WO2020158857A1

WO2020158857A1 - 生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法及び測定キット

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Publication number: WO2020158857A1
Application number: PCT/JP2020/003415
Authority: WO
Inventors: 宮崎　徹; 岡上　武; 智英浅井; 由香鐘築; 次郎廣田
Original assignee: 積水メディカル株式会社; 宮崎　徹; 社会福祉法人恩賜財団済生会
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2020-01-30
Publication date: 2020-08-06
Also published as: EP3919903A1; JP7315967B2; JPWO2020158857A1; US20220107318A1; EP3919903A4; CN113728233A

Abstract

複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料において、抗ＡＩＭ抗体の遊離ＡＩＭに対する特異性を向上させることを課題とする。　複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析方法であって、抗ＩｇＭ抗体の存在下で、前記生物学的試料と抗ＡＩＭ抗体とを接触させることを含む、前記方法により、前記課題を解決することができる。

Description

生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法及び測定キット

　本発明は、生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法に関する。また、本発明は、生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量を測定するためのキットに関する。本発明は、生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析における非特異反応抑制方法にも関する。

　ＡＩＭ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）は組織マクロファージにより産生される、分子量約５０ｋＤａ分泌型の血中タンパク質である。ＡＩＭは、システイン残基を多く含む特異的な配列であるｓｃａｖｅｎｇｅｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ（ＳＲＣＲ）ドメインをタンデムに３つつなげた構造をしている。それぞれのシステイン残基は各ドメイン内で互いにジスルフィド結合することで、コンパクトな球状の立体構造をしていると考えられている。

　ＡＩＭは、リポ多糖、ＩｇＭ、補体制御因子、及び脂肪酸合成酵素など，さまざまな分子と結合するという特徴を持つことが知られている。中でも、ＡＩＭは、血中においてＩｇＭとの複合体の形態で存在することが知られている。ＩｇＭは５００ｋＤａをこえる巨大なタンパク質複合体であるため、ＩｇＭに結合しているかぎりＡＩＭも糸球体を通過して尿へと移行することはなく、ＡＩＭの高い血中濃度が保たれる。ＩｇＭから解離するとＡＩＭはすみやかに尿へと排泄される。したがって、大部分のＡＩＭは血液中においてＩｇＭと複合体を形成しており、結合体ではなく遊離状態で血中に存在することはほとんどない。

　近年、ＡＩＭが、インスリン抵抗性又は動脈硬化などのさまざまな疾患における病態の進行に関与することが明らかにされている。例えば、他の結合パートナーと結合していない遊離の形態で存在する遊離ＡＩＭと肝疾患との関係について報告されている（特許文献１）

国際公開第２０１７／０４３６１７号パンフレット

　遊離ＡＩＭ量の測定結果に基づき特定の疾患を診断する場合、複合体を形成しているＡＩＭの量を排除し、遊離ＡＩＭ量のみを測定する必要がある。しかしながら、遊離ＡＩＭを検出する際に、他の結合パートナーと結合している複合体ＡＩＭも検出してしまう場合があった。したがって、複雑な操作を伴うことなく、複合体を形成しているＡＩＭの非特異反応を排除することが可能な技術が望まれていた。
　本発明の目的は、優れた特異性を有する、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の測定方法、並びに優れた特異性を有する、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の測定キットを提供することにある。

　遊離ＡＩＭのみに特異的に結合する抗体よりも、遊離ＡＩＭ及び複合体ＡＩＭのいずれにも結合する抗体の方が、取得が容易である。本発明者らは、取得が容易な遊離ＡＩＭ及び複合体ＡＩＭのいずれにも結合する抗体を使用して上記課題を解決するために鋭意検討した結果、抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料と抗ＡＩＭ抗体とを接触させることにより、抗ＡＩＭ抗体の遊離ＡＩＭに対する特異性を向上させることが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　具体的に、本発明は以下のとおりである。
＜１＞複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析方法であって、抗ＩｇＭ抗体の存在下で、前記生物学的試料と抗ＡＩＭ抗体とを接触させることを含む、前記方法、
＜２＞前記生物学的試料が、体液試料である、＜１＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析方法、
＜３＞前記生物学的試料が、血液、血清、血漿又は尿である、＜１＞又は＜２＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析方法、
＜４＞抗ＡＩＭ抗体が、ポリクローナル抗体である、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析方法、
＜５＞抗ＩｇＭ抗体と抗ＡＩＭ抗体とを含む、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の測定キット、
＜６＞前記生物学的試料が、体液試料である、＜５＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の測定キット、
＜７＞前記生物学的試料が、血液、血清、血漿又は尿である、＜５＞又は＜６＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の測定キット、
＜８＞抗ＡＩＭ抗体が、ポリクローナル抗体である、＜５＞～＜７＞のいずれかに記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の測定キット、
＜９＞複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析における非特異反応抑制方法であって、抗ＩｇＭ抗体の存在下で、前記生物学的試料と抗ＡＩＭ抗体とを接触させることを含む、前記方法、
＜１０＞前記生物学的試料が、体液試料である、＜９＞に記載の非特異反応抑制方法、並びに
＜１１＞前記非特異反応が、生物学的試料中のＩｇＭに由来する非特異反応である、＜９＞又は＜１０＞に記載の非特異反応抑制方法。

　本発明によれば、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析方法において、抗ＡＩＭ抗体の遊離ＡＩＭに対する特異性を向上させることができる。

種々の抗ヒトＩｇＭ抗体を測定系に添加した場合の非特異反応抑制効果を表す図である。

［１］生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析方法
（生物学的試料）
　本発明において分析可能な生物学的試料としては、主に生体（生物）由来の固形組織及び体液試料を挙げることができ、体液試料を用いることが好ましい。本発明において分析可能な生物学的試料は、より好ましくは、血液、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、涙液、耳漏、又は前立腺液等の体液試料であり、さらに好ましくは血液、血清、血漿又は尿である。生体又は対象は、ヒト又は動物（例えば、マウス、モルモット、ラット、サル、イヌ、ネコ、ハムスター、ウマ、ウシ、及びブタ）を含み、好ましくはヒトである。対象からの生物学的試料は、本発明の実施時に採取または調製されたものでもよく、予め採取または調製され保存されたものであってもよい。試料を測定する者と試料中の遊離ＡＩＭ量を測定する者とは別の者であってもよい。生物学的試料は、インビボの試料であることができる。本発明において、生物学的試料は、遊離ＡＩＭと複合体ＡＩＭの両方を含む。

（ＡＩＭ）
　ＡＩＭ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）は組織マクロファージにより産生される、分子量約５０ｋＤａ分泌型の血中タンパク質である。ＡＩＭは、システイン残基を多く含む特異的な配列であるｓｃａｖｅｎｇｅｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ（ＳＲＣＲ）ドメインをタンデムに３つつなげた構造をしており、それぞれのシステイン残基は各ドメイン内で互いにジスルフィド結合することで、コンパクトな球状の立体構造をしていると考えられている。
　ヒトＡＩＭは、配列番号１で表される３４７アミノ酸から成り、システインを多く含む３つのＳＲＣＲドメインを含んでいる。ＳＲＣＲ１ドメインは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号２４～１２５に該当する。ＳＲＣＲ２ドメインは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１３８～２３９に該当する。ＳＲＣＲ３ドメインは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号２４４～３４６に該当する。
　ヒトＡＩＭのアミノ酸配列は以下のとおりである。
MALLFSLILAICTRPGFLASPSGVRLVGGLHRCEGRVEVEQKGQWGTVCDDGWDIKDVAVLCRELGCGAASGTPSGILYEPPAEKEQKVLIQSVSCTGTEDTLAQCEQEEVYDCSHDEDAGASCENPESSFSPVPEGVRLADGPGHCKGRVEVKHQNQWYTVCQTGWSLRAAKVVCRQLGCGRAVLTQKRCNKHAYGRKPIWLSQMSCSGREATLQDCPSGPWGKNTCNHDEDTWVECEDPFDLRLVGGDNLCSGRLEVLHKGVWGSVCDDNWGEKEDQVVCKQLGCGKSLSPSFRDRKCYGPGVGRIWLDNVRCSGEEQSLEQCQHRFWGFHDCTHQEDVAVICSG（配列番号１）
　すなわち、ヒトＡＩＭ中の、ＳＲＣＲ１ドメイン、ＳＲＣＲ２ドメイン、及びＳＲＣＲ３ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ以下の通りである。
ＳＲＣＲ１ドメイン：
VRLVGGLHRCEGRVEVEQKGQWGTVCDDGWDIKDVAVLCRELGCGAASGTPSGILYEPPAEKEQKVLIQSVSCTGTEDTLAQCEQEEVYDCSHDEDAGASCE（配列番号２）
ＳＲＣＲ２ドメイン：
VRLADGPGHCKGRVEVKHQNQWYTVCQTGWSLRAAKVVCRQLGCGRAVLTQKRCNKHAYGRKPIWLSQMSCSGREATLQDCPSGPWGKNTCNHDEDTWVECE（配列番号３）
ＳＲＣＲ３ドメイン：
LRLVGGDNLCSGRLEVLHKGVWGSVCDDNWGEKEDQVVCKQLGCGKSLSPSFRDRKCYGPGVGRIWLDNVRCSGEEQSLEQCQHRFWGFHDCTHQEDVAVICS（配列番号４）

（遊離ＡＩＭ）
　本明細書において、「遊離ＡＩＭ」とは、リポ多糖又はＩｇＭ等の他の物質と結合していない、遊離状態で存在するＡＩＭを意味する。これに対し、本明細書において、リポ多糖又はＩｇＭ等の他の物質と結合しており、他の物質との複合体の状態で存在するＡＩＭを複合体ＡＩＭと称する。遊離ＡＩＭとは、好ましくは、ヒトの遊離ＡＩＭであり、複合体ＡＩＭとは、好ましくは、ヒトの複合体ＡＩＭである。

（抗ＩｇＭ抗体）
　本明細書において使用される用語「抗ＩｇＭ抗体」は、ＩｇＭに結合する性質を有する抗体を意味する。換言すれば、「抗ＩｇＭ抗体」は、オクタローニー法によりヒトＩｇＭと沈降線を生ずる物質を意味する。ＩｇＭに結合性を有し且つ本発明の効果を損なわない範囲内で、他の抗原に対して結合性を有してもよい。本発明において使用される抗ＩｇＭ抗体は、好ましくは抗ヒトＩｇＭ抗体である。本発明において使用される抗ＩｇＭ抗体としては、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれも使用可能である。抗ＩｇＭ抗体は、ＩｇＭと結合することができる機能性断片であってもよい。
　本発明の免疫学的分析方法においては、抗ＩｇＭ抗体の使用により、抗ＩｇＭ抗体非添加の場合と比較して、複合体ＡＩＭに由来する非特異反応を５０％以下、好ましくは６０％以下、さらに好ましくは７０％以下、最も好ましくは９０％以下に減少させることができる。
　本発明において効果が得られる理由は、まだ十分に解明されているわけではないが、複合体ＡＩＭにおけるＩｇＭ部分と抗ＩｇＭ抗体とが結合することにより、複合体ＡＩＭのＡＩＭ部分と抗ＡＩＭ抗体との結合が阻害されると考えられる。結合パートナーの一方への抗体の結合が、結合パートナーの他方への抗体の結合性へ影響を及ぼすことは驚きである。
　本発明において使用される抗ＩｇＭ抗体として、市販の抗ＩｇＭ抗体を使用することもできる。市販の抗ＩｇＭ抗体としては、ＨＢＲ－１、ＨＢＲ－３、ＨＢＲ－６、ＨＢＲ－Plus、ＨＢＲ－９、ＨＢＲ－１１、ＨＢＲ２０、ＨＢＲ２１、ＨＢＲ２２、ＨＢＲ２３、ＨＢＲ２４、ＨＢＲ２５、ＨＢＲ２６（SCANTIBODIES社）、Ｐ０９１１（Trina Bioreactives AG）及びTRU Block（登録商標）ULTRA（Meridian Bioscience社）等が使用できるが、ＨＢＲ－６、ＨＢＲ－２０、及び／又は市販の抗ヒトＩｇＭポリクローナル抗体を使用することが好ましく、ＨＢＲ－６、ＨＢＲ－２０、及び／又はＰ０９１１（Trina Bioreactives AG）を使用することがより好ましい。
　抗ＩｇＭ抗体の添加濃度は十分な非特異反応抑制効果を示し、かつ免疫学的測定の本反応に影響を及ぼさない濃度であれば特に制限はないが、モノクローナル抗体である場合、１～１０００μｇ／ｍＬの濃度範囲での利用が望ましく、１０～１０００μｇ/ｍＬがより望ましく、１０～３００μｇ／ｍＬがさらに望ましい。ポリクローナル抗体である場合、０．０１～２重量％の濃度範囲での利用が望ましく、０．０３～２重量％の濃度範囲での利用が望ましく、０．０５～１重量％がさらに望ましい。
　本発明において、抗ＩｇＭ抗体のＩｇＭへの結合親和性は、本発明の効果が得られる限りにおいて特に限定されることはないが、例えば、ＩｇＭに対して少なくとも約１０^－４Ｍ、少なくとも約１０^－５Ｍ、少なくとも約１０^－６Ｍ、少なくとも約１０^－７Ｍ、少なくとも約１０^－８Ｍ、少なくとも約１０^－９Ｍ、少なくとも約１０^－１０Ｍ、少なくとも約１０^－１１Ｍ、少なくとも約１０^－１２Ｍ、またはそれ以上のＫｄであることができる。

　抗ＩｇＭ抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれも公知の方法に従って作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、ＩｇＭ又はＩｇＭフラグメントで免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞である脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を単離し、これを高い増殖能を有する骨髄腫由来の細胞株等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、ＩｇＭ又はＩｇＭフラグメントで免疫した動物の血清から得ることができる。また、免疫原としては、例えば、ヒトやサルなどの霊長類、ラットやマウスなどのげっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどの、ＩｇＭ又はＩｇＭフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。

　抗ＩｇＭ抗体としては、抗体分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントを使用することも可能であり、前記のように動物への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術を使用して得られるものやキメラ抗体を用いることも可能である。抗体の断片としては機能性の断片であることが好ましく、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖなどが挙げられ、これらのフラグメントは前記のようにして得られる抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理すること、あるいは該抗体のＤＮＡをクローニングして大腸菌や酵母を用いた培養系で発現させることにより製造できる。

　本明細書において「非特異反応」とは、本発明において使用される抗ＡＩＭ抗体に、遊離ＡＩＭ以外の物質が結合することを意味する。本発明では、抗ＩｇＭ抗体を用いることで、複合体ＡＩＭ、特にＩｇＭが結合パートナーとして結合している複合体ＡＩＭによる非特異反応を抑制することができる。換言すれば、本発明では、抗ＩｇＭ抗体を用いることで、抗ＡＩＭ抗体の遊離ＡＩＭへの特異性を向上させることができる。
　本発明の複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析における非特異反応抑制方法は、抗ＩｇＭ抗体の存在下で、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料と抗ＡＩＭ抗体とを接触させることを含む、遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析における、複合体ＡＩＭと抗ＡＩＭ抗体との結合阻害方法であることができる。

（抗ＡＩＭ抗体）
　本明細書では、抗ＩｇＭ抗体の非存在下において複合体ＡＩＭと遊離ＡＩＭのいずれにも反応する抗体を抗ＡＩＭ抗体と呼ぶ。本明細書における用語「抗ＡＩＭ抗体」には、遊離ＡＩＭには反応して複合体ＡＩＭには実質的に反応しない、遊離ＡＩＭに特異的な抗体は含まれない。本明細書において「遊離ＡＩＭには反応して複合体ＡＩＭには実質的に反応しない」とは、当業者に公知の手法により抗体の反応性を測定した場合に、遊離ＡＩＭに対する結合力を１００とした場合の、複合体ＡＩＭに対する結合力が１０％未満である場合を意味する。
　本発明の「抗ＡＩＭ抗体」としては、当業者に公知の手法により抗体の反応性を測定した場合に、複合体ＡＩＭへの反応性と遊離ＡＩＭへの反応性とが同じ程度である抗ＡＩＭ抗体、複合体ＡＩＭへの反応性よりも遊離ＡＩＭへの反応性が強い抗ＡＩＭ抗体、及び遊離ＡＩＭへの反応性よりも複合体ＡＩＭへの反応性が強い抗ＡＩＭ抗体のいずれを使用してもよいが、複合体ＡＩＭへの反応性よりも遊離ＡＩＭへの反応性が強い抗ＡＩＭ抗体を使用することが好ましい。より具体的には、当業者に公知の手法により抗体の反応性を測定した場合に、遊離ＡＩＭに対する結合力を１００とした場合の、複合体ＡＩＭに対する反応性が５０％以下である抗ＡＩＭ抗体を使用することが好ましい。
　本発明の免疫学的分析方法において用いられる抗ＡＩＭ抗体は、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ３ドメイン内のエピトープに結合するものであることができる。本発明の免疫学的分析方法において用いられる抗ＡＩＭ抗体は、好ましくは、ＳＲＣＲ３ドメイン内のエピトープに結合し、ＳＲＣＲ１ドメインには結合しない。本発明の免疫学的分析方法において用いられる抗ＡＩＭ抗体は、さらに好ましくは、ＳＲＣＲ３ドメイン内のエピトープに結合し、ＳＲＣＲ１ドメイン及びＳＲＣＲ２ドメインのいずれにも結合しない。

　本発明に使用される抗ＡＩＭ抗体は、抗ＩｇＭ抗体の非存在下では複合体ＡＩＭと遊離ＡＩＭのいずれにも反応する。抗ＩｇＭ抗体を反応系に存在させることにより、複合体ＡＩＭとの反応性を低下させることができる。抗ＩｇＭ抗体を測定系に添加するタイミングについては、本発明の効果が得られる限りにおいて特に限定されることはないが、抗ＡＩＭ抗体の添加より前に又は添加と同時に添加することが好ましい。

　抗ＡＩＭ抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれも公知の方法に従って作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、遊離ＡＩＭ若しくは遊離ＡＩＭフラグメント及び／又は複合体ＡＩＭ若しくは複合体ＡＩＭフラグメントで免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞である脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を単離し、これを高い増殖能を有する骨髄腫由来の細胞株等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、遊離ＡＩＭ若しくは遊離ＡＩＭフラグメント及び／又は複合体ＡＩＭ若しくは複合体ＡＩＭフラグメントで免疫した動物の血清から得ることができる。また、免疫原としては、例えば、ヒトやサルなどの霊長類、ラットやマウスなどのげっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどの、遊離ＡＩＭ若しくは遊離ＡＩＭフラグメント又は複合体ＡＩＭ若しくは複合体ＡＩＭフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。　例えば、抗ＡＩＭモノクローナル抗体は、特許文献１の実施例と同様、以下の手順で作製することが可能である。
＜動物感作＞
　抗原として全長ヒトｒＡＩＭ（２ｍｇ／ｍｌ）を等量のＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄ（Ｇ－１フナコシ）と混合しエマルジョンを作製する。免疫動物にはＢａｌｂ／ｃマウス（チャールズリバー（株）８週齢のメス２匹を用い、後ろ足底部へ抗原溶液５０μＬを投与する。２週間後に同様の投与を行い、更に２週間以上をおいて抗原溶液５０μｇを後ろ足底部へ投与し３日後の細胞融合に備える。
＜ミエローマ細胞＞
　ミエローマ細胞にはマウスＰ３Ｕ１を用い、増殖培養には、ＲＰＭＩ１６４０（１１８７５－１１９　ＧＩＢＣＯ）に、グルタミンとピルビン酸を加え、ＦＢＳ（Ｓ１５６０　ＢＷＴ社）を１０％になるように添加した培地を用いる。抗生物質としてはペニシリン、ストレプトマイシンを適量加える。
＜細胞融合＞
　麻酔下にて心臓採血を行ったマウスから、無菌的に膝窩リンパ節を摘出し、＃２００メッシュ付ビーカーにのせ、シリコン棒で押しながら、細胞浮遊液を調製する。細胞はＲＰＭＩ１６４０にて２回の遠心洗浄を行った後、細胞数をカウントする。対数増殖期の状態のミエローマ細胞を遠心により集め、洗浄後、リンパ細胞とミエローマ細胞の比率が５対１となるように調製し、混合遠心を行う。細胞融合はＰＥＧ１５００（７８３６４１　ロシュ）を用いて行う。すなわち、細胞ペレットへ１ｍＬのＰＥＧ液を３分間かけて反応させ、その後段階的に希釈を行い、遠心にて洗浄した後、培地を加え９６ウェルプレート１５枚へ２００μＬずつ入れ、１週間の培養を行う。培地にはミエローマ細胞用培地にＨＡＴサプリメント（２１０６０－０１７　ＧＩＢＣＯ）を加え、ＦＢＳ濃度を１５％にしたものを用いる。
＜マウス腹水採取＞
　凍結保存された細胞を解凍し、増殖培養を行った後、１週間以上前に０．５ｍｌのプリスタン（４２－００２　コスモバイオ）を腹腔内投与したヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ－ｎｕ／ｎｕ　日本クレア）の腹腔へ、１×１０^７個を投与し、およそ２週間後に４～１２ｍｌの腹水を得る。遠心処理にて固形物を除去した後、凍結保存を行う。

　抗ＡＩＭ抗体としては、抗体分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントを使用することも可能である。前記のように動物への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術を使用して得られるものやキメラ抗体を用いることも可能である。抗体の断片としては機能性の断片であることが好ましく、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖなどが挙げられる。これらのフラグメントは前記のようにして得られる抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理すること、あるいは該抗体のＤＮＡをクローニングして大腸菌や酵母を用いた培養系で発現させることにより製造できる。

　本明細書において、ＡＩＭと「反応する」、ＡＩＭを「認識する」、ＡＩＭと「結合する」は、同義で用いられるが、これらの例示に限定されることはなく、最も広義に解釈する必要がある。抗体がＡＩＭなどの抗原（化合物）と「反応する」か否かの確認は、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などにより行うことができるほか、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の原理を利用した方法（ＳＰＲ法）などにより行うことができる。ＳＰＲ法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の名称で市販されている、装置、センサー、試薬類を使用して行うことができる。

　本明細書において、「不溶性担体」を「固相」、抗原や抗体を不溶性担体に物理的あるいは化学的に担持させることあるいは担持させた状態を「固定」、「固定化」、又は「固相化」と表現することがある。また、「分析」、「検出」、又は「測定」という用語は、遊離ＡＩＭの存在の証明及び／又は定量などを含めて最も広義に解釈する必要があり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。

（免疫学的分析方法）
　本発明において使用される免疫学的分析方法としては、当業者に公知の手法である、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）、ＥＬＩＳＡ、酵素免疫測定法、免疫組織染色法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフ法、EATA法（Electrokinetic Analyte Transport Assay）及び高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

　使用される抗体と結合可能な標識抗体（二次抗体）を用いることにより、遊離ＡＩＭに結合した抗体の量を測定することができ、それにより生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量を測定することができる。標識抗体を製造するための標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、放射性同位体、金コロイド粒子、又は着色ラテックスなどが挙げられる。当業者であれば、使用される抗体と標識物質に応じて、免疫学的分析方法を適宜選択することができるが、実験系構築が簡便であることから、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）を用いることが好ましい。

　電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）とは、標識物質を電気化学的刺激により発光させ、その発光量を検出することで被検出物質量を算出する方法を意味する。電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）では、標識物質として、ルテニウム錯体を用いることができる。固相（マイクロプレート又はビーズ等）に電極を設置してこの電極上で電気化学的刺激を起こすことにより、このルテニウム錯体の発光量を検出することができる。
　抗ＩｇＭ抗体の存在下において、抗ＡＩＭ抗体を固相抗体として用い、別の抗ＡＩＭ抗体（すなわち、固相抗体とは別のエピトープを認識する抗体）を検出抗体（標識抗体）として用いて電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）を行うことができる。固相抗体及び標識抗体を用い、そして、固相としてビーズ、標識としてルテニウム錯体をそれぞれ用いた際の測定原理は、以下のとおりである。下記は本発明の一実施形態における測定原理を示すものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
１．抗ＩｇＭ抗体の存在下において、抗ＡＩＭ抗体が結合したビーズと試料とを反応させると、試料中の遊離ＡＩＭがビーズに結合した抗体と結合する。
２．ビーズを洗浄後、ビーズに結合した遊離ＡＩＭに、ルテニウム標識抗体（ビーズに結合した抗体とは認識エピトープが異なる抗体）を反応させると、サンドイッチ状に結合する。
３．ビーズを洗浄後、電極上にて電気エネルギーを加えると、遊離ＡＩＭを介してビーズに結合したルテニウム標識抗体量に応じて、ルテニウム錯体が発光する。この発光量を計測することにより、検体中の遊離ＡＩＭを測定することができる。

　免疫学的分析方法の中で、酵素標識を用いるＥＬＩＳＡ法も、簡便且つ迅速に標的を測定することができて好ましい。サンドイッチＥＬＩＳＡの場合、抗ＡＩＭ抗体を固定化した不溶性担体と、標識物質で標識された、固定抗体とはエピトープが異なる抗ＡＩＭ抗体とを使用することができる。この場合、不溶性担体はプレート（イムノプレート）が好ましく、標識物質は、適宜選択して使用できる。
　不溶性担体に固定化された抗体は、抗ＩｇＭ抗体の存在下において、試料中の遊離ＡＩＭを捕捉し、不溶性担体上で抗体－遊離ＡＩＭ複合体を形成する。標識物質で標識された抗体は、前記捕捉された遊離ＡＩＭに結合して前述の抗体－遊離ＡＩＭ複合体とサンドイッチを形成する。標識物質に応じた方法により標識物質の量を測定することにより、試料中の遊離ＡＩＭを測定することができる。抗体の不溶性担体への固定化の方法、抗体と標識物質との結合方法等、具体的な方法は、当業者に周知の方法を特に制限なく使用することができる。
　また、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）を用いることも可能である。すなわち、蛍光標識した抗ＡＩＭ抗体と生物学的試料とを接触させることにより、抗ＡＩＭ抗体と遊離ＡＩＭ及び複合体ＡＩＭとを結合させる。その後、ＨＰＬＣにより遊離ＡＩＭと結合している抗ＡＩＭ抗体のみを分離することもできる。

　免疫学的分析方法としては、代表的な粒子凝集免疫測定法であるラテックス免疫凝集法（以下、ＬＴＩＡ法ということがある）も好ましい。ＬＴＩＡ法では、目的成分に対する抗体を担持させたラテックス粒子を用い、目的成分である抗原と抗体担持ラテックス粒子とが抗原抗体複合物を形成して結合することによって生じるラテックス粒子の凝集（濁り）の程度を光学的手段（例えば、透過光を測定する比濁法、散乱光を測定する比朧法など）などにより検出し、目的成分を分析することができる。本発明の免疫学的分析方法では、抗ＡＩＭ抗体を担持させたラテックス粒子を用い、抗ＩｇＭ抗体の存在下において、目的成分である遊離ＡＩＭと抗体担持ラテックス粒子とが抗原抗体複合物を形成して結合することによって生じるラテックス粒子の凝集の程度を光学的手段により検出することができる。
　また、免疫学的分析方法として、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）あるいはEATA法（Electrokinetic Analyte Transport Assay）を用いることも可能である。EATA法は、富士フィルム和光純薬株式会社製のミュータスワコーi30を使用して実施することができる。

［２］遊離ＡＩＭ量の測定キット
　本発明の遊離ＡＩＭ量の測定キットは、抗ＩｇＭ抗体と抗ＡＩＭ抗体とを含む。本発明の測定キットには、ほかに、他の検査試薬、検体希釈液、及び／又は使用説明書などを含むこともできる。

　本発明の遊離ＡＩＭ量の測定キットは、好ましくは、以下の（１）～（３）を含む。
（１）第一抗ＡＩＭ抗体を固定化した固相、
（２）電気化学発光物質で標識した、第一抗ＡＩＭ抗体とは異なるエピトープを有する第二抗ＡＩＭ抗体、並びに
（３）抗ＩｇＭ抗体。
　ECL法を使用する場合、本発明の測定キットは、第一抗ＡＩＭ抗体を固定化した固相とルテニウム錯体等の電気化学発光物質で標識した、第二抗ＡＩＭ抗体とを含むことができる。例えば、固相としてマイクロビーズを用いたキットでは、第一抗ＡＩＭ抗体を固相化したマイクロビーズに、抗ＩｇＭ抗体の存在下で生物学的試料を添加して反応させた後、試料を除去して洗浄する。続いて、電気化学発光物質を標識した、第一抗ＡＩＭ抗体とは異なるエピトープを認識する第二抗ＡＩＭ抗体を添加して反応させる。マイクロビーズを洗浄後、電気エネルギーを加えて発光させ標識物質の発光量を測定することにより、遊離ＡＩＭ濃度を求めることができる。

　サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用する場合、測定キットは少なくとも、以下の（１）～（３）を含む。
（１）第一抗ＡＩＭ抗体（固相抗体）を固定化した不溶性担体、
（２）標識物質で標識された、第一抗ＡＩＭ抗体とは異なるエピトープを認識する第二抗ＡＩＭ抗体（標識抗体）、及び
（３）抗ＩｇＭ抗体。
　このようなキットでは、まず、第一抗ＡＩＭ抗体を固定化した不溶性担体に、抗ＩｇＭ抗体の存在下で生物学的試料を添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。次に、標識抗体を添加した後インキュベートし、基質を加えて発色させる。プレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、生物学的試料中における遊離ＡＩＭ濃度を求めることができる。

　ＬＴＩＡ法を使用する場合、測定キットは少なくとも、以下の（１）～（３）を含む。
（１）第一抗ＡＩＭ抗体を固定化したラテックス粒子、
（２）第一抗ＡＩＭ抗体とは異なるエピトープを認識する第二抗ＡＩＭ抗体を固定化したラテックス粒子、及び
（３）抗ＩｇＭ抗体。
　このようなキットでは、抗ＩｇＭ抗体存在下において、遊離ＡＩＭを介して第一抗ＡＩＭ抗体と第二抗ＡＩＭ抗体とが凝集する。凝集の程度を光学的手段を用いて検出することにより、生物学的試料中における遊離ＡＩＭ濃度を求めることができる。

　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に説明のない限りは、％は重量％を示す。

〔実施例１：総ＡＩＭ測定系による複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭ量の測定〕
　１．ヒト検体のカラムクロマトグラフィーでの分離
　ヒト検体10μLをサイズ排除クロマトグラフィー（TSKgel G3000 SWXL ，東ソー）にてサイズ分画し、複合体ＡＩＭと遊離ＡＩＭの各フラクションを得た（複合体ＡＩＭ：フラクションＮｏ．６，　７、遊離ＡＩＭ：フラクションＮｏ．１４，１５）。またHPLCはリン酸バッファーを用いて流速１ｍL／分で実施し各フラクションを５００μLずつ分取した。

　２．抗ＡＩＭモノクローナル抗体結合磁気ビーズの作製
１）１５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で透析した抗ＡＩＭモノクローナル抗体の吸光度を測定し、同緩衝液を用いてＡｂｓ　０．５に調製した。
２）Ｄｙｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　社製　Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－４５０　Ｅｐｏｘｙ　１ｍＬ（３０　ｍｇ／ｍＬ）を上記緩衝液で３回洗浄し、１）の抗体液を１ｍＬ添加した。２５℃にて回転攪拌を１８時間以上実施した。
３）ビーズブロッキングバッファー［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％ＢＳＡ，０．０９％　ＮａＮ_３，ｐＨ７．８］でビーズを２回洗浄した。洗浄により緩衝液を取り除くことで溶液中に残存していたビーズ未結合の抗ＡＩＭモノクローナル抗体を除去した。その後ビーズブロッキングバッファーを１ｍＬ加え攪拌し２５℃にて回転攪拌を１８時間以上実施した。
４）ビーズブロッキングバッファーでビーズを２回洗浄後、ビーズブロッキングバッファーを１ｍＬ加え攪拌した。これを抗ＡＩＭモノクローナル抗体結合磁気ビーズとし、使用時まで４℃で保存した。

　３．ルテニウム標識抗ＡＩＭモノクローナル抗体の作製
１）１５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で透析済みの、抗ＡＩＭモノクローナル抗体液（磁気ビーズに結合させた抗ＡＩＭモノクローナル抗体とはエピトープが異なる抗体）３１２．５μＬに１０ｍｇ／ｍＬのルテニウム錯体（ＩＧＥＮ社製　Ｏｒｉｇｉｎ　Ｔａｇ－ＮＨＳ　ＥＳＴＥＲ）を１４．１μＬ加え、３０分間攪拌した。その後、２Ｍ　グリシンを５０μＬ添加し、２０分間攪拌した。
２）直径１ｃｍ、高さ３０ｃｍのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス社製　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５）にルテニウム錯体標識抗ＡＩＭモノクローナル抗体をアプライし、未標識のルテニウム錯体とルテニウム錯体標識抗ＡＩＭモノクローナル抗体を単離精製した。溶出は、１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて行った。

　４．各フラクションの測定
１）複合体ＡＩＭフラクション（No. ６，　７）を１０μＬずつ取り、合計２０μＬ分を２００μＬの反応用溶液［５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ　ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％　ＢＳＡ，０．０９％　ＮａＮ_３，１００μｇ／ｍＬ　マウスＩｇＧ，ｐＨ７．８］又は抗ＩｇＭ抗体含有反応用溶液へ添加した。同様に、遊離ＡＩＭフラクション（Ｎｏ．１４，１５）を１０μＬずつ取り、合計２０μＬ分を２００μＬの反応用溶液又は抗ＩｇＭ抗体含有反応用溶液へ添加した。抗ＩｇＭ抗体としては、モノクローナル抗体（ＨＢＲ－６、ＨＢＲ－２０、５０μｇ／ｍＬとなるように調整）又はポリクローナル抗体（Ｐ０９１１（Trina Bioreactives AG）、０．１２５％となるように調整）を用いた。
２）そこにビーズ希釈液［５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，１００ｍＭ　ＮａＣｌ，０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ　ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％　ＢＳＡ，０．０９％　ＮａＮ_３，ｐＨ７．８］で０．５ｍｇ／ｍＬ濃度に希釈したＮｏ．１２抗体結合磁気ビーズを２５μＬずつ添加し、３０℃で９分間反応させた（第一反応）。
　その後、磁気ビーズを磁石でトラップし、反応管内の液体を抜き取り、洗浄液［５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ，０．０１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，０．１５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ，ｐＨ７，５］３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。
３）次にルテニウム用希釈溶液［５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ　ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％　ＢＳＡ，０．０９％　ＮａＮ_３，１００μｇ／ｍＬ　マウスＩｇＧ，ｐＨ７．８］で０．６μｇ／ｍＬ濃度に希釈したルテニウム標識Ｎｏ．１１抗体を２００μＬ加えて３０℃で９分間反応させた（第二反応）。
　反応後の磁気ビーズを磁石でトラップし反応管内の液体を抜き取り、洗浄液３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。
４）その後、反応管に３００μＬのトリプロピルアミンを入れ、磁気ビーズと混合した。この状態で電気エネルギーを与えることでルテニウム錯体が発光し、その発光強度を検出機で検出した。
　なお、上記反応管への磁気ビーズ添加操作以降は、ルテニウム錯体発光自動測定機であるピコルミＩＩＩ上で実施した。

　結果を図１に示す。Ｆ６＋Ｆ７のカウント比率が基準よりも低くなるほど、抗体の複合体ＡＩＭへの非特異的反応が抑制されたと考えられる。また、Ｆ１４＋Ｆ１５のカウント比率が基準よりも低くなるほど、抗体の遊離ＡＩＭへの感度が低下したと考えられる。抗ＩｇＭ抗体を添加した測定系では、添加していない測定系に対して、Ｆ６＋Ｆ７のカウント比率が、３７．４％（ＨＢＲ－６）、５５．８％（ＨＢＲ－２０）、及び４．４％（Ｐ０９１１）となり、いずれの測定系においても抗ＡＩＭ抗体の複合体ＡＩＭへの非特異的反応が抑制された。すなわち、ＨＢＲ－６を添加した系では、添加していない系と比較して非特異反応が約６３％減少し、ＨＢＲ－２０を添加した系では、添加していない系と比較して非特異反応が約４４％減少し、Ｐ０９１１を添加した系では、添加していない系と比較して非特異反応が約９６％減少した。したがって、抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料と抗ＡＩＭ抗体とを反応させることにより、複合体ＡＩＭ由来の非特異反応を抑制できることが示された。

　本発明によれば、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料において、抗ＡＩＭ抗体の遊離ＡＩＭに対する特異性を向上させることができる。

Claims

　複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析方法であって、抗ＩｇＭ抗体の存在下で、前記生物学的試料と抗ＡＩＭ抗体とを接触させることを含む、前記方法。
　前記生物学的試料が、体液試料である、請求項１に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析方法。
　前記生物学的試料が、血液、血清、血漿又は尿である、請求項１又は２に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析方法。
　抗ＡＩＭ抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項１～３のいずれかに記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析方法。
　抗ＩｇＭ抗体と、抗ＡＩＭ抗体と、を含む、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の測定キット。
　前記生物学的試料が、体液試料である、請求項５に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の測定キット。
　前記生物学的試料が、血液、血清、血漿又は尿である、請求項５又は６に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の測定キット。
　抗ＡＩＭ抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項５～７のいずれかに記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の測定キット。
　複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析における非特異反応抑制方法であって、抗ＩｇＭ抗体の存在下で、前記生物学的試料と抗ＡＩＭ抗体とを接触させることを含む、前記方法。
　前記生物学的試料が、体液試料である、請求項９に記載の非特異反応抑制方法。
　前記非特異反応が、生物学的試料中のＩｇＭに由来する非特異反応である、請求項９又は１０に記載の非特異反応抑制方法。