体が多数の商業サービスのいずれか（例えば、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｎａｗａ、Ｅｕｒｏｇｅｎｅｔｅｃなど）によって調製され得ることが容易にわかる。使用される抗体は好ましくは、ＰＩＶＫＡ−ＩＩを認識可能なものであり、抗プロトロンビン抗体を含み得る。

多くの用途に関して、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が好ましい。ｍＡｂを分泌するハイブリドーマの生成に使用される一般的な方法がよく知られている（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５）。簡潔には、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎによって記載されているように、この技術は、黒色腫、奇形癌又は子宮頚がん、神経膠腫若しくは肺がんのいずれかを有する５人の異なる患者の流入領域リンパ節（ｒｅｇｉｏｎａｌ ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）（試料は外科手術検体から得られた）からリンパ球を単離し、細胞をプールし、細胞をＳＨＦＰ−１と融合させることを含む。ハイブリドーマが、がん細胞株に結合された抗体の生成についてスクリーニングされる。ｍＡｂの間の特異性の確認は、ルーチンスクリーニング技術（例えば、酵素結合免疫吸着測定法又は「ＥＬＩＳＡ」）を用いて対象のｍＡｂの素反応のパターンを決定することによって行うことができる。

モノクローナル抗体は分析物／抗原に対して特異性が高く、一方、ポリクローナル抗体は好ましくは、可能な限り多くの分析物／抗原を固定化するための各捕捉抗体として使用し得る。その場合には、分析物／抗原に対して本質的により高い結合特異性を有するモノクローナル抗体は好ましくは、各検出抗体として使用し得る。いずれにせよ、捕獲抗体及び検出抗体が使用される場合には、いずれも、標的分析物上の非オーバーラップのエピトープを認識し、好ましくは、標的分析物上の異なるエピトープに同時に結合でき、いずれも他方の結合を妨げない。

ポリクローナル抗体は、好適な非ヒト哺乳動物（例えば、マウス又はウサギ）に免疫原を注射（例えば、皮下注射又は筋肉内注射）することによって産生される。一般に、免疫原は、標的抗原に対して比較的高い親和性を有する高力価の抗体の産生を誘発するはずである。所望ならば、抗原は、当技術分野においてよく知られているコンジュゲート技術によって、キャリアタンパク質にコンジュゲートさせることができる。よく使用されるキャリアとしては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び破傷風トキソイドが挙げられる。この場合、コンジュゲートが、動物の免疫化に使用される。次いで、抗体が、動物から採取された血液試料から得られる。ポリクローナル抗体の生成に使用される技術は、文献に詳細に記載されている（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｒａ ｗｉｔｈ Ｓｍａｌｌ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｌａｎｇｏｎｅら編（Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ、１９８１年）を参照のこと）。動物によって産生されたポリクローナル抗体は、例えば、標的抗原が結合されているマトリックスに結合させ、それから溶離させることによって、さらに精製し得る。当業者ならば、ポリクローナル抗体及びモノクリーナル抗体の精製及び／又は濃縮のための、免疫学の技術分野において一般的な種々の技術について承知している（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（１９９１年）Ｕｎｉｔ９、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅを参照のこと）。

所望ならば、内在性抗原（即ち、対象の分析物）は、当技術分野においてよく知られているコンジュゲート技術によってキャリアタンパク質にコンジュゲートさせることができる。よく使用されるキャリアとしては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び破傷風トキソイドが挙げられる。この場合、コンジュゲートが、動物の免疫化に使用される。

次いで、抗体が、動物から採取された血液試料から得られる。ポリクローナル抗体の産生に使用される技術は、文献に詳細に記載されている（例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｒａ ｗｉｔｈ Ｓｍａｌｌ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｌａｎｇｏｎｅら編（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ、１９８１年）を参照のこと）。動物によって産生されたポリクローナル抗体は、例えば、標的抗原が結合されているマトリックスに結合させて、それから溶離させることによって、さらに精製し得る（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（１９９１年）を参照のこと）。

本明細書中で使用される用語「抗体」は、抗原結合抗体断片、例えば、ファージディスプレイ技術又は酵母ディスプレイ技術を用いて産生／選択し得る一本鎖抗体（ｓｃＦｖなど）を包含する。細菌に感染するウイルス（バクテリオファージ又はファージ）の表面で抗体断片を発現できれば、結合一本鎖抗体断片を、例えば、１０１０種超の非結合クローンのライブラリーから単離することが可能になる。抗体断片をファージ表面で発現するために（ファージディスプレイ）、抗体断片遺伝子が、ファージ表面タンパク質（例えば、ｐＩＩＩ）をコードする遺伝子に挿入され、抗体断片遺伝子−ｐＩＩＩ融合タンパク質がファージ表面でディスプレイされる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０年）ＮＡＴＵＲＥ ３４８：５５２−５５４頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１年）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．１９：４１３３−４１３７頁）。

ファージ表面の抗体断片は官能性であるので、ファージ担持抗原−結合抗体断片は、抗原アフィニティークロマトグラフィーによって非結合ファージから分離することができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０年）ＮＡＴＵＲＥ３４８：５５２−５５４頁）。抗体断片の親和性に応じて、１回の親和性選択当たり２０倍−１，０００，０００倍の濃縮係数（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ）が得られる。しかし、溶出ファージを細菌に感染させることによって、より多くのファージを増殖させることができ、もう１回選択に供することができる。このようにして、１回で１０００倍の濃縮が、２回の選択で１，０００，０００倍となり得る（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０年）ＮＡＴＵＲＥ３４８：５５２−５５４頁）。したがって、低濃縮であっても（Ｍａｒｋｓら（１９９１年）Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．２２２：５８１−５９７頁）、複数回の親和性選択により、稀少なファージの単離が可能となる。抗原上におけるファージ抗体ライブラリーの選択は濃縮をもたらすので、クローンの大部分が、わずか３から４回の選択後に抗原を結合する。したがって、抗原への結合については、比較的少数のクローン（数百）の分析で十分である。

ヒト抗体は、非常に大きい様々なＶ−遺伝子レバートリーをファージ上でディスプレイすることによって、事前に免疫化を行わずに産生させることができる（Ｍａｒｋｓら（１９９１年）Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．２２２：５８１−５９７頁）。一実施形態において、ヒト末梢血リンパ球中に存在する天然のＶＨ及びＶＬレパートリーは、免疫化されていないドナーからＰＣＲによって単離される。Ｖ−遺伝子レパートリーは、ＰＣＲを用いて無作為に一緒にスプライシングして、ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーを作製することができ、これを、ファージベクターにクローニングして、３０００万個のファージ抗体を作製することができる（同文献）。単一の「ナイーブな」ファージ抗体ライブラリーから、結合抗体断片が、ハプテン、多糖及びタンパク質を含む１７種の異なる抗原に対して単離されている（Ｍａｒｋｓら（１９９１年）Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．２２２：５８１−５９７頁；Ｍａｒｋｓら（１９９３）．ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ１０：７７９−７８３頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３年）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）ＮＡＴＵＲＥ３５２：６２４−６２８頁）。ヒトチログロブリン、免疫グロブリン、腫瘍壊死因子及びＣＥＡを含む自己タンパク質に対して、抗体が産生されている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３年）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４頁）。抗体断片は、選択に使用された抗原に対して特異性が高く、１ｎＭから１００ｎＭの範囲で親和性を有する（Ｍａｒｋｓら（１９９１年）Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．２２２：５８１−５９７頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３年）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４頁）。大きいファージ抗体ライブラリーほど、より大きい割合の抗原に対してより高い結合親和性を有するより多くの抗体の単離をもたらす。

当業者に理解されるように、抗体は、多数の商業サービスのいずれか（例えば、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｎａｗａ、Ｅｕｒｏｇｅｎｅｔｅｃなど）によっても調製し得る。

ｉｉｉ．固相
本開示によるイムノアッセイは、捕捉剤のための担体として、固相を使用し得る。固相は、捕捉剤を結合するのに十分な表面親和性を有する任意の好適な材料であることができる。有用な固体担体としては、天然ポリマー炭水化物並びに合成によって修飾、架橋又は置換されたそれらの誘導体、例えば、寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換及び架橋グアーガム、セルロースエステル、特に硝酸及びカルボン酸とのセルロースエステル、混合セルロースエステル及びセルロースエーテル；窒素を含有する天然ポリマー、例えば、タンパク質及び誘導体、例えば、架橋又は修飾ゼラチン；天然炭化水素ポリマー、例えば、ラテックス及びゴム；合成ポリマー、例えば、ビニルポリマー、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル及びその部分加水分解誘導体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、前記重縮合物のコポリマー及びターポリマー、例えば、ポリエステル、ポリアミド、並びに他のポリマー、例えば、ポリウレタン又はポリエポキシド；無機材料、例えば、アルカリ土類金属及びマグネシウムの硫酸塩又は炭酸塩、例えば、硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アルミニウム及びマグネシウムのケイ酸塩；並びにアルミニウム又はケイ素の酸化物又は水和物、例えば、クレイ、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲル又はガラス（これらの材料は、前記ポリマー材料と共にフィルターとして使用し得る）；並びに前記種類の混合物又はコポリマー、例えば、既存の天然ポリマー上において合成ポリマーの重合を開始することによって得られるグラフトコポリマーが挙げられる。これらの材料は全て、好適な形状、例えば、フィルム、シート、チューブ、微粒子又はプレートで使用してもよいし、適切な不活性キャリア、例えば、紙、ガラス、プラスチックフィルム、布などにコーティング、結合又は積層してもよい。

ニトロセルロースは、モノクローナル抗体を含む様々な試薬に対する優れた吸収性及び吸着性を有する。ナイロンもまた、同様な特性を有し、これもまた好適である。

フロースルーアッセイ装置に好ましい固相材料としては、濾紙、例えば、多孔質ガラス繊維材料又は他の繊維マトリックス材料が挙げられる。このような材料の厚さは重要ではなく、選択の余地があり、アッセイされる被験試料又は分析物の性質、例えば、被験試料の流動性に主に基づく。

あるいは、固相は、微小粒子を構成することもできる。本開示において有用な微小粒子は、当業者ならば、任意の好適な型の微粒子材料から選択でき、それらの例としては、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート、ポリプロピレン、ラテックス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート又は同様な材料から構成されるものが挙げられる。さらに、微小粒子は、磁場内における微小粒子の操作を容易にするような磁性又は常磁性微小粒子であることができる。

微小粒子は、可溶性試薬と被験試料との混合物中に懸濁させることもできるし、担体材料によって保持及び固定化することもできる。後者の場合、担体材料上又は担体材料中の微小粒子は、担体材料内の他の場所への移動がほとんどできない。あるいは、可溶性試薬と被験試料との混合物中の微小粒子は、懸濁液から沈降又は遠心分離によって分離することもできる。微小粒子が磁性又は常磁性微小粒子である場合には、可溶性試薬と被験試料との混合物中の微小粒子は、磁場によって懸濁液から分離できる。

本発明の方法は、微小粒子技術を利用する系、例えば、固相が微小粒子を含む自動及び半自動系での使用に適合させることができる。このような系としては、係属出願である米国出願第４２５，６５１号及び米国特許第５，０８９，４２４号（公開されたＥＰＯへの出願であるＥＰ０４２５６３３及びＥＰ０４２４６３４にそれぞれ対応）、並びに米国特許第５，００６，３０９号に記載されているものが挙げられる。

固相は、１つ以上の電極を含むことができる。捕捉剤は、電極に直接的又は間接的に固着させることができる。一実施形態において、例えば、捕捉剤は、磁性又は常磁性微小粒子に固着させることができる。磁性又は常磁性微小粒子は次に、磁石を用いて電極表面の近傍に位置させる。１つ以上の電極が固相として機能する系は、検出が電気化学相互作用に基づく場合に有用である。この型の例示的な系は、例えば、米国特許第６，８８７，７１４号に記載されている。電気化学的な検出に関する基本的な方法は、以下に詳述する。

捕捉剤は、疎水性力によって保持される場合には、吸着によって固相に付着させることができる。あるいは、固相の表面は、担体への捕捉剤の共有結合による連結を引き起こす化学的な方法によって活性化させることもできる。

固相に固有の電荷を変化又は増大させるために、固相に帯電物質を直接的にコーティングすることができる。米国出願第１５０，２７８号（欧州特許出願公開第０３２６１００号に対応）及び米国出願第３７５，０２９号（欧州特許出願公開第０４０６４７３号に対応）に記載されている、固定化可能な反応複合体を負に帯電したポリマーによって固定化するためのイオン捕捉操作を、本発明に従って使用して、迅速な液相免疫化学反応を行うことができる。これらの操作において、固定化可能な免疫複合体は、負に帯電したポリアニオン／免疫複合体と前処理された正に帯電したマトリックスとのイオン相互作用によって残りの反応混合物から分離され、多くのシグナル発生系のいずれか、例えば、米国出願第９２１，９７９号（欧州特許出願公開第０２７３，１１５号に対応）に記載されている化学発光系を用いて検出される。

固相がケイ素又はガラスである場合には、表面は一般に、特異的結合パートナーへの付着前に活性化させなければならない。活性化されたシラン化合物、例えば、トリエトキシアミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）から入手可能）、トリエトキシビニルシラン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．）及び（３−メルカプトプロピル）−トリメトキシシラン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））を使用して、それぞれアミノ−、ビニル及びチオールなどの反応性基を導入することができる。このような活性化された表面を使用して、捕捉剤を直接連結することもできるし（アミノ又はチオールの場合）、活性化された表面をリンカー、例えば、グルタルアルデヒド、ビス（スクシンイミジル）スベレート、ＳＰＰＤ（スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＳＩＡＢ（スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート）及びＳＭＰＢ（スクシンイミジル４−［１−マレイミドフェニル］ブチレート）とさらに反応させて、捕捉剤を表面から分離させることもできる。ビニル基を酸化させて、共有結合による付着のための手段を提供することができる。ビニル基は、特異的捕捉剤に多数の付着点を提供し得る、ポリアクリル酸などの種々のポリマーの重合のためのアンカーとしても使用できる。アミノ基を種々の分子量の酸化デキストランと反応させて、サイズ及び能力の異なる親水性リンカーを提供することができる。被酸化性デキストランの例としては、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−４０（分子量４０，０００ダルトン）、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−１１０（分子量１１０，０００ダルトン）、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−５００（分子量５００，０００ダルトン）、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−２Ｍ（分子量２，０００，０００ダルトン）（これらは全て、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）から入手可能である）、又はＦｉｃｏｌｌ（分子量７０，０００ダルトン；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，、Ｍｏ．）から入手可能）が挙げられる。加えて、高分子電解質相互作用を使用して、１９８８年１月２９日出願された米国出願第１５０，２７８号及び１９８９年７月７日に出願された米国出願第３７５，０２９号（これらはいずれも、参照により本明細書に組み込む）に記載された技術及び化学反応を用いて、特異的捕捉剤を固相に固定化することもできる。

固相の選択に影響を及ぼす他の考慮事項には、標識された実体の非特異的な結合を最小化できること及び使用される標識系との適合性が含まれる。例えば、蛍光標識と共に使用される固相は、シグナル検出を可能にするよう十分に低バックグラウンド蛍光を有するべきである。特異的捕捉剤の付着後、固体担体の表面を、血清、タンパク質又は他の遮断剤などの材料でさらに処理して、非特異的な結合を最小限に抑えることができる。

ｉｖ．検出可能な標識
前述のように、本開示による多くのイムノアッセイは、標識された検出剤、例えば、標識抗体又は標識抗原を使用する。

本発明の検出剤に使用するのに好適な検出可能な標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的及び化学的手段によって検出可能な任意の組成物を含む。本発明において有用な標識としては、電磁ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光染料（例えば、フルオレセイン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ（Ｏｒｅｇ．、ＵＳＡ）を参照のこと）、化学発光化合物、例えば、アクリジニウム（例えば、アクリジニウム−９−カルボキサミド）、フェナントリジニウム、ジオキセタン、ルミノールなど、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ又は３２Ｐ）、触媒、例えば、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいてよく使用される西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど）、及び比色標識（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｌａｂｅｌ）例えば、コロイド金（例えば、粒径範囲４０−８０ｎｍの金粒子は、緑色光を高効率で散乱させる）又は着色ガラス若しくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズが挙げられる。このような標識の使用を教示している特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号及び第４，３６６，２４１号が挙げられる。

標識は、被験試料との接触前又は接触中又は接触後に、検出剤に付着させることができる。いわゆる「直接標識」は、アッセイへの使用前に検出剤に直接付着される又は組み込まれる検出可能な標識である。直接標識は、当業者によく知られている多数の手段のうちのいずれかによって検出剤に付着させる又は組み込むことができる。

一方、いわゆる「間接標識」は典型的には、アッセイ中のある点において検出剤と結合する。多くの場合、間接標識は、使用前に検出剤に付着される又は組み込まれる部分と結合する。したがって、例えば、検出剤として使用される抗体（「検出抗体」）は、アッセイにおいて使用する前にビオチニル化することができる。アッセイ中に、アビジンコンジュゲートフルオロフォアは、ビオチンを有する検出剤を結合して、容易に検出される標識を生成できる。間接標識の別の例において、免疫グロブリン定常領域を特異的に結合し得るポリペプチド、例えば、ポリペプチドＡ又はポリペプチドＧもまた、検出抗体用の標識として使用できる。これらのポリペプチドは、連鎖球菌細菌の細胞壁の標準的な構成成分である。これらは、種々の種に由来する免疫グロブリン定常領域と強い非免疫性の反応性を示す（例えば、Ｋｒｏｎｖａｌら（１９７３年）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．、１１１：１４０１−１４０６及びＡｋｅｒｓｔｒｏｍ（１９８５年）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．、１３５：２５８９−２５４２を参照のこと）。したがって、このようなポリペプチドは、検出抗体及び種特異的抗体に結合する場合には、標識してアッセイ混合物に加えることにより、両者を標識し、被験試料中に存在する分析物及び自己抗体に起因する複合シグナルを生じることができる。

本開示において有用な一部の標識には、検出可能なシグナルを生成するのに指示薬の使用が必要なことがある。ＥＬＩＳＡにおいて、例えば、酵素標識（例えば、β−ガラクトシダーゼ）は、検出可能なシグナルの生成に基質（例えば、Ｘ−ｇａｌ）の添加を必要とする。

本発明は、例えば、いくつかの異なる抗原に対してサンドイッチイムノアッセイを行う、共同所有されている市販のＡｂｂｏｔｔ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標））電気化学的イムノアッセイ系に適用できる（例えば、適合できる）。免疫センサー及び単回使用試験装置におけるそれらの操作方法は、共有にかかる米国特許出願公開第２００３０１７０８８１号、米国特許出願公開第２００４００１８５７７号、米国特許出願公開第２００５００５４０７８号及び米国特許出願公開第２００６０１６０１６４号（これらのいずれも、参照により本明細書に組み込む）に記載されている。電気化学な及び他の型の免疫センサーの製造のさらなる背景は、共有にかかる米国特許第５，０６３，０８１号（参照により本明細書に組み込む）に見出される。

本開示は、１つの被験試料中の複数の分析物を同時に測定するための多重イムノアッセイ形式にも適用し得る。例えば、固相は、内在性抗原又は対象の分析物（例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）を捕捉する捕捉剤を含む複数の異なる捕捉剤を含み得る。したがって、例えば、固相には、複数の抗体を固着させることができ、各抗体は、被験試料中の異なる分析物（例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ及び他の内因性分析物）の存在を試験するよう意図される。例示的な実施形態において、固相は、表面の複数の異なる領域からなることができ、各領域には特定の抗体が固着されている。

マルチプレックス形式は、複数の標識を使用できるが必要ではなく、各標識は特定の抗原の検出に使用される。例えば、複数の捕捉剤（例えば、異なる特異性を有する抗体）が固相の異なる既知の位置に固着されている場合には、複数の異なる分析物を、複数の標識を用いずに検出できる。各位置における捕捉剤の特異性は知られているので、特定の位置におけるシグナルの検出は、その位置に結合されている抗原の存在と関連付けることができる。この形式の例としては、マイクロ流体デバイス及びキャピラリーアレイ（それぞれチャネル又はキャピラリーに沿った異なる位置に異なる捕捉剤を含む）、並びにマイクロアレイ（典型的には、固体担体表面にマトリックス状のスポット（「標的要素」）として配列された異なる捕捉剤を含む）が挙げられる。異なる各捕捉剤は、異なる電極に固着させることができ、電極は、例えば、マイクロ流体デバイスのチャネル又はキャピラリーにおいて固体担体の表面に形成できるものである。

場合によっては、本明細書に記載したイムノアッセイは、商業的なプラットフォームイムノアッセイ、例えば、標的抗原の定性的検出用の蛍光発光微小粒子イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）、例えば、ＡｂｂｏｔｔのＰｒｉｓｍ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ｃ−系若しくはｉ−系及び／又はＥＩＡ（Ｂｅａｄ）プラットフォームなどでのＰＩＶＫＡ−ＩＩ血液スクリーニングアッセイのためのキットに、並びに他の商業的な及び／又はインビトロでの診断アッセイにおいて使用できる。

Ｃ．試験キット
本開示はまた、分析物、例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ及び他の内在性抗原について被験試料をアッセイするための試験キットを提供する。本開示による試験キットは、本開示による１つ以上のイムノアッセイの実施に有用な１種以上の試薬を含む。キットは一般に、１種以上の別個の組成物として又は場合によっては、複数の試薬の適合性が許せば混合物として試薬を収容する１つ以上の容器を含むパッケージを含む。キットはまた、ユーザーの観点から望ましい可能性がある他の材料、例えば、緩衝剤、希釈剤、標準物質及び／又は試料の処理、洗浄若しくはアッセイの任意の他のステップの実施に有用な任意の他の材料を含み得る。

例えば、本開示によれば、被験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの特異的結合アッセイを行うためのキットは、本明細書で前述した希釈剤添加剤、即ち、スキムミルク、サポニン、ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２及びスルホベタイン両性イオン界面活性剤、これらに限定されるものではないが例えば、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１４、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）ＡＳＢ−１４及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）ＡＳＢ−１６、好ましくはＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１４、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１８の任意の１種以上を含有する変性アッセイ希釈剤を収容する容器を含み得る。あるいは、キットは、１種以上の添加剤を個別の容器中に含むことができ、各添加剤は、イムノアッセイの実施に備えて、アッセイ希釈剤調製物と合わされて、本明細書に記載した修正アッセイ希釈剤を調製し得る。所望ならば、任意の添加剤を、試験キット中に複数の濃度で含ませることができる。添加剤は、各添加剤を本明細書で前述した量で含有するアッセイ希釈剤を調製するのに都合の良い任意の量でキット中に含ませることができる。

本開示によるキットは、１種以上の第１の抗体又は捕捉抗体（それぞれ、標的分析物（例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）上の少なくとも１つのエピトープと結合する）、及び１種以上の第２の抗体又は検出抗体（それぞれ、いかなる捕捉抗体が結合するいかなるエピトープとも異なる、標的分析物（例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）上の少なくとも１つのエピトープと結合する）、及びさらに、標的分析物を検出又は数量化するための説明書を含むことができる。

本開示によるキットは、固相及び固相に固着された捕捉剤を含むことができ、捕捉剤は、被験試料中の評価される分析物に特異的な抗体である。固相は、磁性又は常磁性の粒子、例えば、微小粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、水晶結晶、フィルム、濾紙、ディスク又はチップなどの材料を含み得る。例示的なキットは、ＰＩＶＫＡ−ＩＩを特異的に結合し得る第１の（捕捉）抗体がコーティングされた磁性又は常磁性微小粒子、又は電極を含む。マルチプレックスアッセイ向けに設計された試験キットは、好都合には、複数の異なる対象分析物（例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ及び他の内在性抗原）に特異的な複数の抗体を含む１種以上の固相を含む。したがって、例えば、マルチプレックス電気化学的イムノアッセイ向けに設計された試験キットは、複数の電極を含む固相を含むことができ、各電極は異なる抗体を有する。

このようなキットをサンドイッチイムノアッセイの実施に使用する場合には、キットは、検出試薬として標識抗体をさらに含むことができる。例えば、キットは、少なくとも１種の直接標識を含むことができ、直接標識は、酵素、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子化学発光団、フルオロフォア、蛍光消光剤、化学発光消光剤又はビオチンであることができる。例示的な実施形態において、直接標識は、アクリジニウム化合物、例えば、アクリジニウム−９−カルボキサミドである。例えば、キットは、標的分析物を特異的に結合し得る第２の検出抗体に付着されたアクリジニウム化合物を含むアクリジニウム標識コンジュゲートをさらに含む。代わりに又は加えて、本開示による試験キットは、少なくとも１種の間接標識も含む。使用される標識が一般に、検出可能なシグナルを生成する指示薬を必要とする場合には、試験キットは好ましくは、１種以上の好適な指示薬を含む。

キットは、標的分析物に対するポリクローナル抗体又は非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウスモノクローナル抗体などを含むことができ、これらを捕捉及び／又は検出抗体として使用できる。例えば、血清又は血漿を含む被験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを測定するためのキットは、マウスモノクローナル抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体、例えば、３Ｃ１０（ＵＳ２０１０／０２３３１７５として公開されている米国特許出願第１２／４０１，３６１号を参照のこと）、及びマウスモノクローナル抗プロトロンビン抗体、例えば、ＭＣＡ１−８ＩｇＧ（Ａｔｔｏ Ｍｏｌ Ｉｎｃ．、東京都豊島区西池袋３−２３−７西池サンケイビル５階（日本））、又はＭＣＡ１−８Ｆ（ａｂ’）２を含むことができる。

したがって、例示的なキットは、これらに限定されるものではないが例えば、第１の抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体を含む構成要素を含むことができる。この抗体は、緩衝液、例えば、ＴＲＩＳ緩衝液（さらに好ましくはタンパク質（ウシ）安定剤及び保存剤としての抗菌剤を含む）中の、磁性又は常磁性微小粒子にコーティングされたマウスモノクローナル抗体であることができる。キットはさらに、タンパク質（ウシ）安定剤及び保存剤としての抗菌剤を含む緩衝液中の、好ましくはＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）緩衝液中のマウス抗プロトロンビンモノクローナル抗体を含むアクリジニウム標識コンジュゲート；並びに本明細書に記載された１種以上の希釈剤添加剤を含有する緩衝液、好ましくはＴＲＩＳを含む変性アッセイ希釈剤を含むことができる。好ましくは、アッセイ希釈剤はまた、保存剤としての抗菌剤を含む。アクリジニウム標識コンジュゲートを用いるイムノアッセイについては、キットはまた、１．３２％（ｗｔ／ｖｏｌ）過酸化水素を含有するＰｒｅ−Ｔｒｉｇｇｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．３５Ｎ水酸化ナトリウムを含有するＴｒｉｇｇｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、並びにリン酸塩緩衝生理食塩溶液及び抗菌剤保存剤を含有する洗浄緩衝液を含むことができる。

Ｄ．本開示の方法の適合
限定ではない一例として、ここで、本発明の実施例を示すものとする。

［実施例１］ＭＣＡ１−８コンジュゲート希釈剤の候補添加剤の比較研究
自動ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＰＩＶＫＡ−ＩＩイムノアッセイプロトコール（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ、６００３５−６０５０））を、以下のように実施する。あらかじめ調製された抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体、例えば、抗ＰＩＶＫＡ ＭＡｂ３Ｃ１０を精製し、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いて共有結合によって表面にカルボキシル基が付着されている磁性微小粒子（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＩＬ）にこれをコーティングする。コーティングされた微小粒子を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む緩衝液に分散させて、試薬Ａを調製する。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化アクリジニウムエステル（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＩＬ）で標識されたＨｙｐｈｅｎ Ｂｉｏｍｅｄ（フランス）からの抗プロトロンビン抗体（コード＃ＰＡ１５０）を、ＢＳＡを含有する緩衝液中に希釈して、試薬Ｂを調製する。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む緩衝液を、試薬Ｃとして調製する。イムノアッセイは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ｉ２０００（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＩＬ）の自動イムノアッセイ系と共に使用される以下の手順で自動的に実施される。詳細には、試薬Ａ ５０ｕＬ及び試薬Ｃ ５０ｕＬが、試料５０ｕＬと混合される。混合物が、３７℃において１８分間インキュベートされて、磁性微小粒子にコーティングされた抗体と試料中の反応性物質（ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）が結合される。磁性微小粒子が、磁石によって引き付けられて、残りの溶液が除去される。磁性微小粒子が、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によって洗浄される。それによって、磁性微小粒子表面に非特異的に結合された不純物が除去された。次いで、試薬Ｂ ５０ｕＬが添加されると、（抗体がコーティングされた磁性微小粒子）−（試料中ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）−（アクリジニウム標識抗体）の複合体が形成される。ＰＢＳによる洗浄ステップ後、過酸化物がアルカリ条件において添加されると、アクリジニウムエステルが発光シグナルを生成し、それが光電子増倍管（ＰＭＴ）によって検出される。

予備スクリーニング後、第２のイムノアッセイ反応に使用するために、前述されたＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイプロトコールが修正されて、種々の候補添加剤が、それぞれ種々の量で抗プロトロンビンコンジュゲート希釈剤（試薬Ｂ）に添加された場合に血清試料から得られる背景相対光単位（ＲＬＵ）を低減する能力が試験された。本研究において、試薬Ａに使用された抗ＰＩＶＫＡ ＭＡｂはＭＡｂ３Ｃ１０であり、コンジュゲート希釈剤（試薬Ｂ）に使用された抗プロトロンビン抗体は抗プロトロンビンモノクローナル抗体ＭＣＡ１−８ＩｇＧ（ＰＩ−Ｃ１６３Ｅ、ＩＲ５．０、３００ｎｇ／ｍｌ）である。予備スクリーニングは、背景ＲＬＵを低減させるために提案された多くの物質、例えば、カゼイン、魚肉ゼラチン、酵母エキスなどを除外したが、特定の候補物質はＲＬＵを増大させることを示した。さらなる評価に供された候補物質は、スキムミルク（クリームが除去された、したがって乳脂肪が１％未満のミルク）、サポニン、及び（合成）スルホベタイン型両性イオン界面活性剤、例えば、
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−８（３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホネート）
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１０（ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１２（Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネート）
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６（ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１８、Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ３−１８（ｎ−オクタデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）ＡＳＢ−１４（「Ａｍｉｄｏｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ−１４」；３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ］プロパンスルホネート）
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）ＡＳＢ−１６（「Ａｍｉｄｏｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ−１６」）
である。

さらに、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ４０５、ＢＧ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２及びＣＩ６ＡＰＳが評価された。ｐＨは、５．５に維持された。候補物質が１種以上の量で、コンジュゲート希釈剤１．０％、１．２５％、１．６７％、３．００％又は５．００％において添加された。固体（例えば、粉末）添加剤は％ｗ／ｖとして添加され、液体添加剤は％ｗ／ｖ又は％ｖ／ｖとして添加された。表２は、スルホベタイン型両性界面活性剤としてＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６を含む、試験された添加剤の種々の組合せを要約する。

さらに、他のスルホベタイン型両性イオン界面活性剤も試験された。結果は、全体を通してＣ／Ａ比として報告されている。図２及び３に示されるように、最良の結果は、サポニン、スキムミルク及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６を含有する希釈剤を用いて得られた。図２は、コンジュゲート希釈剤が添加剤を含有せずに、サポニンのみ、スキムミルクのみ又はＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６のみを含有する場合に得られた結果を比較する棒グラフである。図３は、コンジュゲート希釈剤が添加剤を含有しない場合、並びにコンジュゲート希釈剤がスキムミルク（１．６７％）、サポニン（１．００％）及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６（１．６０％）の組合せを含有する場合に得られた結果を比較する棒グラフである。

添加剤の組合せ中の種々のスルホベタイン型両性イオン界面活性剤の相対的な性能も、試験された。図４に示されるように、アッセイの最高感度は、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６によって得られたが、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１４、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）ＡＳＢ−１４及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）ＡＳＢ−１６のいずれか１種を用いる場合にも、添加剤を用いずに得られた結果と比較して感度の良好な改善が得られた。

［実施例２］ＭＣＡ１−８コンジュゲート希釈剤のＣａ^＋＋依存性
前述のようにして実施例２から得られた結果は、スキムミルク及びサポニンの１種以上の特定の構成成分が、ＰＩＶＫＡ−ＩＩの検出のためのＭＣＡ１−８コンジュゲート希釈剤の感度を改善するのにおそらく重要であることを示唆した。

カルシウム又はマグネシウムイオンが感度の改善に関与する可能性が、コンジュゲート希釈剤に特定の量のＣａ^＋＋（ＣａＣｌ_２として）又はＭｇ^＋＋（ＭｇＣｌ_２として）を添加することによって修正された、前述のＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイプロトコールを実施し及びｐＨ５．５及びｐＨ６．０において第２のアッセイ反応を実施することによって、調べられた。試験希釈剤は、添加剤を含有しない、又は添加剤として３０ｍＭ Ｃａ^＋＋を含有する若しくは３０ｍＭ Ｍｇ^＋＋を含有するのいずれかであった。結果は、以下の表３及び図５に示される棒グラフに要約される。これらは、ｐＨ５．５及びｐＨ６．０において、３０ｍＭ Ｃａ^＋＋若しくは３０ｍＭ Ｍｇ^＋＋のいずれか一方を含有しているコンジュゲート希釈剤が、添加剤を含有しないコンジュゲート希釈剤を用いて得られた結果と比較して、改善された感度を示すことを示している。

さらに、スキムミルクの種々の既知の構成要素の寄与が、前記希釈添加剤の例示的組合せ：スキムミルク（１．６７％）、サポニン（１．００％）及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６（１．６０％）においてスキムミルクの代わりにスキムミルクの種々の構成要素のいくつかのうち任意の１種を用いて、前述の修正ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイプロトコールを実施することによって調べられた。図６に示されるように、カゼイン、ホエー及びホエーの構成成分（ラクトース、ラクトアルブミン、ラクトグロブリン、ラクトフェリン及びＣａＣｌ_２）が、スキムミルクの代わりに１．６７％のカゼイン（図示される２つの異なる供給源、Ｗａｋｏ及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．のそれぞれに由来）、１．６７％ホエー、１％ラクトース、２％α−ラクトアルブミン、５％β−ラクトグロブリン、０．２％ラクトフェリン又は３０ｍＭ ＣａＣｌ_２を用いて試験された。図６において左に示されるように、希釈剤中の添加剤としてスキムミルクの代わりにカゼインでなくホエーを用いる場合のみ、添加剤を含有しないコンジュゲート希釈剤と比較して感度が改善された。図６において右に示されるように、ホエーの構成成分のうち、最高の感度は、コンジュゲート希釈剤が３０ｍＭ ＣａＣｌ_２を含有する場合に得られた。

さらに、ＣａＣｌ_２又はＭｇＣｌ_２以外の金属塩化物塩がコンジュゲート希釈剤の感度を改善する可能性が、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、ＺｎＣｌ_２又はＢａＣｌ_２のうちの１種を１５０ｍＭ含有するコンジュゲート希釈剤を用いて、実質的に前述のようにして試験された。これは、以下の表４に要約され、図７に示される。結果は、最良の結果が、１５０ｍＭのＣａＣｌ_２又はＭｇＣｌ_２を含有する希釈剤によって得られることを示している。

当業者に容易に理解されるように、本開示において記載された方法及びキットが、目的を実施し、記載した結果と利点を得ると共に、それらに内在する結果と利点を得る為に好適である。本明細書に記載された方法、手順、処理、分子、特定化合物及びキットは、単に代表的及び例示的なものであり、本発明の範囲の限定を目的とするものではない。当業者に容易に理解されるように、発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に種々の置換及び変更を加えることができる。

本明細書で言及した全ての特許及び刊行物は、本発明が属する技術分野における当業者の技術水準を示す。全ての特許及び刊行物は、個々の刊行物が参照により具体的および個別に組み込むことが示されるかのように同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (5)

1. 被験試料中のビタミンＫ依存性凝固因子前駆体ＩＩ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ−ＩＩ）（ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）を測定するための方法であって、
   （ａ）当該被験試料を、抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体でコーティングされた固相、緩衝液、界面活性剤、およびウシ血清アルブミンからなる第一の試薬と接触させることによって、上記緩衝液、界面活性剤、およびウシ血清アルブミンの存在下で、抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体をＰＩＶＫＡ−ＩＩ上のエピトープに結合させて、抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原複合体を形成させること、
   （ｂ）抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原複合体を、検出可能に標識化した抗プロトロンビン抗体、ウシタンパク質安定剤を伴う２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、抗菌剤および３０ｍＭから２００ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ _２ ）を含む第二の試薬と接触させることによって、抗プロトロンビン抗体をＰＩＶＫＡ−ＩＩ上のエピトープに結合させて、抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原−抗プロトロンビン抗体複合体を形成させること、ならびに、
   （ｃ）工程（ｂ）で形成させた抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原−抗プロトロンビン抗体複合体中の検出可能な標識より発生されたシグナルに基づき、被験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ濃度を決定すること
   を含む、方法。
2. 抗プロトロンビン抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
3. 方法が自動測定装置中で実施される、請求項１または２に記載の方法。
4. 抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体がポリクローナル抗体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 第二の試薬が３０ｍＭのＭｇＣｌ _２ を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

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