JP7315966B2 - 生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法及び分析キットに関する。本発明は、遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体にも関する。
ＡＩＭ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）は組織マクロファージにより産生される、分子量約５０ｋＤａ分泌型の血中タンパク質である。ＡＩＭは、システイン残基を多く含む特異的な配列であるｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ（ＳＲＣＲ）ドメインをタンデムに３つ（ＳＲＣＲ１ドメイン、ＳＲＣＲ２ドメイン、及びＳＲＣＲ３ドメイン）つなげた構造をしている。それぞれのシステイン残基は各ドメイン内で互いにジスルフィド結合することで、コンパクトな球状の立体構造をしていると考えられている。
ＡＩＭは、リポ多糖、ＩｇＭ、補体制御因子、及び脂肪酸合成酵素など，さまざまな分子と結合するという特徴を持つことが知られている。中でも、ＡＩＭは、血中においてＩｇＭとの複合体の形態で存在することが知られている。ＩｇＭは５００ｋＤａをこえる巨大なタンパク質複合体であるため、ＩｇＭに結合しているかぎりＡＩＭも糸球体を通過して尿へと移行することはなく、ＡＩＭの高い血中濃度が保たれる。ＩｇＭから解離するとＡＩＭはすみやかに尿へと排泄される。したがって、大部分のＡＩＭは血液中においてＩｇＭと複合体を形成しており、結合体ではなく遊離状態で血中に存在することはほとんどない。
近年、ＡＩＭが、インスリン抵抗性又は動脈硬化などのさまざまな疾患における病態の進行に関与することが明らかにされている。例えば、特許文献１では、他の結合パートナーと結合していない遊離の形態で存在する遊離ＡＩＭと肝疾患との関係について報告されている。
遊離ＡＩＭ量の測定結果に基づき特定の疾患を診断する場合、複合体を形成しているＡＩＭの量を排除し、遊離ＡＩＭ量のみを測定する必要がある。しかしながら、遊離ＡＩＭを検出する際に、他の結合パートナーと結合している複合体ＡＩＭも検出してしまう場合があった。したがって、複雑な操作を伴うことなく複合体を形成しているＡＩＭ量を排除し、遊離ＡＩＭ量のみを測定することが可能な技術が望まれていた。
本発明の目的は、優れた特異性及び感度を有する、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析方法及び分析キット、並びに優れた特異性及び感度を有する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を提供することにある。
本発明の目的は、優れた特異性及び感度を有する、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析方法及び分析キット、並びに優れた特異性及び感度を有する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を提供することにある。
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討し、複合体ＡＩＭには反応せず、遊離ＡＩＭには反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体、並びに複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭのいずれにも反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を作出した。そして、複合体ＡＩＭには反応せず、遊離ＡＩＭには反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体は、ＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメインをエピトープとして認識していることを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的に、本発明は以下のとおりである。
＜１＞遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を用いる生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法であって、前記抗ＡＩＭモノクローナル抗体が、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合する抗体である前記免疫学的分析方法、
＜２＞前記生物学的試料が、体液試料である、＜１＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜３＞
前記体液試料が、血清、血漿、血液及び尿からなる群から選択される、＜２＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜４＞ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメインが、配列番号３で表されるアミノ酸配列で表される、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の免疫学的分析方法、
＜５＞遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する前記抗ＡＩＭモノクローナル抗体が、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合し、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ１ドメイン中のアミノ酸配列に結合しない抗体である、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の免疫学的分析方法、
＜６＞遊離ＡＩＭ及び複合体ＡＩＭのいずれにも反応する性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体をさらに使用する、＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜７＞遊離ＡＩＭに反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体であって、ＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合することを特徴とする前記モノクローナル抗体、
＜８＞ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメインが、配列番号３で表されるアミノ酸配列で表される、＜７＞に記載のモノクローナル抗体、
＜９＞遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する前記抗ＡＩＭモノクローナル抗体が、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合し、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ１ドメイン中のアミノ酸配列に結合しない抗体である、＜７＞又は＜８＞に記載のモノクローナル抗体、
＜１０＞
遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する前記抗ＡＩＭモノクローナル抗体が、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合し、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ１ドメイン中のアミノ酸配列、及びヒトＡＩＭのＳＲＣＲ３ドメイン中のアミノ酸配列のいずれにも結合しない抗体である、＜９＞に記載のモノクローナル抗体、
＜１１＞＜６＞～＜１０＞のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜１２＞前記生物学的試料が、体液試料である、＜１１＞に記載の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜１３＞ 前記体液試料が、血清、血漿、血液及び尿からなる群から選択される、＜１２＞に記載の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜１４＞遊離ＡＩＭ及び複合体ＡＩＭのいずれにも反応する性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体をさらに含む、＜１１＞～＜１３＞のいずれかに記載の遊離ＡＩＭ分析キット。
具体的に、本発明は以下のとおりである。
＜１＞遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を用いる生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法であって、前記抗ＡＩＭモノクローナル抗体が、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合する抗体である前記免疫学的分析方法、
＜２＞前記生物学的試料が、体液試料である、＜１＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜３＞
前記体液試料が、血清、血漿、血液及び尿からなる群から選択される、＜２＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜４＞ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメインが、配列番号３で表されるアミノ酸配列で表される、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の免疫学的分析方法、
＜５＞遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する前記抗ＡＩＭモノクローナル抗体が、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合し、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ１ドメイン中のアミノ酸配列に結合しない抗体である、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の免疫学的分析方法、
＜６＞遊離ＡＩＭ及び複合体ＡＩＭのいずれにも反応する性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体をさらに使用する、＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜７＞遊離ＡＩＭに反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体であって、ＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合することを特徴とする前記モノクローナル抗体、
＜８＞ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメインが、配列番号３で表されるアミノ酸配列で表される、＜７＞に記載のモノクローナル抗体、
＜９＞遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する前記抗ＡＩＭモノクローナル抗体が、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合し、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ１ドメイン中のアミノ酸配列に結合しない抗体である、＜７＞又は＜８＞に記載のモノクローナル抗体、
＜１０＞
遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する前記抗ＡＩＭモノクローナル抗体が、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合し、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ１ドメイン中のアミノ酸配列、及びヒトＡＩＭのＳＲＣＲ３ドメイン中のアミノ酸配列のいずれにも結合しない抗体である、＜９＞に記載のモノクローナル抗体、
＜１１＞＜６＞～＜１０＞のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜１２＞前記生物学的試料が、体液試料である、＜１１＞に記載の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜１３＞ 前記体液試料が、血清、血漿、血液及び尿からなる群から選択される、＜１２＞に記載の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜１４＞遊離ＡＩＭ及び複合体ＡＩＭのいずれにも反応する性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体をさらに含む、＜１１＞～＜１３＞のいずれかに記載の遊離ＡＩＭ分析キット。
本発明によれば、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料において、遊離ＡＩＭを正確に検出することができる。
（生物学的試料）
本発明において分析可能な生物学的試料としては、主に生体（生物）由来の固形組織及び体液試料を挙げることができ、体液試料を用いることが好ましい。本発明において分析可能な生物学的試料は、より好ましくは、血液、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、涙液、耳漏、又は前立腺液等の体液試料であり、さらに好ましくは血液、血清、血漿又は尿である。生体又は対象は、ヒト又は動物（例えば、マウス、モルモット、ラット、サル、イヌ、ネコ、ハムスター、ウマ、ウシ、及びブタ）を含み、好ましくはヒトである。対象からの生物学的試料は、本発明の実施時に採取または調製されたものでもよく、予め採取または調製され保存されたものであってもよい。試料を調製する者と試料中の遊離ＡＩＭ量を分析する者とは別の者であってもよい。生物学的試料は、インビボの試料であることができる。本発明において、生物学的試料は、遊離ＡＩＭと複合体ＡＩＭの両方を含む。
本発明において分析可能な生物学的試料としては、主に生体（生物）由来の固形組織及び体液試料を挙げることができ、体液試料を用いることが好ましい。本発明において分析可能な生物学的試料は、より好ましくは、血液、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、涙液、耳漏、又は前立腺液等の体液試料であり、さらに好ましくは血液、血清、血漿又は尿である。生体又は対象は、ヒト又は動物（例えば、マウス、モルモット、ラット、サル、イヌ、ネコ、ハムスター、ウマ、ウシ、及びブタ）を含み、好ましくはヒトである。対象からの生物学的試料は、本発明の実施時に採取または調製されたものでもよく、予め採取または調製され保存されたものであってもよい。試料を調製する者と試料中の遊離ＡＩＭ量を分析する者とは別の者であってもよい。生物学的試料は、インビボの試料であることができる。本発明において、生物学的試料は、遊離ＡＩＭと複合体ＡＩＭの両方を含む。
（ＡＩＭ）
ＡＩＭ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）は組織マクロファージにより産生される、分子量約５０ｋＤａ分泌型の血中タンパク質である。ＡＩＭは、システイン残基を多く含む特異的な配列であるｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ（ＳＲＣＲ）ドメインをタンデムに３つつなげた構造をしており、それぞれのシステイン残基は各ドメイン内で互いにジスルフィド結合することで、コンパクトな球状の立体構造をしていると考えられている。
ＡＩＭ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）は組織マクロファージにより産生される、分子量約５０ｋＤａ分泌型の血中タンパク質である。ＡＩＭは、システイン残基を多く含む特異的な配列であるｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ（ＳＲＣＲ）ドメインをタンデムに３つつなげた構造をしており、それぞれのシステイン残基は各ドメイン内で互いにジスルフィド結合することで、コンパクトな球状の立体構造をしていると考えられている。
ヒトＡＩＭは、配列番号１で表される３４７アミノ酸から成り、システインを多く含む３つのＳＲＣＲドメインを含んでいる。ＳＲＣＲ１ドメインは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号２４～１２５に該当する。ＳＲＣＲ２ドメインは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１３８～２３９に該当する。ＳＲＣＲ３ドメインは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号２４４～３４６に該当する。
ヒトAIMのアミノ酸配列は以下のとおりである。
MALLFSLILAICTRPGFLASPSGVRLVGGLHRCEGRVEVEQKGQWGTVCDDGWDIKDVAVLCRELGCGAASGTPSGILYEPPAEKEQKVLIQSVSCTGTEDTLAQCEQEEVYDCSHDEDAGASCENPESSFSPVPEGVRLADGPGHCKGRVEVKHQNQWYTVCQTGWSLRAAKVVCRQLGCGRAVLTQKRCNKHAYGRKPIWLSQMSCSGREATLQDCPSGPWGKNTCNHDEDTWVECEDPFDLRLVGGDNLCSGRLEVLHKGVWGSVCDDNWGEKEDQVVCKQLGCGKSLSPSFRDRKCYGPGVGRIWLDNVRCSGEEQSLEQCQHRFWGFHDCTHQEDVAVICSG（配列番号１）
すなわち、ヒトＡＩＭ中の、ＳＲＣＲ１ドメイン、ＳＲＣＲ２ドメイン、及びＳＲＣＲ３ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ以下の通りである。
ＳＲＣＲ１ドメイン：
VRLVGGLHRCEGRVEVEQKGQWGTVCDDGWDIKDVAVLCRELGCGAASGTPSGILYEPPAEKEQKVLIQSVSCTGTEDTLAQCEQEEVYDCSHDEDAGASCE（配列番号２）
ＳＲＣＲ２ドメイン：
VRLADGPGHCKGRVEVKHQNQWYTVCQTGWSLRAAKVVCRQLGCGRAVLTQKRCNKHAYGRKPIWLSQMSCSGREATLQDCPSGPWGKNTCNHDEDTWVECE（配列番号３）
ＳＲＣＲ３ドメイン：
LRLVGGDNLCSGRLEVLHKGVWGSVCDDNWGEKEDQVVCKQLGCGKSLSPSFRDRKCYGPGVGRIWLDNVRCSGEEQSLEQCQHRFWGFHDCTHQEDVAVICS（配列番号４）
ヒトAIMのアミノ酸配列は以下のとおりである。
MALLFSLILAICTRPGFLASPSGVRLVGGLHRCEGRVEVEQKGQWGTVCDDGWDIKDVAVLCRELGCGAASGTPSGILYEPPAEKEQKVLIQSVSCTGTEDTLAQCEQEEVYDCSHDEDAGASCENPESSFSPVPEGVRLADGPGHCKGRVEVKHQNQWYTVCQTGWSLRAAKVVCRQLGCGRAVLTQKRCNKHAYGRKPIWLSQMSCSGREATLQDCPSGPWGKNTCNHDEDTWVECEDPFDLRLVGGDNLCSGRLEVLHKGVWGSVCDDNWGEKEDQVVCKQLGCGKSLSPSFRDRKCYGPGVGRIWLDNVRCSGEEQSLEQCQHRFWGFHDCTHQEDVAVICSG（配列番号１）
すなわち、ヒトＡＩＭ中の、ＳＲＣＲ１ドメイン、ＳＲＣＲ２ドメイン、及びＳＲＣＲ３ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ以下の通りである。
ＳＲＣＲ１ドメイン：
VRLVGGLHRCEGRVEVEQKGQWGTVCDDGWDIKDVAVLCRELGCGAASGTPSGILYEPPAEKEQKVLIQSVSCTGTEDTLAQCEQEEVYDCSHDEDAGASCE（配列番号２）
ＳＲＣＲ２ドメイン：
VRLADGPGHCKGRVEVKHQNQWYTVCQTGWSLRAAKVVCRQLGCGRAVLTQKRCNKHAYGRKPIWLSQMSCSGREATLQDCPSGPWGKNTCNHDEDTWVECE（配列番号３）
ＳＲＣＲ３ドメイン：
LRLVGGDNLCSGRLEVLHKGVWGSVCDDNWGEKEDQVVCKQLGCGKSLSPSFRDRKCYGPGVGRIWLDNVRCSGEEQSLEQCQHRFWGFHDCTHQEDVAVICS（配列番号４）
（遊離ＡＩＭ）
本明細書において、「遊離ＡＩＭ」とは、リポ多糖又はＩｇＭ等の他の物質と結合していない、遊離状態で存在するＡＩＭを意味する。これに対し、本明細書において、リポ多糖又はＩｇＭ等の他の物質と結合しており、他の物質との複合体の状態で存在するＡＩＭを複合体ＡＩＭと称する。遊離ＡＩＭとは、好ましくは、ヒトの遊離ＡＩＭであり、複合体ＡＩＭとは、好ましくは、ヒトの複合体ＡＩＭである。
本明細書において、「遊離ＡＩＭ」とは、リポ多糖又はＩｇＭ等の他の物質と結合していない、遊離状態で存在するＡＩＭを意味する。これに対し、本明細書において、リポ多糖又はＩｇＭ等の他の物質と結合しており、他の物質との複合体の状態で存在するＡＩＭを複合体ＡＩＭと称する。遊離ＡＩＭとは、好ましくは、ヒトの遊離ＡＩＭであり、複合体ＡＩＭとは、好ましくは、ヒトの複合体ＡＩＭである。
本明細書において「非特異反応」とは、本発明において使用される抗ＡＩＭモノクローナル抗体に、遊離ＡＩＭ以外の物質、特に複合体ＡＩＭが結合することを意味する。
（遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体）
本発明の免疫学的分析方法では、遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を用いる。「遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない」とは、遊離ＡＩＭとは反応するが、他の物質、特に複合体ＡＩＭとは実質的に反応しないことを意味する。「実質的に反応しない」の意味は後述する。以下、「遊離ＡＩＭに反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体」を、「遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体」と呼ぶことがある。本明細書では、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体に対して、遊離ＡＩＭと複合体ＡＩＭのいずれにも反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を、単に「抗ＡＩＭモノクローナル抗体」と称する。
本発明において、「遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を用いる」とは、遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を用いて、遊離ＡＩＭを定量することを意味する。「遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を用いる」は、以下の工程を含むことができる。
遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体と生物学的試料とを接触させる工程。
本発明の免疫学的分析方法では、遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を用いる。「遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない」とは、遊離ＡＩＭとは反応するが、他の物質、特に複合体ＡＩＭとは実質的に反応しないことを意味する。「実質的に反応しない」の意味は後述する。以下、「遊離ＡＩＭに反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体」を、「遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体」と呼ぶことがある。本明細書では、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体に対して、遊離ＡＩＭと複合体ＡＩＭのいずれにも反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を、単に「抗ＡＩＭモノクローナル抗体」と称する。
本発明において、「遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を用いる」とは、遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を用いて、遊離ＡＩＭを定量することを意味する。「遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を用いる」は、以下の工程を含むことができる。
遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体と生物学的試料とを接触させる工程。
本発明の免疫学的分析方法では、遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する２種以上の抗ＡＩＭモノクローナル抗体を用いることが好ましい。前記２種以上の抗ＡＩＭモノクローナル抗体は、それぞれ異なるエピトープを認識することが好ましい。
本発明の免疫学的分析方法では、遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体に加えて、遊離ＡＩＭ及び複合体ＡＩＭのいずれにも反応する性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体をさらに使用することができる。遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する前記抗ＡＩＭモノクローナル抗体と遊離ＡＩＭ及び複合体ＡＩＭのいずれにも反応する性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体は、それぞれ異なるエピトープを認識することが好ましい。
本発明の免疫学的分析方法において用いられる、遊離ＡＩＭには反応するが複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体は、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープ、好ましくは立体構造であるエピトープに結合する。本発明の免疫学的分析方法において用いられる、遊離ＡＩＭには反応するが複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体は、好ましくは、ＳＲＣＲ１ドメインには結合せず、さらに好ましくは、ＳＲＣＲ１ドメイン及びＳＲＣＲ３ドメインのいずれにも結合しない。
本発明の免疫学的分析方法では、遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体に加えて、遊離ＡＩＭ及び複合体ＡＩＭのいずれにも反応する性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体をさらに使用することができる。遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する前記抗ＡＩＭモノクローナル抗体と遊離ＡＩＭ及び複合体ＡＩＭのいずれにも反応する性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体は、それぞれ異なるエピトープを認識することが好ましい。
本発明の免疫学的分析方法において用いられる、遊離ＡＩＭには反応するが複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体は、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープ、好ましくは立体構造であるエピトープに結合する。本発明の免疫学的分析方法において用いられる、遊離ＡＩＭには反応するが複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体は、好ましくは、ＳＲＣＲ１ドメインには結合せず、さらに好ましくは、ＳＲＣＲ１ドメイン及びＳＲＣＲ３ドメインのいずれにも結合しない。
本明細書において、遊離ＡＩＭと「反応する」、遊離ＡＩＭを「認識する」、遊離ＡＩＭと「結合する」は、同義で用いられるが、これらの例示に限定されることはなく、最も広義に解釈する必要がある。抗体が遊離ＡＩＭなどの抗原（化合物）と「反応する」か否かの確認は、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などにより行うことができるほか、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の原理を利用した方法（ＳＰＲ法）などにより行うことができる。ＳＰＲ法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の名称で市販されている、装置、センサー、試薬類を使用して行うことができる。
使用される抗体と、ある化合物が「反応しない」とは、本発明に使用される抗体がある化合物と実質的に反応しないことをいう。「実質的に反応しない」とは、例えば、上記ＳＰＲ法に基づき、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００やＴ２００を使用し、本発明の抗体を固定化して測定を行った場合に、本発明に使用される抗体の反応性の増強が認められないことをいう。詳細には、抗体と化合物との反応性が、コントロール（化合物非添加）の反応性と比べて有意な差がないことをいう。上記ＳＰＲ法以外の当業者に周知の方法又は手段によっても「実質的に反応しない」ことを確認できるのはいうまでもない。
本発明の免疫学的分析方法において使用される、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体の遊離ＡＩＭへの結合親和性は、本発明の効果が得られる限りにおいて特に限定されることはないが、例えば、ＩｇＭに対して少なくとも約１０-4Ｍ、少なくとも約１０-5Ｍ、少なくとも約１０-6Ｍ、少なくとも約１０-7Ｍ、少なくとも約１０-8Ｍ、少なくとも約１０-9Ｍ、少なくとも約１０-10Ｍ、少なくとも約１０-11Ｍ、少なくとも約１０-12Ｍ、またはそれ以上のＫｄであることができる。
本発明の免疫学的分析方法において使用される抗体は、抗原（免疫原）として遊離ＡＩＭをリン酸緩衝生理食塩水などの溶媒に溶解し、この溶液を動物に投与して免疫することにより製造できる。必要に応じて前記溶液に適宜のアジュバントを添加した後、エマルジョンを用いて免疫を行ってもよい。アジュバントとしては、油中水型乳剤、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲルなどの汎用されるアジュバントのほか、生体成分由来のタンパク質やペプチド性物質などを用いてもよい。例えば、フロイントの不完全アジュバント又はフロイントの完全アジュバントなどを好適に用いることができる。アジュバントの投与経路、投与量、投与時期は特に限定されないが、抗原を免疫する動物において所望の免疫応答を増強できるように適宜選択することが望ましい。
免疫に用いる動物の種類も特に限定されないが、哺乳動物が好ましく、例えばマウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどを用いることができ、より好ましくはマウス又はラットを用いることができる。動物の免疫は、一般的な手法に従って行えばよく、例えば、抗原の溶液、好ましくはアジュバントとの混合物を動物の皮下、皮内、静脈、又は腹腔内に注射することにより免疫を行うことができる。免疫応答は、一般的に免疫される動物の種類及び系統によって異なるので、免疫スケジュールは使用される動物に応じて適宜設定することが望ましい。抗原投与は最初の免疫後に何回か繰り返し行うことが好ましい。
モノクローナル抗体を得るために、引き続き以下の操作が行われるがそれに限定されることはなく、モノクローナル抗体それ自体の製造方法については当業界で周知されており、かつ汎用されているので当業者は前記の抗原を用いることによって本発明の免疫学的分析方法において使用されるモノクローナル抗体を容易に製造することが可能である（例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８） 第６章などを参照のこと）。
最終免疫後、免疫した動物から抗体産生細胞である脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を摘出し、高い増殖能を有する骨髄腫由来の細胞株と細胞融合することによりハイブリドーマを作製することができる。細胞融合には抗体産生能（質・量）が高い細胞を用いることが好ましく、また骨髄腫由来の細胞株は融合する抗体産生細胞の由来する動物と適合性があることが好ましい。細胞融合は、当該分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などを採用することができる。得られたハイブリドーマは当業界で汎用の条件に従って増殖させることができる。産生される抗体の性質を確認しつつ所望のハイブリドーマを選択することができる。ハイブリドーマのクローニングは、例えば限界希釈法や軟寒天法などの周知の方法により行うことが可能である。
ハイブリドーマの選択は、産生される抗体が実際の測定に用いられる条件を考慮し、選択の段階で効率的に行うこともできる。例えば、動物に免疫して得られた抗体を、交差反応性を確認したい化合物（複合体ＡＩＭ）の存在下、固相に固定化した遊離ＡＩＭと反応させ、交差反応性を確認したい化合物（複合体ＡＩＭ）の非存在下での反応性と比較することにより所望の抗体を産生するハイブリドーマをより効率よく選抜することができる。また、動物に免疫して得られた抗体を、生物試料由来成分の存在下、固相に固定化した遊離ＡＩＭと反応させ、生物試料由来成分の非存在下での反応性と比較することにより所望の抗体を産生するハイブリドーマをより効率よく選択することもできる。
クローニング工程後、産生される抗体と遊離ＡＩＭとの結合能をＥＣＬ法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法などの方法を用いてアッセイすることにより、選択されたハイブリドーマが所望の性質を有するモノクローナル抗体を産生するか否かを確認することができる。
前記のようにして選別されたハイブリドーマを大量培養することにより、所望の特性を有するモノクローナル抗体を製造することができる。大量培養の方法は特に限定されないが、例えば、ハイブリドーマを適宜の培地中で培養してモノクローナル抗体を培地中に産生させる方法を挙げることができる。哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを注射して増殖させ、腹水中に抗体を産生させる方法なども挙げることができる。モノクローナル抗体の精製は、先述した抗血清からの抗体の精製法、例えばＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などを適宜組み合わせて行うことができる。
前記のようにして選別されたハイブリドーマを大量培養することにより、所望の特性を有するモノクローナル抗体を製造することができる。大量培養の方法は特に限定されないが、例えば、ハイブリドーマを適宜の培地中で培養してモノクローナル抗体を培地中に産生させる方法を挙げることができる。哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを注射して増殖させ、腹水中に抗体を産生させる方法なども挙げることができる。モノクローナル抗体の精製は、先述した抗血清からの抗体の精製法、例えばＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などを適宜組み合わせて行うことができる。
本発明の免疫学的分析方法において使用されるモノクローナル抗体としては、抗体分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントを使用することも可能である。前記のように動物への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術を使用して得られるものやキメラ抗体を用いることも可能である。抗体の断片としては機能性の断片であることが好ましく、例えば、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'などが挙げられる。これらのフラグメントは前記のようにして得られる抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。
また、本発明の免疫学的分析方法において抗体は、不溶性担体上に固定された固定（固相）化抗体として使用したり、後述する当業者に周知慣用の標識物質で標識した標識抗体として使用することができる。例えば、不溶性担体にモノクローナル抗体を物理的に吸着させ、あるいは化学的に結合（適当なスペーサーを介してよい）させることにより固定抗体を製造することができる。不溶性担体としては、ポリスチレン樹脂などの高分子基材、ガラスなどの無機基材、セルロースやアガロースなどの多糖類基材などからなる不溶性担体を用いることができ、その形状は特に限定されず、板状（例えば、マイクロプレートやメンブレン）、ビーズあるいは粒子状（例えば、ラテックス粒子）、筒状（例えば、試験管）など任意の形状を選択できる。
本発明の免疫学的分析方法において使用される抗体と結合可能な標識抗体（二次抗体）を用いることにより、遊離ＡＩＭに結合した抗体の量を測定することができ、それにより生体試料中の遊離ＡＩＭを検出することができる。標識抗体を製造するための標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、又は放射性同位体、金コロイド粒子、着色ラテックスなどが挙げられる。標識物質と抗体との結合法としては、当業者に利用可能なグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、又は過ヨウ素酸法などの方法を用いることができるが、固定抗体や標識抗体の種類及
びそれらの製造方法は前記の例に限定されることはない。例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）などの酵素を標識物質として用いる場合にはその酵素の特異的基質（酵素がＨＲＰの場合には、例えばＯ-フェニレンジアミン（ＯＰＤ）あるいは３，３'，５，５'-テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ＡＬＰの場合にはｐ-ニトロフェニル・ホスフェートなど） を用いて酵素活性を測定することができる。ビオチンを標識物質として用いる場合には少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的である。
びそれらの製造方法は前記の例に限定されることはない。例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）などの酵素を標識物質として用いる場合にはその酵素の特異的基質（酵素がＨＲＰの場合には、例えばＯ-フェニレンジアミン（ＯＰＤ）あるいは３，３'，５，５'-テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ＡＬＰの場合にはｐ-ニトロフェニル・ホスフェートなど） を用いて酵素活性を測定することができる。ビオチンを標識物質として用いる場合には少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的である。
本明細書において、「不溶性担体」を「固相」、抗原や抗体を不溶性担体に物理的あるいは化学的に担持させることあるいは担持させた状態を「固定」、「固定化」、「固相化」と表現することがある。また、「分析」、「検出」、又は「測定」という用語は、遊離ＡＩＭの存在の証明及び／又は定量などを含めて最も広義に解釈する必要があり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
本発明の免疫学的分析方法では、少なくとも１つの遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を使用する。測定対象となる遊離ＡＩＭを異なるエピトープを認識する２種の抗体でサンドイッチするいわゆるサンドイッチアッセイを行う場合、一方の抗体が遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体であればよく、もう一方の抗体は抗ＡＩＭモノクローナル抗体であればよいが、２種の抗体いずれもが遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体であることが好ましい。測定対象となる遊離ＡＩＭを異なるエピトープを認識する２種の抗体でサンドイッチするいわゆるサンドイッチアッセイを行う場合、２種の抗体が、それぞれ異なるエピトープを認識することが好ましい。また、ＥＣＬ法又はＥＬＩＳＡ法を行う場合は、固相に固定化された固相抗体として遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を使用することが好ましい。
（免疫学的分析方法）
本発明において使用される免疫学的分析方法としては、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）、ＥＬＩＳＡ、酵素免疫測定法、免疫組織染色法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフ法、EATA法（Electrokinetic Analyte Transport Assay）及び高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明において使用される免疫学的分析方法としては、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）、ＥＬＩＳＡ、酵素免疫測定法、免疫組織染色法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフ法、EATA法（Electrokinetic Analyte Transport Assay）及び高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
使用される抗体と結合可能な標識抗体（二次抗体）を用いることにより、遊離ＡＩＭに結合した抗体の量を測定することができ、それにより生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量を測定することができる。標識抗体を製造するための標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、放射性同位体、金コロイド粒子、又は着色ラテックスなどが挙げられる。当業者であれば、使用される抗体と標識物質に応じて、免疫学的分析方法を適宜選択することができる。
免疫学的分析方法としては、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）を用いることが好ましい。電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）とは、標識物質を電気化学的刺激により発光させ，その発光量を検出することで被検出物質量を算出する方法を意味する。電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）では、標識物質として、ルテニウム錯体を用いることができる。固相（マイクロプレート又はビーズ等）に電極を設置してこの電極上で電気化学的刺激を起こすことにより、このルテニウム錯体の発光量を検出することができる。
遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を固相抗体及び検出抗体のいずれの用途として用いてもよいが、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を固相抗体として用い、固相抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を検出抗体（標識抗体）として用いて電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）を行うことが好ましい。遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を固相抗体として用い、標識抗体として抗ＡＩＭモノクローナル抗体を用い、そして、固相としてビーズ、標識としてルテニウム錯体をそれぞれ用いた際の測定原理は、以下のとおりである。下記は本発明の一実施態様における測定原理を示すものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
１．遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体が結合したビーズと試料とを反応させると、試料中の遊離ＡＩＭがビーズに結合した固相抗体と結合する。
２．ビーズを洗浄後、ビーズに結合した遊離ＡＩＭに、ルテニウム標識抗体を反応させる
と、サンドイッチ状に結合する。
３．ビーズを洗浄後、電極上にて電気エネルギーを加えると、遊離ＡＩＭを介してビーズに結合したルテニウム標識抗体量に応じて、ルテニウム錯体が発光する。この発光量を計測することにより、検体中の遊離ＡＩＭ量を測定することができる。
また、ルテニウム標識抗体として、固相抗体とは異なるエピトープを認識する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を使用することもできる。
遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を固相抗体及び検出抗体のいずれの用途として用いてもよいが、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を固相抗体として用い、固相抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を検出抗体（標識抗体）として用いて電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）を行うことが好ましい。遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を固相抗体として用い、標識抗体として抗ＡＩＭモノクローナル抗体を用い、そして、固相としてビーズ、標識としてルテニウム錯体をそれぞれ用いた際の測定原理は、以下のとおりである。下記は本発明の一実施態様における測定原理を示すものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
１．遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体が結合したビーズと試料とを反応させると、試料中の遊離ＡＩＭがビーズに結合した固相抗体と結合する。
２．ビーズを洗浄後、ビーズに結合した遊離ＡＩＭに、ルテニウム標識抗体を反応させる
と、サンドイッチ状に結合する。
３．ビーズを洗浄後、電極上にて電気エネルギーを加えると、遊離ＡＩＭを介してビーズに結合したルテニウム標識抗体量に応じて、ルテニウム錯体が発光する。この発光量を計測することにより、検体中の遊離ＡＩＭ量を測定することができる。
また、ルテニウム標識抗体として、固相抗体とは異なるエピトープを認識する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を使用することもできる。
イムノアッセイの中で、酵素標識を用いるＥＬＩＳＡ法も、簡便且つ迅速に標的を測定することができて好ましい。サンドイッチＥＬＩＳＡの場合、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を固定化した不溶性担体と、標識物質で標識された、固定抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭモノクローナル抗体とを使用することができる。この場合、不溶性担体はプレート（イムノプレート）が好ましく、標識物質は、適宜選択して使用できる。
遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を固相抗体及び検出抗体のいずれの用途として用いてもよいが、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を固相抗体として用い、固相抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を検出抗体（標識抗体）として用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行うことが好ましい。不溶性担体に固定化された遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体は、試料中の遊離ＡＩＭを捕捉し、不溶性担体上で抗体－遊離ＡＩＭ複合体を形成する。標識物質で標識された抗ＡＩＭモノクローナル抗体は、前記捕捉された遊離ＡＩＭに結合して前述の抗体－遊離ＡＩＭ複合体とサンドイッチを形成する。標識物質に応じた方法により標識物質の量を測定することにより、試料中の遊離ＡＩＭを測定することができる。抗体の不溶性担体への固定化の方法、抗体と標識物質との結合方法等、具体的な方法は、当業者に周知の方法を特に制限なく使用することができる。
また、標識抗体として、固相抗体とは異なるエピトープを認識する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を使用することもできる。
遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を固相抗体及び検出抗体のいずれの用途として用いてもよいが、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を固相抗体として用い、固相抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を検出抗体（標識抗体）として用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行うことが好ましい。不溶性担体に固定化された遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体は、試料中の遊離ＡＩＭを捕捉し、不溶性担体上で抗体－遊離ＡＩＭ複合体を形成する。標識物質で標識された抗ＡＩＭモノクローナル抗体は、前記捕捉された遊離ＡＩＭに結合して前述の抗体－遊離ＡＩＭ複合体とサンドイッチを形成する。標識物質に応じた方法により標識物質の量を測定することにより、試料中の遊離ＡＩＭを測定することができる。抗体の不溶性担体への固定化の方法、抗体と標識物質との結合方法等、具体的な方法は、当業者に周知の方法を特に制限なく使用することができる。
また、標識抗体として、固相抗体とは異なるエピトープを認識する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を使用することもできる。
免疫学的分析方法としては、代表的な粒子凝集免疫測定法であるラテックス免疫凝集法（以下、ＬＴＩＡ法ということがある）も好ましい。ＬＴＩＡ法では、目的成分に対する抗体を担持させたラテックス粒子を用い、目的成分である抗原と抗体担持ラテックス粒子とが抗原抗体複合物を形成して結合することによって生じるラテックス粒子の凝集（濁り）の程度を光学的手段（例えば、透過光を測定する比濁法、散乱光を測定する比朧法など）などにより検出し、目的成分を分析することができる。本発明の免疫学的分析方法では、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を担持させたラテックス粒子を用い、目的成分である遊離ＡＩＭと抗体担持ラテックス粒子とが抗原抗体複合物を形成して結合することによって生じるラテックス粒子の凝集の程度を光学的手段により検出することができる。ＬＴＩＡ法を採用する場合、遊離ＡＩＭに特異的に反応する２種以上の抗ＡＩＭモノクローナル抗体を使用することができ、又は遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体と遊離ＡＩＭ及び複合体ＡＩＭのいずれにも反応する性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体とを使用することもできる。
また、免疫学的分析方法として、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）あるいはEATA法（Electrokinetic Analyte Transport Assay）を用いることも可能である。EATA法は、富士フィルム和光純薬株式会社製のミュータスワコーi30を使用して実施することができる。
また、免疫学的分析方法として、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）あるいはEATA法（Electrokinetic Analyte Transport Assay）を用いることも可能である。EATA法は、富士フィルム和光純薬株式会社製のミュータスワコーi30を使用して実施することができる。
（遊離ＡＩＭ量の分析キット）
本発明の遊離ＡＩＭ量の測定キットは、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を含む。本発明の測定キットには、ほかに、他の検査試薬、検体希釈液、及び／又は使用説明書などを含むこともできる。
本発明の遊離ＡＩＭ量の測定キットは、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を含む。本発明の測定キットには、ほかに、他の検査試薬、検体希釈液、及び／又は使用説明書などを含むこともできる。
本発明の遊離ＡＩＭ量の測定キットは、好ましくは、以下の（１）～（２）を含むＥＣＬ法による遊離ＡＩＭ分析キットとすることができる。
（１）遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を固定化した固相、並びに
（２）電気化学発光物質で標識した、固定抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭモノクローナル抗体。
ＥＣＬ法を使用する場合、本発明の測定キットは、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固定化した固相とルテニウム錯体等の電気化学発光物質で標識した、抗ＡＩＭモノクローナル抗体とを含むことが好ましい。例えば、固相としてマイクロビーズを用いたキットでは、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固相化したマイクロビーズに、生物学的試料を添加して反応させた後、試料を除去して洗浄する。続いて、電気化学発光物質を標識した、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を添加して反応させる。マイクロビーズを洗浄後、電気エネルギーを加えて発光させ標識物質の発光量を測定することにより、遊離ＡＩＭ濃度を求めることができる。
また、電気化学発光物質で標識するための抗ＡＩＭモノクローナル抗体として、固相抗体とは異なるエピトープを認識する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を使用することもできる。
（１）遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を固定化した固相、並びに
（２）電気化学発光物質で標識した、固定抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭモノクローナル抗体。
ＥＣＬ法を使用する場合、本発明の測定キットは、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固定化した固相とルテニウム錯体等の電気化学発光物質で標識した、抗ＡＩＭモノクローナル抗体とを含むことが好ましい。例えば、固相としてマイクロビーズを用いたキットでは、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固相化したマイクロビーズに、生物学的試料を添加して反応させた後、試料を除去して洗浄する。続いて、電気化学発光物質を標識した、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を添加して反応させる。マイクロビーズを洗浄後、電気エネルギーを加えて発光させ標識物質の発光量を測定することにより、遊離ＡＩＭ濃度を求めることができる。
また、電気化学発光物質で標識するための抗ＡＩＭモノクローナル抗体として、固相抗体とは異なるエピトープを認識する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を使用することもできる。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用する場合、測定キットは少なくとも、以下の（１）～（２）を含むサンドイッチＥＬＩＳＡ法による遊離ＡＩＭ分析キットであることができる。
（１）遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体（固相抗体）を固定化した不溶性担体、及び
（２）標識物質で標識された、固相抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭモノクローナル抗体（標識抗体）。
このようなキットでは、まず、固相抗体を固定化した不溶性担体に、生物学的試料を添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。次に、標識抗体を添加した後インキュベートし、基質を加えて発色させる。プレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、生物学的試料中における遊離ＡＩＭ濃度を求めることができる。
また、標識抗体として、固相抗体とは異なるエピトープを認識する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を使用することもできる。
（１）遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体（固相抗体）を固定化した不溶性担体、及び
（２）標識物質で標識された、固相抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭモノクローナル抗体（標識抗体）。
このようなキットでは、まず、固相抗体を固定化した不溶性担体に、生物学的試料を添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。次に、標識抗体を添加した後インキュベートし、基質を加えて発色させる。プレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、生物学的試料中における遊離ＡＩＭ濃度を求めることができる。
また、標識抗体として、固相抗体とは異なるエピトープを認識する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を使用することもできる。
ＬＴＩＡ法を使用する場合、測定キットは少なくとも、以下の（１）～（２）を含むＬＴＩＡ法による遊離ＡＩＭ分析キットであることができる。
（１）遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体（第一固相抗体）を固定化したラテックス粒子、及び
（２）固相抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭモノクローナル抗体（第二固相抗体）を固定化したラテックス粒子。
このようなキットでは、遊離ＡＩＭを介して第一固相抗体ラテックスと第二固相抗体ラテックスとが凝集する。凝集の程度を光学的手段を用いて検出することにより、生物学的試料中における遊離ＡＩＭ濃度を求めることができる。
また、第二固相抗体として、第一固相抗体とは異なるエピトープを認識する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を使用することもできる。
（１）遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体（第一固相抗体）を固定化したラテックス粒子、及び
（２）固相抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭモノクローナル抗体（第二固相抗体）を固定化したラテックス粒子。
このようなキットでは、遊離ＡＩＭを介して第一固相抗体ラテックスと第二固相抗体ラテックスとが凝集する。凝集の程度を光学的手段を用いて検出することにより、生物学的試料中における遊離ＡＩＭ濃度を求めることができる。
また、第二固相抗体として、第一固相抗体とは異なるエピトープを認識する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を使用することもできる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に説明のない限りは、％は重量％を示す。
〔実施例１：抗体の作製〕
１．マウス抗ヒトＡＩＭモノクローナル抗体の作製
以下の手順により、マウス抗ヒトＡＩＭモノクローナル抗体であるＮｏ．８抗体、Ｎｏ．１１抗体、Ｎｏ．１２抗体、及びＮｏ．２９抗体を得た。
抗原として全長ヒトｒＡＩＭ（２ｍｇ／ｍｌ）を等量のＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄ（Ｇ－１フナコシ）と混合しエマルジョンを作製した。免疫動物にはＢａｌｂ／ｃマウス（チャールズリバー（株）８週齢のメス２匹を用い、後ろ足底部へ抗原溶液５０μＬを投与した。２週間後に同様の投与を行い、更に２週間以上をおいて抗原溶液５０μｇを後ろ足底部へ投与し３日後の細胞融合に備えた。
ミエローマ細胞にはマウスＰ３Ｕ１を用い、増殖培養には、ＲＰＭＩ１６４０（１１８７５－１１９ ＧＩＢＣＯ）に、グルタミンとピルビン酸を加え、ＦＢＳ（Ｓ１５６０ ＢＷＴ社）を１０％になるように添加した培地を用いた。抗生物質としてはペニシリン、ストレプトマイシンを適量加えた。
麻酔下にて心臓採血を行ったマウスから、無菌的に膝窩リンパ節を摘出し、＃２００メッシュ付ビーカーにのせ、シリコン棒で押しながら、細胞浮遊液を調製した。細胞はＲＰＭＩ１６４０にて２回の遠心洗浄を行った後、細胞数をカウントした。対数増殖期の状態のミエローマ細胞を遠心により集め、洗浄後、リンパ細胞とミエローマ細胞の比率が５対１となるように調整し、混合遠心を行った。細胞融合はＰＥＧ１５００（７８３６４１ ロシュ）を用いて行った。すなわち、細胞ペレットへ１ｍＬのＰＥＧ液を３分間かけて反応させ、その後段階的に希釈を行い、遠心にて洗浄した後、培地を加え９６ウェルプレート１５枚へ２００μＬずつ入れ、１週間の培養を行った。培地にはミエローマ細胞用培地にＨＡＴサプリメント（２１０６０－０１７ ＧＩＢＣＯ）を加え、ＦＢＳ濃度を１５％にしたものを用いた。
凍結保存された細胞を解凍し、増殖培養を行った後、１週間以上前に０．５ｍｌのプリスタン（４２－００２ コスモバイオ）を腹腔内投与したヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ－ｎｕ／ｎｕ 日本クレア）の腹腔へ、１×１０7個を投与し、およそ２週間後に４～１２ｍｌの腹水を得た。遠心処理にて固形物を除去した後、凍結保存を行った。その後、凍結保存した腹水から抗体を精製し、Ｎｏ．８抗体、Ｎｏ．１１抗体、Ｎｏ．１２抗体、及びＮｏ．２９抗体を得た。
１．マウス抗ヒトＡＩＭモノクローナル抗体の作製
以下の手順により、マウス抗ヒトＡＩＭモノクローナル抗体であるＮｏ．８抗体、Ｎｏ．１１抗体、Ｎｏ．１２抗体、及びＮｏ．２９抗体を得た。
抗原として全長ヒトｒＡＩＭ（２ｍｇ／ｍｌ）を等量のＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄ（Ｇ－１フナコシ）と混合しエマルジョンを作製した。免疫動物にはＢａｌｂ／ｃマウス（チャールズリバー（株）８週齢のメス２匹を用い、後ろ足底部へ抗原溶液５０μＬを投与した。２週間後に同様の投与を行い、更に２週間以上をおいて抗原溶液５０μｇを後ろ足底部へ投与し３日後の細胞融合に備えた。
ミエローマ細胞にはマウスＰ３Ｕ１を用い、増殖培養には、ＲＰＭＩ１６４０（１１８７５－１１９ ＧＩＢＣＯ）に、グルタミンとピルビン酸を加え、ＦＢＳ（Ｓ１５６０ ＢＷＴ社）を１０％になるように添加した培地を用いた。抗生物質としてはペニシリン、ストレプトマイシンを適量加えた。
麻酔下にて心臓採血を行ったマウスから、無菌的に膝窩リンパ節を摘出し、＃２００メッシュ付ビーカーにのせ、シリコン棒で押しながら、細胞浮遊液を調製した。細胞はＲＰＭＩ１６４０にて２回の遠心洗浄を行った後、細胞数をカウントした。対数増殖期の状態のミエローマ細胞を遠心により集め、洗浄後、リンパ細胞とミエローマ細胞の比率が５対１となるように調整し、混合遠心を行った。細胞融合はＰＥＧ１５００（７８３６４１ ロシュ）を用いて行った。すなわち、細胞ペレットへ１ｍＬのＰＥＧ液を３分間かけて反応させ、その後段階的に希釈を行い、遠心にて洗浄した後、培地を加え９６ウェルプレート１５枚へ２００μＬずつ入れ、１週間の培養を行った。培地にはミエローマ細胞用培地にＨＡＴサプリメント（２１０６０－０１７ ＧＩＢＣＯ）を加え、ＦＢＳ濃度を１５％にしたものを用いた。
凍結保存された細胞を解凍し、増殖培養を行った後、１週間以上前に０．５ｍｌのプリスタン（４２－００２ コスモバイオ）を腹腔内投与したヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ－ｎｕ／ｎｕ 日本クレア）の腹腔へ、１×１０7個を投与し、およそ２週間後に４～１２ｍｌの腹水を得た。遠心処理にて固形物を除去した後、凍結保存を行った。その後、凍結保存した腹水から抗体を精製し、Ｎｏ．８抗体、Ｎｏ．１１抗体、Ｎｏ．１２抗体、及びＮｏ．２９抗体を得た。
〔実施例２：遊離ＡＩＭに特異的に結合する抗体のスクリーニング〕
（１．抗体結合磁気ビーズの作製）
１）１５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で透析したＮｏ．８抗体の吸光度を測定し、同緩衝液を用いてＡｂｓ ０．５にそれぞれ調製し、抗体溶液を作製した。
２）Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ 社製 Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－４５０ Ｅｐｏｘｙ（３０ ｍｇ／ｍＬ）を１ｍＬ分注し、分注液を上記緩衝液で３回洗浄し、１）で作製した抗体溶液を１ｍＬ添加した。２５℃にて回転攪拌を１８時間以上実施した。
３）ビーズブロッキングバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ＢＳＡ（脂肪酸不含），０．０９％ ＮａＮ3，ｐＨ７．８］で２）で調製したビーズを２回洗浄した。洗浄により緩衝液を取り除くことで溶液中に残存していたビーズ未結合の抗体を除去した。その後ビーズブロッキングバッファーを１ｍＬずつ加え攪拌し２５℃にて回転攪拌を１８時間以上実施した。
４）ビーズブロッキングバッファーでビーズを２回洗浄後、ビーズブロッキングバッファーを１ｍＬ加え攪拌した。これをＮｏ．８抗体結合磁気ビーズとした。
５）前記手順１）～４）をＮｏ．１１、Ｎｏ．１２、及びＮｏ．２９抗体に関しても繰り返し、Ｎｏ．１１抗体結合磁気ビーズ、Ｎｏ．１２抗体結合磁気ビーズ、及びＮｏ．２９抗体結合磁気ビーズを得た。これらの４種の抗体結合磁気ビーズを使用時まで４℃で保存した。
（１．抗体結合磁気ビーズの作製）
１）１５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で透析したＮｏ．８抗体の吸光度を測定し、同緩衝液を用いてＡｂｓ ０．５にそれぞれ調製し、抗体溶液を作製した。
２）Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ 社製 Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－４５０ Ｅｐｏｘｙ（３０ ｍｇ／ｍＬ）を１ｍＬ分注し、分注液を上記緩衝液で３回洗浄し、１）で作製した抗体溶液を１ｍＬ添加した。２５℃にて回転攪拌を１８時間以上実施した。
３）ビーズブロッキングバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ＢＳＡ（脂肪酸不含），０．０９％ ＮａＮ3，ｐＨ７．８］で２）で調製したビーズを２回洗浄した。洗浄により緩衝液を取り除くことで溶液中に残存していたビーズ未結合の抗体を除去した。その後ビーズブロッキングバッファーを１ｍＬずつ加え攪拌し２５℃にて回転攪拌を１８時間以上実施した。
４）ビーズブロッキングバッファーでビーズを２回洗浄後、ビーズブロッキングバッファーを１ｍＬ加え攪拌した。これをＮｏ．８抗体結合磁気ビーズとした。
５）前記手順１）～４）をＮｏ．１１、Ｎｏ．１２、及びＮｏ．２９抗体に関しても繰り返し、Ｎｏ．１１抗体結合磁気ビーズ、Ｎｏ．１２抗体結合磁気ビーズ、及びＮｏ．２９抗体結合磁気ビーズを得た。これらの４種の抗体結合磁気ビーズを使用時まで４℃で保存した。
（２．ルテニウム標識抗体の作製）
１）１５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で透析済みＮｏ．８抗体液３１２．５μＬに、１０ｍｇ／ｍＬのルテニウム錯体（ＩＧＥＮ社製 Ｏｒｉｇｉｎ Ｔａｇ－ＮＨＳ ＥＳＴＥＲ）を１４．１μＬ加え、３０分間攪拌した。その後、２Ｍ グリシンを５０μＬ添加し、２０分間攪拌した。
２）直径１ｃｍ、高さ３０ｃｍのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５）に１）で作製したルテニウム錯体標識抗体をアプライし、未標識のルテニウム錯体とルテニウム錯体標識Ｎｏ．８抗体を単離精製した。溶出は、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて行った。
３）前記手順１）～２）をＮｏ．１１、Ｎｏ．１２、及びＮｏ．２９抗体に関しても繰り返し、ルテニウム錯体標識Ｎｏ．１１抗体、ルテニウム錯体標識Ｎｏ．１２抗体、及びルテニウム錯体標識Ｎｏ．２９抗体を得た。
１）１５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で透析済みＮｏ．８抗体液３１２．５μＬに、１０ｍｇ／ｍＬのルテニウム錯体（ＩＧＥＮ社製 Ｏｒｉｇｉｎ Ｔａｇ－ＮＨＳ ＥＳＴＥＲ）を１４．１μＬ加え、３０分間攪拌した。その後、２Ｍ グリシンを５０μＬ添加し、２０分間攪拌した。
２）直径１ｃｍ、高さ３０ｃｍのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５）に１）で作製したルテニウム錯体標識抗体をアプライし、未標識のルテニウム錯体とルテニウム錯体標識Ｎｏ．８抗体を単離精製した。溶出は、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて行った。
３）前記手順１）～２）をＮｏ．１１、Ｎｏ．１２、及びＮｏ．２９抗体に関しても繰り返し、ルテニウム錯体標識Ｎｏ．１１抗体、ルテニウム錯体標識Ｎｏ．１２抗体、及びルテニウム錯体標識Ｎｏ．２９抗体を得た。
（３．遊離ＡＩＭに特異的に結合する抗体のスクリーニング）
１）ＮＡＳＨ－ＨＣＣ患者血清１検体を１０μＬ取り、２００μＬの反応用溶液［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％ ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，１００μｇ／ｍＬ マウスＩｇＧ，ｐＨ７．８］へ添加した。
２）そこにビーズ希釈液［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％ ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，ｐＨ７．８］で０．５ｍｇ／ｍＬ濃度に希釈したＮｏ．１１抗体結合磁気ビーズを２５μＬずつ添加し、３０℃で９分間反応させた（第一反応）。
その後、磁気ビーズを磁石でトラップし、反応管内の液体を抜き取り、洗浄液［５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，０．０１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，ｐＨ７，５］３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。
３）次にルテニウム用希釈溶液［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％ ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，１００μｇ／ｍＬ マウスＩｇＧ，ｐＨ７．８］で０．６μｇ／ｍＬ濃度に希釈したルテニウム標識Ｎｏ．１２抗体を２００μＬ加えて３０℃で９分間反応させた（第二反応）。
反応後の磁気ビーズを磁石でトラップし反応管内の液体を抜き取り、洗浄液３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。
４）その後、反応管に３００μＬのトリプロピルアミンを入れ、磁気ビーズと混合した。この状態で電気エネルギーを与えることでルテニウム錯体が発光し、その発光強度を検出機で検出した。
なお、上記反応管への磁気ビーズ添加操作以降は、ルテニウム錯体発光自動測定機であるピコルミＩＩＩ上で実施した。
上記操作を以下の計１６通りの抗体の組み合わせ（抗体結合磁気ビーズ４種類×ルテニウム標識抗体×４種類）で実施して、測定系に対するＩｇＭ－ＡＩＭ量の測りこみを検証した。
１）ＮＡＳＨ－ＨＣＣ患者血清１検体を１０μＬ取り、２００μＬの反応用溶液［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％ ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，１００μｇ／ｍＬ マウスＩｇＧ，ｐＨ７．８］へ添加した。
２）そこにビーズ希釈液［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％ ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，ｐＨ７．８］で０．５ｍｇ／ｍＬ濃度に希釈したＮｏ．１１抗体結合磁気ビーズを２５μＬずつ添加し、３０℃で９分間反応させた（第一反応）。
その後、磁気ビーズを磁石でトラップし、反応管内の液体を抜き取り、洗浄液［５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，０．０１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，ｐＨ７，５］３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。
３）次にルテニウム用希釈溶液［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％ ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，１００μｇ／ｍＬ マウスＩｇＧ，ｐＨ７．８］で０．６μｇ／ｍＬ濃度に希釈したルテニウム標識Ｎｏ．１２抗体を２００μＬ加えて３０℃で９分間反応させた（第二反応）。
反応後の磁気ビーズを磁石でトラップし反応管内の液体を抜き取り、洗浄液３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。
４）その後、反応管に３００μＬのトリプロピルアミンを入れ、磁気ビーズと混合した。この状態で電気エネルギーを与えることでルテニウム錯体が発光し、その発光強度を検出機で検出した。
なお、上記反応管への磁気ビーズ添加操作以降は、ルテニウム錯体発光自動測定機であるピコルミＩＩＩ上で実施した。
上記操作を以下の計１６通りの抗体の組み合わせ（抗体結合磁気ビーズ４種類×ルテニウム標識抗体×４種類）で実施して、測定系に対するＩｇＭ－ＡＩＭ量の測りこみを検証した。
結果を図１（Ａ）～図１（Ｈ）に示す。Ｎｏ．１２抗体を抗体結合磁気ビーズ又はルテニウム標識抗体として用いた場合に、遊離ＡＩＭを特異的に分析できることが分かった。
Ｎｏ．１２抗体を抗体結合磁気ビーズ又はルテニウム標識抗体として用いていない場合には、ＩｇＭ－ＡＩＭの測定系への測りこみが見られた（４測定系のみ図１（Ｅ）～（Ｈ）として掲載。残りは図示せず。）。したがって、Ｎｏ．１２抗体が遊離ＡＩＭに特異的な抗体であることが示された。
Ｎｏ．１２抗体を抗体結合磁気ビーズ又はルテニウム標識抗体として用いていない場合には、ＩｇＭ－ＡＩＭの測定系への測りこみが見られた（４測定系のみ図１（Ｅ）～（Ｈ）として掲載。残りは図示せず。）。したがって、Ｎｏ．１２抗体が遊離ＡＩＭに特異的な抗体であることが示された。
〔実施例３：エピトープ分析〕
（１．ＥＬＩＳＡ法によるエピトープ分析）
抗原として遊離ＡＩＭ（ＳＲＣＲ１＋２＋３）及びＡＩＭのＳＲＣＲ１＋２（ＳＲＣＲ１ドメイン及びＳＲＣＲ２ドメインから成るペプチド）を用い、そして抗ＡＩＭモノクローナル抗体としてＮｏ．８、Ｎｏ．１１、Ｎｏ．１２、およびＮｏ．２９抗体を用いてＥＬＩＳＡ法を行い、Ｎｏ．８、Ｎｏ．１１、Ｎｏ．１２、およびＮｏ．２９抗体のエピトープを分析した。実験に使用したヒトＡＩＭの各断片は、タカラバイオ社に作成を依頼して入手した。
遊離ＡＩＭおよびＡＩＭのＳＲＣＲ１＋２（ＳＲＣＲ１ドメイン＋ＳＲＣＲ２ドメイン）をプレートに固相化し、Ｎｏ．８、Ｎｏ．１１、Ｎｏ．１２、およびＮｏ．２９抗体を添加した。洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体を反応させ、ＨＲＰ基質によって発色させた。結果を表１及び２に示す。
（１．ＥＬＩＳＡ法によるエピトープ分析）
抗原として遊離ＡＩＭ（ＳＲＣＲ１＋２＋３）及びＡＩＭのＳＲＣＲ１＋２（ＳＲＣＲ１ドメイン及びＳＲＣＲ２ドメインから成るペプチド）を用い、そして抗ＡＩＭモノクローナル抗体としてＮｏ．８、Ｎｏ．１１、Ｎｏ．１２、およびＮｏ．２９抗体を用いてＥＬＩＳＡ法を行い、Ｎｏ．８、Ｎｏ．１１、Ｎｏ．１２、およびＮｏ．２９抗体のエピトープを分析した。実験に使用したヒトＡＩＭの各断片は、タカラバイオ社に作成を依頼して入手した。
遊離ＡＩＭおよびＡＩＭのＳＲＣＲ１＋２（ＳＲＣＲ１ドメイン＋ＳＲＣＲ２ドメイン）をプレートに固相化し、Ｎｏ．８、Ｎｏ．１１、Ｎｏ．１２、およびＮｏ．２９抗体を添加した。洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体を反応させ、ＨＲＰ基質によって発色させた。結果を表１及び２に示す。
表１は、ＥＬＩＳＡ測定値を示し、表２は、前記ＥＬＩＳＡ測定値を基にした、各抗体の抗原への反応性を示している。「＋」は反応することを示し、「－」は反応しないことを示す。
Ｎｏ．８、Ｎｏ．１１およびＮｏ．２９抗体は、ＳＲＣＲ１＋２とは反応しなかったが、遊離ＡＩＭとは反応した。Ｎｏ．１２抗体は、遊離ＡＩＭ及びＳＲＣＲ１＋２のいずれとも反応した。
したがって、ＥＬＩＳＡの結果より、Ｎｏ．１２抗体はＳＲＣＲ１ドメイン又はＳＲＣＲ２ドメインのいずれかをエピトープとして認識しており、Ｎｏ．８、Ｎｏ．１１およびＮｏ．２９抗体は、ＳＲＣＲ３ドメインをエピトープとして認識していることが分かった。
Ｎｏ．８、Ｎｏ．１１およびＮｏ．２９抗体は、ＳＲＣＲ１＋２とは反応しなかったが、遊離ＡＩＭとは反応した。Ｎｏ．１２抗体は、遊離ＡＩＭ及びＳＲＣＲ１＋２のいずれとも反応した。
したがって、ＥＬＩＳＡの結果より、Ｎｏ．１２抗体はＳＲＣＲ１ドメイン又はＳＲＣＲ２ドメインのいずれかをエピトープとして認識しており、Ｎｏ．８、Ｎｏ．１１およびＮｏ．２９抗体は、ＳＲＣＲ３ドメインをエピトープとして認識していることが分かった。
（２．ウエスタンブロッティングによるエピトープ分析）
抗原としてＡＩＭのＳＲＣＲ１ドメイン（図２中の「１」）、ＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン（図２中の「２」）、ＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン及びＳＲＣＲ３ドメイン（図２中の「２３」）、並びにヒトＡＩＭ（図２中の「ｈＡＩＭ」を用い、そして抗ＡＩＭモノクローナル抗体としてＮｏ．１１及びＮｏ．１２抗体を用いてウエスタンブロットを行い、Ｎｏ．１１及びＮｏ．１２抗体のエピトープを分析した。各抗原をｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒと混合し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法にて分離した。電気泳動後、蛋白質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ，ミリポア社）に転写し、Ｎｏ．１１又はＮｏ．１２抗体と４℃ ｏｖｅｒｎｉｇｈｔにて一次抗体反応を行った。二次抗体にＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体、検出試薬としてＬｕｍｉｎａｔａ Ｆｏｒｔｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ミリポア社）を用い、シグナルの検出はＩｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にて行った。結果を図２に示す。
抗原としてＡＩＭのＳＲＣＲ１ドメイン（図２中の「１」）、ＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン（図２中の「２」）、ＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン及びＳＲＣＲ３ドメイン（図２中の「２３」）、並びにヒトＡＩＭ（図２中の「ｈＡＩＭ」を用い、そして抗ＡＩＭモノクローナル抗体としてＮｏ．１１及びＮｏ．１２抗体を用いてウエスタンブロットを行い、Ｎｏ．１１及びＮｏ．１２抗体のエピトープを分析した。各抗原をｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒと混合し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法にて分離した。電気泳動後、蛋白質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ，ミリポア社）に転写し、Ｎｏ．１１又はＮｏ．１２抗体と４℃ ｏｖｅｒｎｉｇｈｔにて一次抗体反応を行った。二次抗体にＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体、検出試薬としてＬｕｍｉｎａｔａ Ｆｏｒｔｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ミリポア社）を用い、シグナルの検出はＩｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にて行った。結果を図２に示す。
Ｎｏ.１２抗体は、ｈＡＩＭ（ＳＲＣＲ１＋２＋３）、ＳＲＣＲ２＋３、及びＳＲＣＲ２に反応したことから、エピトープはＳＲＣＲ２であった。Ｎｏ.１２抗体は、ＳＲＣＲ１には反応しなかった。
一方、Ｎｏ.１１抗体は、ｈＡＩＭ（ＳＲＣＲ１＋２＋３）及びＳＲＣＲ２＋３に反応したことから、ＳＲＣＲ３に反応する抗体であることわかった。Ｎｏ.１１抗体は、ＳＲＣＲ１及びＳＲＣＲ２にはいずれも反応しなかった。
一方、Ｎｏ.１１抗体は、ｈＡＩＭ（ＳＲＣＲ１＋２＋３）及びＳＲＣＲ２＋３に反応したことから、ＳＲＣＲ３に反応する抗体であることわかった。Ｎｏ.１１抗体は、ＳＲＣＲ１及びＳＲＣＲ２にはいずれも反応しなかった。
以上よりＮｏ．１２抗体は、ＳＲＣＲ２ドメインをエピトープとして認識しており、Ｎｏ．１１抗体は、ＳＲＣＲ３ドメインをエピトープとして認識していることが明らかになった。また、実験に使用した各ＳＲＣＲは、ＨＥＫ２９３細胞を使用して得ており、ＨＥＫ２９３細胞を使用すると生体内の構造に近い状態のタンパクが得られることから、Ｎｏ．１２抗体は、ＳＲＣＲ２ドメイン内の立体構造を認識する抗体であると考えられた。
したがって、ＳＲＣＲ２ドメインをエピトープとして認識するモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、複合体ＡＩＭには反応せず、遊離ＡＩＭには反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を得ることができることが明らかになった。
したがって、ＳＲＣＲ２ドメインをエピトープとして認識するモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、複合体ＡＩＭには反応せず、遊離ＡＩＭには反応する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を得ることができることが明らかになった。
本発明によれば、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料において、遊離ＡＩＭのみを特異的に検出することが可能である。
Claims (14)
- 遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体を用いる生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法であって、前記抗ＡＩＭモノクローナル抗体が、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合する抗体である前記免疫学的分析方法。
- 前記生物学的試料が、体液試料である、請求項１に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法。
- 前記体液試料が、血清、血漿、血液及び尿からなる群から選択される、請求項２に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法。
- ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメインが、配列番号３で表されるアミノ酸配列で表される、請求項１～３のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
- 遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する前記抗ＡＩＭモノクローナル抗体が、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合し、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ１ドメイン中のアミノ酸配列に結合しない抗体である、請求項１～４のいずれかに記載の免疫学的分析方法。
- 遊離ＡＩＭ及び複合体ＡＩＭのいずれにも反応する性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体をさらに使用する、請求項１～５のいずれかに記載の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法。
- 遊離ＡＩＭに反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体であって、ＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合することを特徴とする前記モノクローナル抗体。
- ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメインが、配列番号３で表されるアミノ酸配列でで表される、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
- 遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する前記抗ＡＩＭモノクローナル抗体が、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合し、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ１ドメイン中のアミノ酸配列に結合しない抗体である、請求項７又は８に記載のモノクローナル抗体。
- 遊離ＡＩＭには反応するが、複合体ＡＩＭには反応しない性質を有する前記抗ＡＩＭモノクローナル抗体が、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合し、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ１ドメイン中のアミノ酸配列、及びヒトＡＩＭのＳＲＣＲ３ドメイン中のアミノ酸配列のいずれにも結合しない抗体である、請求項９に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項６～１０のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット。
- 前記生物学的試料が、体液試料である、請求項１１に記載の遊離ＡＩＭ分析キット。
- 前記体液試料が、血清、血漿、血液及び尿からなる群から選択される、請求項１２に記載の遊離ＡＩＭ分析キット。
- 遊離ＡＩＭ及び複合体ＡＩＭのいずれにも反応する性質を有する抗ＡＩＭモノクローナル抗体をさらに含む、請求項１１～１３のいずれかに記載の遊離ＡＩＭ分析キット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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