JP7315968B2 - 生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法及び対象におけるｎａｓｈの検出方法 - Google Patents
生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法及び対象におけるｎａｓｈの検出方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法及び分析キットに関する。本発明は、生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析における非特異反応抑制方法にも関する。また、本発明は、対象におけるＮＡＳＨの検出方法及び診断キットに関する。
ＡＩＭ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）は組織マクロファージにより産生される、分子量約５０ｋＤａ分泌型の血中タンパク質である。ＡＩＭは、システイン残基を多く含む特異的な配列であるｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ（ＳＲＣＲ）ドメインをタンデムに３つつなげた構造をしている。それぞれのシステイン残基は各ドメイン内で互いにジスルフィド結合することで、コンパクトな球状の立体構造をしていると考えられている。
ＡＩＭは、リポ多糖、ＩｇＭ、補体制御因子、及び脂肪酸合成酵素など，さまざまな分子と結合するという特徴を持つことが知られている。中でも、ＡＩＭは、血中においてＩｇＭとの複合体の形態で存在することが知られている。ＩｇＭは５００ｋＤａをこえる巨大なタンパク質複合体であるため、ＩｇＭに結合しているかぎりＡＩＭも糸球体を通過して尿へと移行することはなく、ＡＩＭの高い血中濃度が保たれる。ＩｇＭから解離するとＡＩＭはすみやかに尿へと排泄される。したがって、大部分のＡＩＭは血液中においてＩｇＭと複合体を形成しており、結合体ではなく遊離状態で血中に存在することはほとんどない。
近年、ＡＩＭが、インスリン抵抗性又は動脈硬化などのさまざまな疾患における病態の進行に関与することが明らかにされている。例えば、他の結合パートナーと結合していない遊離の形態で存在する遊離ＡＩＭと肝疾患との関係について報告されている（特許文献１）
肝疾患の中では、近年、非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）の患者が増加しており、日本国内においては約１５００～２０００万人がＮＡＦＬＤに罹患していると推定される。
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は非飲酒者で脂肪肝を呈する病態総称である。ＮＡＦＬＤは、肝硬変や肝癌の発症母地にもなる非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）と、病態がほとんど進行しない非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ；ＮＡＦＬ）とに分類される。日本国内においては、約１５０万～３００万人がＮＡＳＨに罹患していると推定される。
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は非飲酒者で脂肪肝を呈する病態総称である。ＮＡＦＬＤは、肝硬変や肝癌の発症母地にもなる非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）と、病態がほとんど進行しない非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ；ＮＡＦＬ）とに分類される。日本国内においては、約１５０万～３００万人がＮＡＳＨに罹患していると推定される。
遊離ＡＩＭ量の測定結果に基づき特定の疾患を診断する場合、複合体を形成しているＡＩＭの量を排除し、遊離ＡＩＭ量のみを測定する必要がある。しかしながら、遊離ＡＩＭを検出する際に、他の結合パートナーと結合している複合体ＡＩＭも検出してしまう場合があった。したがって、複雑な操作を伴うことなく複合体を形成しているＡＩＭ量を排除し、遊離ＡＩＭ量のみを測定することが可能な技術が望まれていた。
また、ＮＡＳＨの確定診断には、肝組織の生検が必須とされており、肝組織の生検により、脂肪量、炎症の程度、及び線維化の進行程度を把握し、ＮＡＳＨを診断することが可能となる。しかしながら、肝組織の生検は、肝臓に針を刺して組織や細胞を一部採取することを含むものであり、患者及び医療従事者に過度の負担を強いるものであると共に、合併症等のリスクを伴うものである。したがって、より簡易的に実施することができ、さらに患者及び医療従事者に負担をかけない新たなＮＡＳＨ診断法の開発が望まれていた。
本発明の目的は、優れた特異性を有する、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析方法、並びに優れた特異性及び感度を有する、対象におけるＮＡＳＨの検出方法を提供することにある。
また、ＮＡＳＨの確定診断には、肝組織の生検が必須とされており、肝組織の生検により、脂肪量、炎症の程度、及び線維化の進行程度を把握し、ＮＡＳＨを診断することが可能となる。しかしながら、肝組織の生検は、肝臓に針を刺して組織や細胞を一部採取することを含むものであり、患者及び医療従事者に過度の負担を強いるものであると共に、合併症等のリスクを伴うものである。したがって、より簡易的に実施することができ、さらに患者及び医療従事者に負担をかけない新たなＮＡＳＨ診断法の開発が望まれていた。
本発明の目的は、優れた特異性を有する、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の免疫学的分析方法、並びに優れた特異性及び感度を有する、対象におけるＮＡＳＨの検出方法を提供することにある。
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、抗ＩｇＭ抗体を用いることにより、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体の遊離ＡＩＭに対する特異性をさらに向上させることが可能であること、そして抗ＩｇＭ抗体の使用と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体の使用とを組み合わせることにより、対象においてＮＡＳＨを検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
特許文献１の実施例３においては、健常人、ＮＡＦＬに罹患する対象、及びＮＡＳＨに罹患している対象の血清中の遊離ＡＩＭ量において、差異は見受けられなかったことが記載されている。それにもかかわらず、抗ＩｇＭ抗体の存在下で分析を行ったところ、ＮＡＦＬに罹患している対象とＮＡＳＨに罹患している対象の血清中の遊離ＡＩＭ量において、有意差を確認することができた。これは驚くべきことである。
具体的に、本発明は以下のとおりである。
＜１＞抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを接触させることを含む、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜２＞前記生物学的試料が、体液試料である、＜１＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜３＞前記遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体が、モノクローナル抗体である、＜１＞又は＜２＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜４＞抗ＩｇＭ抗体と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを含む、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜５＞前記生物学的試料が、体液試料である、＜４＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜６＞遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体が、モノクローナル抗体である、＜４＞又は＜５＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜７＞抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを接触させることを含む、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析における非特異反応抑制方法、
＜８＞前記生物学的試料が、体液試料である、＜７＞に記載の非特異反応抑制方法、
＜９＞前記非特異反応が、生物学的試料中のＩｇＭに由来する非特異反応である、＜７＞又は＜８＞に記載の非特異反応抑制方法、
＜１０＞抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを接触させることと、シグナルを検出することにより、生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量を測定することと、測定した遊離ＡＩＭ量を基準値と比較することと、
を含む、ＮＡＳＨの検出方法、
＜１１＞前記生物学的試料が、体液試料である、＜１０＞に記載のＮＡＳＨの検出方法、
＜１２＞前記遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体が、モノクローナル抗体である、＜１０＞又は＜１１＞に記載のＮＡＳＨの検出方法、
＜１３＞ＮＡＦＬとＮＡＳＨとを判別する、＜１０＞～＜１２＞のいずれかに記載のＮＡＳＨの検出方法、
＜１４＞抗ＩｇＭ抗体と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを含む、ＮＡＳＨの診断キット、
＜１５＞体液試料中の遊離ＡＩＭ濃度を測定する、＜１４＞に記載のＮＡＳＨの診断キット、並びに
＜１６＞遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体が、モノクローナル抗体である、＜１４＞又は＜１５＞に記載のＮＡＳＨの診断キット。
本発明は、以下の実施形態も包含する。
＜Ａ１＞抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを接触させることを含む、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜Ａ２＞抗ＩｇＭ抗体が、ＨＢＲ－１、ＨＢＲ－３、ＨＢＲ－６、ＨＢＲ－９、ＨＢＲ２０、ＨＢＲ２１、ＨＢＲ２３、及びＨＢＲ２６からなる群から選択される１つ以上である、＜Ａ１＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜Ａ３＞抗ＩｇＭ抗体の濃度が、１～１０００μｇ／ｍＬである＜Ａ１＞又は＜Ａ２＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜Ａ４＞前記生物学的試料が、血液、血清、血漿又は尿である、＜Ａ１＞～＜Ａ３＞のいずれかに記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜Ｂ１＞抗ＩｇＭ抗体と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを含む、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜Ｂ２＞抗ＩｇＭ抗体が、ＨＢＲ－１、ＨＢＲ－３、ＨＢＲ－６、ＨＢＲ－９、ＨＢＲ２０、ＨＢＲ２１、ＨＢＲ２３、及びＨＢＲ２６からなる群から選択される１つ以上である、＜Ｂ１＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜Ｂ３＞抗ＩｇＭ抗体の濃度が、１～１０００μｇ／ｍＬである＜Ｂ１＞又は＜Ｂ２＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜Ｂ４＞前記生物学的試料が、血液、血清、血漿又は尿である、＜Ｂ１＞～＜Ｂ３＞のいずれかに記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜Ｃ１＞抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを接触させることを含む、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析における非特異反応抑制方法、
＜Ｃ２＞抗ＩｇＭ抗体が、ＨＢＲ－１、ＨＢＲ－３、ＨＢＲ－６、ＨＢＲ－９、ＨＢＲ２０、ＨＢＲ２１、ＨＢＲ２３、及びＨＢＲ２６からなる群から選択される１つ以上である、＜Ｃ１＞に記載の非特異反応抑制方法、
＜Ｃ３＞抗ＩｇＭ抗体の濃度が、１～１０００μｇ／ｍＬである＜Ｃ１＞又は＜Ｃ２＞に記載の非特異反応抑制方法、
＜Ｃ４＞前記生物学的試料が、血液、血清、血漿又は尿である、＜Ｃ１＞～＜Ｃ３＞のいずれかに記載の非特異反応抑制方法、
＜Ｄ１＞抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを接触させることと、シグナルを検出することにより、生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量を測定することと、測定した遊離ＡＩＭ量を基準値と比較することと、
を含む、ＮＡＳＨの検出方法、
＜Ｄ２＞抗ＩｇＭ抗体が、ＨＢＲ－１、ＨＢＲ－３、ＨＢＲ－６、ＨＢＲ－９、ＨＢＲ２０、ＨＢＲ２１、ＨＢＲ２３、及びＨＢＲ２６からなる群から選択される１つ以上である、＜Ｄ１＞に記載のＮＡＳＨの検出方法、
＜Ｄ３＞抗ＩｇＭ抗体の濃度が、１～１０００μｇ／ｍＬである＜Ｄ１＞又は＜Ｄ２＞に記載のＮＡＳＨの検出方法、
＜Ｄ４＞前記生物学的試料が、血液、血清、血漿又は尿である、＜Ｄ１＞～＜Ｄ３＞のいずれかに記載のＮＡＳＨの検出方法、
＜Ｅ１＞抗ＩｇＭ抗体と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを含む、ＮＡＳＨの診断キット、
＜Ｅ２＞抗ＩｇＭ抗体が、ＨＢＲ－１、ＨＢＲ－３、ＨＢＲ－６、ＨＢＲ－９、ＨＢＲ２０、ＨＢＲ２１、ＨＢＲ２３、及びＨＢＲ２６からなる群から選択される１つ以上である、＜Ｅ１＞に記載のＮＡＳＨの診断キット、
＜Ｅ３＞抗ＩｇＭ抗体の濃度が、１～１０００μｇ／ｍＬである＜Ｅ１＞又は＜Ｅ２＞に記載のＮＡＳＨの診断キット、
＜Ｅ４＞前記生物学的試料が、血液、血清、血漿又は尿である、＜Ｅ１＞～＜Ｅ３＞のいずれかに記載のＮＡＳＨの診断キット。
特許文献１の実施例３においては、健常人、ＮＡＦＬに罹患する対象、及びＮＡＳＨに罹患している対象の血清中の遊離ＡＩＭ量において、差異は見受けられなかったことが記載されている。それにもかかわらず、抗ＩｇＭ抗体の存在下で分析を行ったところ、ＮＡＦＬに罹患している対象とＮＡＳＨに罹患している対象の血清中の遊離ＡＩＭ量において、有意差を確認することができた。これは驚くべきことである。
具体的に、本発明は以下のとおりである。
＜１＞抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを接触させることを含む、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜２＞前記生物学的試料が、体液試料である、＜１＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜３＞前記遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体が、モノクローナル抗体である、＜１＞又は＜２＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜４＞抗ＩｇＭ抗体と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを含む、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜５＞前記生物学的試料が、体液試料である、＜４＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜６＞遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体が、モノクローナル抗体である、＜４＞又は＜５＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜７＞抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを接触させることを含む、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析における非特異反応抑制方法、
＜８＞前記生物学的試料が、体液試料である、＜７＞に記載の非特異反応抑制方法、
＜９＞前記非特異反応が、生物学的試料中のＩｇＭに由来する非特異反応である、＜７＞又は＜８＞に記載の非特異反応抑制方法、
＜１０＞抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを接触させることと、シグナルを検出することにより、生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量を測定することと、測定した遊離ＡＩＭ量を基準値と比較することと、
を含む、ＮＡＳＨの検出方法、
＜１１＞前記生物学的試料が、体液試料である、＜１０＞に記載のＮＡＳＨの検出方法、
＜１２＞前記遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体が、モノクローナル抗体である、＜１０＞又は＜１１＞に記載のＮＡＳＨの検出方法、
＜１３＞ＮＡＦＬとＮＡＳＨとを判別する、＜１０＞～＜１２＞のいずれかに記載のＮＡＳＨの検出方法、
＜１４＞抗ＩｇＭ抗体と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを含む、ＮＡＳＨの診断キット、
＜１５＞体液試料中の遊離ＡＩＭ濃度を測定する、＜１４＞に記載のＮＡＳＨの診断キット、並びに
＜１６＞遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体が、モノクローナル抗体である、＜１４＞又は＜１５＞に記載のＮＡＳＨの診断キット。
本発明は、以下の実施形態も包含する。
＜Ａ１＞抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを接触させることを含む、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜Ａ２＞抗ＩｇＭ抗体が、ＨＢＲ－１、ＨＢＲ－３、ＨＢＲ－６、ＨＢＲ－９、ＨＢＲ２０、ＨＢＲ２１、ＨＢＲ２３、及びＨＢＲ２６からなる群から選択される１つ以上である、＜Ａ１＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜Ａ３＞抗ＩｇＭ抗体の濃度が、１～１０００μｇ／ｍＬである＜Ａ１＞又は＜Ａ２＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜Ａ４＞前記生物学的試料が、血液、血清、血漿又は尿である、＜Ａ１＞～＜Ａ３＞のいずれかに記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、
＜Ｂ１＞抗ＩｇＭ抗体と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを含む、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜Ｂ２＞抗ＩｇＭ抗体が、ＨＢＲ－１、ＨＢＲ－３、ＨＢＲ－６、ＨＢＲ－９、ＨＢＲ２０、ＨＢＲ２１、ＨＢＲ２３、及びＨＢＲ２６からなる群から選択される１つ以上である、＜Ｂ１＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜Ｂ３＞抗ＩｇＭ抗体の濃度が、１～１０００μｇ／ｍＬである＜Ｂ１＞又は＜Ｂ２＞に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜Ｂ４＞前記生物学的試料が、血液、血清、血漿又は尿である、＜Ｂ１＞～＜Ｂ３＞のいずれかに記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット、
＜Ｃ１＞抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを接触させることを含む、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析における非特異反応抑制方法、
＜Ｃ２＞抗ＩｇＭ抗体が、ＨＢＲ－１、ＨＢＲ－３、ＨＢＲ－６、ＨＢＲ－９、ＨＢＲ２０、ＨＢＲ２１、ＨＢＲ２３、及びＨＢＲ２６からなる群から選択される１つ以上である、＜Ｃ１＞に記載の非特異反応抑制方法、
＜Ｃ３＞抗ＩｇＭ抗体の濃度が、１～１０００μｇ／ｍＬである＜Ｃ１＞又は＜Ｃ２＞に記載の非特異反応抑制方法、
＜Ｃ４＞前記生物学的試料が、血液、血清、血漿又は尿である、＜Ｃ１＞～＜Ｃ３＞のいずれかに記載の非特異反応抑制方法、
＜Ｄ１＞抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを接触させることと、シグナルを検出することにより、生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量を測定することと、測定した遊離ＡＩＭ量を基準値と比較することと、
を含む、ＮＡＳＨの検出方法、
＜Ｄ２＞抗ＩｇＭ抗体が、ＨＢＲ－１、ＨＢＲ－３、ＨＢＲ－６、ＨＢＲ－９、ＨＢＲ２０、ＨＢＲ２１、ＨＢＲ２３、及びＨＢＲ２６からなる群から選択される１つ以上である、＜Ｄ１＞に記載のＮＡＳＨの検出方法、
＜Ｄ３＞抗ＩｇＭ抗体の濃度が、１～１０００μｇ／ｍＬである＜Ｄ１＞又は＜Ｄ２＞に記載のＮＡＳＨの検出方法、
＜Ｄ４＞前記生物学的試料が、血液、血清、血漿又は尿である、＜Ｄ１＞～＜Ｄ３＞のいずれかに記載のＮＡＳＨの検出方法、
＜Ｅ１＞抗ＩｇＭ抗体と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを含む、ＮＡＳＨの診断キット、
＜Ｅ２＞抗ＩｇＭ抗体が、ＨＢＲ－１、ＨＢＲ－３、ＨＢＲ－６、ＨＢＲ－９、ＨＢＲ２０、ＨＢＲ２１、ＨＢＲ２３、及びＨＢＲ２６からなる群から選択される１つ以上である、＜Ｅ１＞に記載のＮＡＳＨの診断キット、
＜Ｅ３＞抗ＩｇＭ抗体の濃度が、１～１０００μｇ／ｍＬである＜Ｅ１＞又は＜Ｅ２＞に記載のＮＡＳＨの診断キット、
＜Ｅ４＞前記生物学的試料が、血液、血清、血漿又は尿である、＜Ｅ１＞～＜Ｅ３＞のいずれかに記載のＮＡＳＨの診断キット。
本発明によれば、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料において、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体の遊離ＡＩＭに対する特異性をさらに向上させることができる。本発明によれば、患者及び医療従事者に負担をかけず、ＮＡＳＨの診断を行うことができる。
（生物学的試料）
本発明において分析可能な生物学的試料としては、主に生体（生物）由来の固形組織及び体液試料を挙げることができ、体液試料を用いることが好ましい。本発明において分析可能な生物学的試料は、より好ましくは、血液、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、涙液、耳漏、又は前立腺液等の体液試料であり、さらに好ましくは血液、血清、血漿又は尿である。生体又は対象は、ヒト又は動物（例えば、マウス、モルモット、ラット、サル、イヌ、ネコ、ハムスター、ウマ、ウシ、及びブタ）を含み、好ましくはヒトである。対象からの生物学的試料は、本発明の実施時に採取または調製されたものでもよく、予め採取または調製され保存されたものであってもよい。試料を調製する者と試料中の遊離ＡＩＭを分析する者とは別の者であってもよい。生物学的試料は、インビボの試料であることができる。生物学的試料は、ＮＡＳＨを罹患している可能性のある対象、又はＮＡＳＨを罹患している対象であることができる。本発明において、生物学的試料は、遊離ＡＩＭと複合体ＡＩＭの両方を含む。
本発明において分析可能な生物学的試料としては、主に生体（生物）由来の固形組織及び体液試料を挙げることができ、体液試料を用いることが好ましい。本発明において分析可能な生物学的試料は、より好ましくは、血液、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、涙液、耳漏、又は前立腺液等の体液試料であり、さらに好ましくは血液、血清、血漿又は尿である。生体又は対象は、ヒト又は動物（例えば、マウス、モルモット、ラット、サル、イヌ、ネコ、ハムスター、ウマ、ウシ、及びブタ）を含み、好ましくはヒトである。対象からの生物学的試料は、本発明の実施時に採取または調製されたものでもよく、予め採取または調製され保存されたものであってもよい。試料を調製する者と試料中の遊離ＡＩＭを分析する者とは別の者であってもよい。生物学的試料は、インビボの試料であることができる。生物学的試料は、ＮＡＳＨを罹患している可能性のある対象、又はＮＡＳＨを罹患している対象であることができる。本発明において、生物学的試料は、遊離ＡＩＭと複合体ＡＩＭの両方を含む。
（ＡＩＭ）
ＡＩＭ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）は組織マクロファージにより産生される、分子量約５０ｋＤａ分泌型の血中タンパク質である。ＡＩＭは、システイン残基を多く含む特異的な配列であるｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ（ＳＲＣＲ）ドメインをタンデムに３つつなげた構造をしており、それぞれのシステイン残基は各ドメイン内で互いにジスルフィド結合することで、コンパクトな球状の立体構造をしていると考えられている。
ヒトＡＩＭは、配列番号１で表される３４７アミノ酸から成り、システインを多く含む３つのＳＲＣＲドメインを含んでいる。ＳＲＣＲ１ドメインは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号２４～１２５に該当する。ＳＲＣＲ２ドメインは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１３８～２３９に該当する。ＳＲＣＲ３ドメインは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号２４４～３４６に該当する。
ヒトAIMのアミノ酸配列は以下のとおりである。
MALLFSLILAICTRPGFLASPSGVRLVGGLHRCEGRVEVEQKGQWGTVCDDGWDIKDVAVLCRELGCGAASGTPSGILYEPPAEKEQKVLIQSVSCTGTEDTLAQCEQEEVYDCSHDEDAGASCENPESSFSPVPEGVRLADGPGHCKGRVEVKHQNQWYTVCQTGWSLRAAKVVCRQLGCGRAVLTQKRCNKHAYGRKPIWLSQMSCSGREATLQDCPSGPWGKNTCNHDEDTWVECEDPFDLRLVGGDNLCSGRLEVLHKGVWGSVCDDNWGEKEDQVVCKQLGCGKSLSPSFRDRKCYGPGVGRIWLDNVRCSGEEQSLEQCQHRFWGFHDCTHQEDVAVICSG（配列番号１）
すなわち、ヒトＡＩＭ中の、ＳＲＣＲ１ドメイン、ＳＲＣＲ２ドメイン、及びＳＲＣＲ３ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ以下の通りである。
ＳＲＣＲ１ドメイン：
VRLVGGLHRCEGRVEVEQKGQWGTVCDDGWDIKDVAVLCRELGCGAASGTPSGILYEPPAEKEQKVLIQSVSCTGTEDTLAQCEQEEVYDCSHDEDAGASCE（配列番号２）
ＳＲＣＲ２ドメイン：
VRLADGPGHCKGRVEVKHQNQWYTVCQTGWSLRAAKVVCRQLGCGRAVLTQKRCNKHAYGRKPIWLSQMSCSGREATLQDCPSGPWGKNTCNHDEDTWVECE（配列番号３）
ＳＲＣＲ３ドメイン：
LRLVGGDNLCSGRLEVLHKGVWGSVCDDNWGEKEDQVVCKQLGCGKSLSPSFRDRKCYGPGVGRIWLDNVRCSGEEQSLEQCQHRFWGFHDCTHQEDVAVICS（配列番号４）
ＡＩＭ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）は組織マクロファージにより産生される、分子量約５０ｋＤａ分泌型の血中タンパク質である。ＡＩＭは、システイン残基を多く含む特異的な配列であるｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ（ＳＲＣＲ）ドメインをタンデムに３つつなげた構造をしており、それぞれのシステイン残基は各ドメイン内で互いにジスルフィド結合することで、コンパクトな球状の立体構造をしていると考えられている。
ヒトＡＩＭは、配列番号１で表される３４７アミノ酸から成り、システインを多く含む３つのＳＲＣＲドメインを含んでいる。ＳＲＣＲ１ドメインは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号２４～１２５に該当する。ＳＲＣＲ２ドメインは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１３８～２３９に該当する。ＳＲＣＲ３ドメインは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号２４４～３４６に該当する。
ヒトAIMのアミノ酸配列は以下のとおりである。
MALLFSLILAICTRPGFLASPSGVRLVGGLHRCEGRVEVEQKGQWGTVCDDGWDIKDVAVLCRELGCGAASGTPSGILYEPPAEKEQKVLIQSVSCTGTEDTLAQCEQEEVYDCSHDEDAGASCENPESSFSPVPEGVRLADGPGHCKGRVEVKHQNQWYTVCQTGWSLRAAKVVCRQLGCGRAVLTQKRCNKHAYGRKPIWLSQMSCSGREATLQDCPSGPWGKNTCNHDEDTWVECEDPFDLRLVGGDNLCSGRLEVLHKGVWGSVCDDNWGEKEDQVVCKQLGCGKSLSPSFRDRKCYGPGVGRIWLDNVRCSGEEQSLEQCQHRFWGFHDCTHQEDVAVICSG（配列番号１）
すなわち、ヒトＡＩＭ中の、ＳＲＣＲ１ドメイン、ＳＲＣＲ２ドメイン、及びＳＲＣＲ３ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ以下の通りである。
ＳＲＣＲ１ドメイン：
VRLVGGLHRCEGRVEVEQKGQWGTVCDDGWDIKDVAVLCRELGCGAASGTPSGILYEPPAEKEQKVLIQSVSCTGTEDTLAQCEQEEVYDCSHDEDAGASCE（配列番号２）
ＳＲＣＲ２ドメイン：
VRLADGPGHCKGRVEVKHQNQWYTVCQTGWSLRAAKVVCRQLGCGRAVLTQKRCNKHAYGRKPIWLSQMSCSGREATLQDCPSGPWGKNTCNHDEDTWVECE（配列番号３）
ＳＲＣＲ３ドメイン：
LRLVGGDNLCSGRLEVLHKGVWGSVCDDNWGEKEDQVVCKQLGCGKSLSPSFRDRKCYGPGVGRIWLDNVRCSGEEQSLEQCQHRFWGFHDCTHQEDVAVICS（配列番号４）
（遊離ＡＩＭ）
本明細書において、「遊離ＡＩＭ」とは、リポ多糖又はＩｇＭ等の他の物質と結合していない、遊離状態で存在するＡＩＭを意味する。これに対し、本明細書において、リポ多糖又はＩｇＭ等の他の物質と結合しており、他の物質との複合体の状態で存在するＡＩＭを複合体ＡＩＭと称する。遊離ＡＩＭとは、好ましくは、遊離状態で存在するヒトＡＩＭである。遊離ＡＩＭとは、好ましくは、ヒトの遊離ＡＩＭであり、複合体ＡＩＭとは、好ましくは、ヒトの複合体ＡＩＭである。
本明細書において、「遊離ＡＩＭ」とは、リポ多糖又はＩｇＭ等の他の物質と結合していない、遊離状態で存在するＡＩＭを意味する。これに対し、本明細書において、リポ多糖又はＩｇＭ等の他の物質と結合しており、他の物質との複合体の状態で存在するＡＩＭを複合体ＡＩＭと称する。遊離ＡＩＭとは、好ましくは、遊離状態で存在するヒトＡＩＭである。遊離ＡＩＭとは、好ましくは、ヒトの遊離ＡＩＭであり、複合体ＡＩＭとは、好ましくは、ヒトの複合体ＡＩＭである。
（抗ＩｇＭ抗体）
本明細書において使用される用語「抗ＩｇＭ抗体」は、ＩｇＭに結合する性質を有する抗体を意味する。換言すれば、「抗ＩｇＭ抗体」は、オクタローニー法によりヒトＩｇＭと沈降線を生ずる物質を意味する。ＩｇＭに結合性を有し且つ本発明の効果を損なわない範囲内で、他の抗原に対して結合性を有してもよい。本発明において使用される抗ＩｇＭ抗体は、好ましくは抗ヒトＩｇＭ抗体である。本発明において使用される抗ＩｇＭ抗体としては、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれも使用可能であるが、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体の感度を確保する観点から、モノクローナル抗体を使用することが好ましい。抗ＩｇＭ抗体は、ＩｇＭと結合することができる機能性断片であってもよい。本発明の免疫学的分析方法においては、ヒト血清サンプルに対する抗ＩｇＭ抗体の使用により、抗ＩｇＭ抗体非添加の場合と比較して、複合体ＡＩＭに由来する非特異反応を５０％以下、好ましくは４０％以下に減少させることができる。
本発明において使用される抗ＩｇＭ抗体として、市販の抗ＩｇＭ抗体を使用することもできる。市販の抗ＩｇＭ抗体としては、ＨＢＲ－１、ＨＢＲ－３、ＨＢＲ－６、ＨＢＲ－９、ＨＢＲ２０、ＨＢＲ２１、ＨＢＲ２３、及びＨＢＲ２６（SCANTIBODIES社）等が使用できる。非特異反応を効果的に防止することから、ＨＢＲ－６及び／又はＨＲＢ－２０を使用することが好ましい。
抗ＩｇＭ抗体の添加濃度は十分な非特異反応抑制効果を示し、かつ免疫学的測定の本反応に影響を及ぼさない濃度であれば特に制限はないが、モノクローナル抗体である場合、１～１０００μｇ／ｍＬの濃度範囲での利用が望ましく、１０～１０００μｇ/ｍＬがより望ましく、１０～３００μｇ／ｍＬがさらに望ましい。ポリクローナル抗体である場合、０．０１～２重量％の濃度範囲での利用が望ましく、０．０３～２重量％の濃度範囲での利用が望ましく、０．０５～１重量％がさらに望ましい。
本発明において、抗ＩｇＭ抗体のＩｇＭへの結合親和性は、本発明の効果が得られる限りにおいて特に限定されることはないが、例えば、ＩｇＭに対して少なくとも約１０-4Ｍ、少なくとも約１０-5Ｍ、少なくとも約１０-6Ｍ、少なくとも約１０-7Ｍ、少なくとも約１０-8Ｍ、少なくとも約１０-9Ｍ、少なくとも約１０-10Ｍ、少なくとも約１０-11Ｍ、少なくとも約１０-12Ｍ、またはそれ以上のＫｄであることができる。
本明細書において使用される用語「抗ＩｇＭ抗体」は、ＩｇＭに結合する性質を有する抗体を意味する。換言すれば、「抗ＩｇＭ抗体」は、オクタローニー法によりヒトＩｇＭと沈降線を生ずる物質を意味する。ＩｇＭに結合性を有し且つ本発明の効果を損なわない範囲内で、他の抗原に対して結合性を有してもよい。本発明において使用される抗ＩｇＭ抗体は、好ましくは抗ヒトＩｇＭ抗体である。本発明において使用される抗ＩｇＭ抗体としては、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれも使用可能であるが、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体の感度を確保する観点から、モノクローナル抗体を使用することが好ましい。抗ＩｇＭ抗体は、ＩｇＭと結合することができる機能性断片であってもよい。本発明の免疫学的分析方法においては、ヒト血清サンプルに対する抗ＩｇＭ抗体の使用により、抗ＩｇＭ抗体非添加の場合と比較して、複合体ＡＩＭに由来する非特異反応を５０％以下、好ましくは４０％以下に減少させることができる。
本発明において使用される抗ＩｇＭ抗体として、市販の抗ＩｇＭ抗体を使用することもできる。市販の抗ＩｇＭ抗体としては、ＨＢＲ－１、ＨＢＲ－３、ＨＢＲ－６、ＨＢＲ－９、ＨＢＲ２０、ＨＢＲ２１、ＨＢＲ２３、及びＨＢＲ２６（SCANTIBODIES社）等が使用できる。非特異反応を効果的に防止することから、ＨＢＲ－６及び／又はＨＲＢ－２０を使用することが好ましい。
抗ＩｇＭ抗体の添加濃度は十分な非特異反応抑制効果を示し、かつ免疫学的測定の本反応に影響を及ぼさない濃度であれば特に制限はないが、モノクローナル抗体である場合、１～１０００μｇ／ｍＬの濃度範囲での利用が望ましく、１０～１０００μｇ/ｍＬがより望ましく、１０～３００μｇ／ｍＬがさらに望ましい。ポリクローナル抗体である場合、０．０１～２重量％の濃度範囲での利用が望ましく、０．０３～２重量％の濃度範囲での利用が望ましく、０．０５～１重量％がさらに望ましい。
本発明において、抗ＩｇＭ抗体のＩｇＭへの結合親和性は、本発明の効果が得られる限りにおいて特に限定されることはないが、例えば、ＩｇＭに対して少なくとも約１０-4Ｍ、少なくとも約１０-5Ｍ、少なくとも約１０-6Ｍ、少なくとも約１０-7Ｍ、少なくとも約１０-8Ｍ、少なくとも約１０-9Ｍ、少なくとも約１０-10Ｍ、少なくとも約１０-11Ｍ、少なくとも約１０-12Ｍ、またはそれ以上のＫｄであることができる。
抗ＩｇＭ抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれも公知の方法に従って作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、ＩｇＭ又はＩｇＭフラグメントで免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞である脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を単離し、これを高い増殖能を有する骨髄腫由来の細胞株等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、ＩｇＭ又はＩｇＭフラグメントで免疫した動物の血清から得ることができる。また、免疫原としては、例えば、ヒトやサルなどの霊長類、ラットやマウスなどのげっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどの、ＩｇＭ又はＩｇＭフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
抗ＩｇＭ抗体としては、抗体分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントを使用することも可能であり、前記のように動物への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術を使用して得られるものやキメラ抗体を用いることも可能である。抗体の断片としては機能性の断片であることが好ましく、例えば、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆａｂ'、ｓｃＦｖなどが挙げられ、これらのフラグメントは前記のようにして得られる抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理すること、あるいは該抗体のＤＮＡをクローニングして大腸菌や酵母を用いた培養系で発現させることにより製造できる。
本明細書において「非特異反応」とは、本発明において使用される抗ＡＩＭ抗体に、遊離ＡＩＭ以外の物質が結合することを意味する。本発明では、抗ＩｇＭ抗体を用いることで、複合体ＡＩＭ、特にＩｇＭが結合パートナーとして結合している複合体ＡＩＭによる非特異反応を抑制することができる。
（遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体）
本明細書では、「遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体」は、抗ＩｇＭ抗体の非存在下において遊離ＡＩＭにのみ反応し、複合体ＡＩＭとは実質的に反応しない抗体を意味する。本明細書において「遊離ＡＩＭには実質的に反応しない」とは、当業者に公知の手法により抗体の反応性を測定した場合に、遊離ＡＩＭに対する結合力を１００とした場合の、複合体ＡＩＭに対する結合力が１０％未満である場合を意味する。なお、本明細書において「抗ＡＩＭ抗体」とは、遊離ＡＩＭに反応する抗体を意味する。すなわち、本明細書において「抗ＡＩＭ抗体」には、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体及び遊離ＡＩＭと複合体ＡＩＭのいずれにも反応する抗体が含まれる。
本発明の免疫学的分析方法において用いられる、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体は、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合するものであることができる。本発明の免疫学的分析方法において用いられる、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体は、好ましくは、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合し、ＳＲＣＲ１ドメインには結合しない。本発明の免疫学的分析方法において用いられる、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体は、さらに好ましくは、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合し、ＳＲＣＲ１ドメイン及びＳＲＣＲ３ドメインのいずれにも結合しない。
本明細書では、「遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体」は、抗ＩｇＭ抗体の非存在下において遊離ＡＩＭにのみ反応し、複合体ＡＩＭとは実質的に反応しない抗体を意味する。本明細書において「遊離ＡＩＭには実質的に反応しない」とは、当業者に公知の手法により抗体の反応性を測定した場合に、遊離ＡＩＭに対する結合力を１００とした場合の、複合体ＡＩＭに対する結合力が１０％未満である場合を意味する。なお、本明細書において「抗ＡＩＭ抗体」とは、遊離ＡＩＭに反応する抗体を意味する。すなわち、本明細書において「抗ＡＩＭ抗体」には、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体及び遊離ＡＩＭと複合体ＡＩＭのいずれにも反応する抗体が含まれる。
本発明の免疫学的分析方法において用いられる、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体は、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合するものであることができる。本発明の免疫学的分析方法において用いられる、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体は、好ましくは、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合し、ＳＲＣＲ１ドメインには結合しない。本発明の免疫学的分析方法において用いられる、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体は、さらに好ましくは、ヒトＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン内のエピトープに結合し、ＳＲＣＲ１ドメイン及びＳＲＣＲ３ドメインのいずれにも結合しない。
本発明の免疫学的分析方法では、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を少なくとも１つ使用する。測定対象となる遊離ＡＩＭを異なるエピトープを認識する２種の抗体でサンドイッチするいわゆるサンドイッチアッセイを行う場合、一方の抗体が遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体であればよく、もう一方の抗体は抗ＡＩＭ抗体であればよいが、２種の抗体いずれもが遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体であることが好ましい。測定対象となる遊離ＡＩＭを異なるエピトープを認識する２種の抗体でサンドイッチするいわゆるサンドイッチアッセイを行う場合、２種の抗体が、異なるエピトープを認識することが好ましい。また、後述のＥＣＬ法又はＥＬＩＳＡ法を行う場合は、固相に固定化された固相抗体として遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を使用することが好ましい。
本発明の免疫学的分析方法において使用される、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体の遊離ＡＩＭへの結合親和性は、本発明の効果が得られる限りにおいて特に限定されることはないが、例えば、ＩｇＭに対して少なくとも約１０-4Ｍ、少なくとも約１０-5Ｍ、少なくとも約１０-6Ｍ、少なくとも約１０-7Ｍ、少なくとも約１０-8Ｍ、少なくとも約１０-9Ｍ、少なくとも約１０-10Ｍ、少なくとも約１０-11Ｍ、少なくとも約１０-12Ｍ、またはそれ以上のＫｄであることができる。
抗体と、複合体ＡＩＭなどの特定の化合物が「実質的に反応しない」かどうかの確認は、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などにより行うことができるほか、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の原理を利用した方法（ＳＰＲ法）などにより行うことができる。ＳＰＲ法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の名称で市販されている、装置、センサー、試薬類を使用して行うことができる。
本発明の免疫学的分析方法では、抗ＩｇＭ抗体を反応系に存在させることにより、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体と複合体ＡＩＭとの反応性をさらに低下させることができる。抗ＩｇＭ抗体を測定系に添加するタイミングについては、本発明の効果が得られる限りにおいて特に限定されることはないが、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体の添加より前に又は添加と同時に添加することが好ましい。
遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれも公知の方法に従って作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、遊離ＡＩＭ若しくは遊離ＡＩＭフラグメントで免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞である脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を単離し、これを高い増殖能を有する骨髄腫由来の細胞株等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、遊離ＡＩＭ若しくは遊離ＡＩＭフラグメントで免疫した動物の血清から得ることができる。また、免疫原としては、例えば、ヒトやサルなどの霊長類、ラットやマウスなどのげっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどの、遊離ＡＩＭ若しくは遊離ＡＩＭフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体としては、抗体分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントを使用することも可能である。前記のように動物への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術を使用して得られるものやキメラ抗体を用いることも可能である。抗体の断片としては機能性の断片であることが好ましく、例えば、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆａｂ'、ｓｃＦｖなどが挙げられる。これらのフラグメントは前記のようにして得られる抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理すること、あるいは該抗体のＤＮＡをクローニングして大腸菌や酵母を用いた培養系で発現させることにより製造できる。
本明細書において、遊離ＡＩＭと「反応する」、遊離ＡＩＭを「認識する」、遊離ＡＩＭと「結合する」は、同義で用いられるが、これらの例示に限定されることはなく、最も広義に解釈する必要がある。抗体が遊離ＡＩＭなどの抗原（化合物）と「反応する」か否かの確認は、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などにより行うことができるほか、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の原理を利用した方法（ＳＰＲ法）などにより行うことができる。ＳＰＲ法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の名称で市販されている、装置、センサー、試薬類を使用して行うことができる。
本明細書において、「不溶性担体」を「固相」、抗原や抗体を不溶性担体に物理的あるいは化学的に担持させることあるいは担持させた状態を「固定」、「固定化」、又は「固相化」と表現することがある。また、「分析」、「検出」、又は「測定」という用語は、遊離ＡＩＭの存在の証明及び／又は定量などを含めて最も広義に解釈する必要があり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
（免疫学的分析方法）
本発明において使用される免疫学的分析方法としては、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）、ＥＬＩＳＡ、酵素免疫測定法、免疫組織染色法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフ法、EATA法(Electrokinetic Analyte Transport Assay)及び高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明において使用される免疫学的分析方法としては、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）、ＥＬＩＳＡ、酵素免疫測定法、免疫組織染色法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフ法、EATA法(Electrokinetic Analyte Transport Assay)及び高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
使用される抗体と結合可能な標識抗体（二次抗体）を用いることにより、遊離ＡＩＭに結合した抗体の量を測定することができ、それにより生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量を測定することができる。標識抗体を製造するための標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、放射性同位体、金コロイド粒子、又は着色ラテックスなどが挙げられる。当業者であれば、使用される抗体と標識物質に応じて、免疫学的分析方法を適宜選択することができる。
免疫学的分析方法としては、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）を用いることが好ましい。電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）とは、標識物質を電気化学的刺激により発光させ，その発光量を検出することで被検出物質量を算出する方法を意味する。電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）では、標識物質として、ルテニウム錯体を用いることができる。固相（マイクロプレート又はビーズ等）に電極を設置してこの電極上で電気化学的刺激を起こすことにより、このルテニウム錯体の発光量を検出することができる。
遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固相抗体及び検出抗体のいずれの用途として用いてもよいが、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固相抗体として用い、固相抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭ抗体を検出抗体（標識抗体）として用いて電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）を行うことが好ましい。遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固相抗体として用い、標識抗体として抗ＡＩＭ抗体を用い、そして、固相としてビーズ、標識としてルテニウム錯体をそれぞれ用いた際の測定原理は、以下のとおりである。下記は本発明の一実施態様における測定原理を示すものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
１．抗ＩｇＭ抗体の存在下で、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体が結合したビーズと試料とを反応させると、試料中の遊離ＡＩＭがビーズに結合した固相抗体と結合する。
２．ビーズを洗浄後、ビーズに結合した遊離ＡＩＭに、ルテニウム標識抗体を反応させると、サンドイッチ状に結合する。
３．ビーズを洗浄後、電極上にて電気エネルギーを加えると、遊離ＡＩＭを介してビーズに結合したルテニウム標識抗体量に応じて、ルテニウム錯体が発光する。この発光量を計測することにより、検体中の遊離ＡＩＭを測定することができる。
また、ルテニウム標識抗体として、固相抗体とは異なるエピトープを認識する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を使用することもできる。
遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固相抗体及び検出抗体のいずれの用途として用いてもよいが、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固相抗体として用い、固相抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭ抗体を検出抗体（標識抗体）として用いて電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ法）を行うことが好ましい。遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固相抗体として用い、標識抗体として抗ＡＩＭ抗体を用い、そして、固相としてビーズ、標識としてルテニウム錯体をそれぞれ用いた際の測定原理は、以下のとおりである。下記は本発明の一実施態様における測定原理を示すものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
１．抗ＩｇＭ抗体の存在下で、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体が結合したビーズと試料とを反応させると、試料中の遊離ＡＩＭがビーズに結合した固相抗体と結合する。
２．ビーズを洗浄後、ビーズに結合した遊離ＡＩＭに、ルテニウム標識抗体を反応させると、サンドイッチ状に結合する。
３．ビーズを洗浄後、電極上にて電気エネルギーを加えると、遊離ＡＩＭを介してビーズに結合したルテニウム標識抗体量に応じて、ルテニウム錯体が発光する。この発光量を計測することにより、検体中の遊離ＡＩＭを測定することができる。
また、ルテニウム標識抗体として、固相抗体とは異なるエピトープを認識する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を使用することもできる。
イムノアッセイの中で、酵素標識を用いるＥＬＩＳＡ法も、簡便且つ迅速に標的を測定することができて好ましい。サンドイッチＥＬＩＳＡの場合、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固定化した不溶性担体と、標識物質で標識された、固定抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭ抗体とを使用することができる。この場合、不溶性担体はプレート（イムノプレート）が好ましく、標識物質は、適宜選択して使用できる。
遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固相抗体及び検出抗体のいずれの用途として用いてもよいが、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固相抗体として用い、固相抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭ抗体を検出抗体（標識抗体）として用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行うことが好ましい。不溶性担体に固定化された遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体は、抗ＩｇＭ抗体の存在下において、試料中の遊離ＡＩＭを捕捉し、不溶性担体上で抗体－遊離ＡＩＭ複合体を形成する。標識物質で標識された抗体は、前記捕捉された遊離ＡＩＭに結合して前述の抗体－遊離ＡＩＭ複合体とサンドイッチを形成する。標識
物質に応じた方法により標識物質の量を測定することにより、試料中の遊離ＡＩＭを測定することができる。抗体の不溶性担体への固定化の方法、抗体と標識物質との結合方法等、具体的な方法は、当業者に周知の方法を特に制限なく使用することができる。
また、標識抗体として、固相抗体とは異なるエピトープを認識する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を使用することもできる。 また、免疫学的分析方法として、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）あるいはEATA法（Electrokinetic Analyte Transport Assay）を用いることも可能である。EATA法は、富士フィルム和光純薬株式会社製のミュータスワコーi30を使用して実施することができる。
遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固相抗体及び検出抗体のいずれの用途として用いてもよいが、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固相抗体として用い、固相抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭ抗体を検出抗体（標識抗体）として用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを行うことが好ましい。不溶性担体に固定化された遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体は、抗ＩｇＭ抗体の存在下において、試料中の遊離ＡＩＭを捕捉し、不溶性担体上で抗体－遊離ＡＩＭ複合体を形成する。標識物質で標識された抗体は、前記捕捉された遊離ＡＩＭに結合して前述の抗体－遊離ＡＩＭ複合体とサンドイッチを形成する。標識
物質に応じた方法により標識物質の量を測定することにより、試料中の遊離ＡＩＭを測定することができる。抗体の不溶性担体への固定化の方法、抗体と標識物質との結合方法等、具体的な方法は、当業者に周知の方法を特に制限なく使用することができる。
また、標識抗体として、固相抗体とは異なるエピトープを認識する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を使用することもできる。 また、免疫学的分析方法として、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）あるいはEATA法（Electrokinetic Analyte Transport Assay）を用いることも可能である。EATA法は、富士フィルム和光純薬株式会社製のミュータスワコーi30を使用して実施することができる。
免疫学的分析方法としては、代表的な粒子凝集免疫測定法であるラテックス免疫凝集法（以下、ＬＴＩＡ法ということがある）も好ましい。ＬＴＩＡ法では、目的成分に対する抗体を担持させたラテックス粒子を用い、目的成分である抗原と抗体担持ラテックス粒子とが抗原抗体複合物を形成して結合することによって生じるラテックス粒子の凝集（濁り）の程度を光学的手段（例えば、透過光を測定する比濁法、散乱光を測定する比朧法など）などにより検出し、目的成分を分析することができる。本発明の免疫学的分析方法では、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を担持させたラテックス粒子を用い、抗ＩｇＭ抗体の存在下において、目的成分である遊離ＡＩＭと抗体担持ラテックス粒子とが抗原抗体複合物を形成して結合することによって生じるラテックス粒子の凝集の程度を光学的手段により検出することができる。ＬＴＩＡ法を採用する場合、遊離ＡＩＭに特異的に反応する２種以上の抗体を使用することができ、又は遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体と遊離ＡＩＭ及び複合体ＡＩＭのいずれにも反応する性質を有する抗体とを使用することもできる。
［２］遊離ＡＩＭ量の測定キット
本発明の遊離ＡＩＭ量の測定キットは、抗ＩｇＭ抗体と遊離ＡＩＭに特異的に反応する少なくとも１つの抗体とを含む。本発明の測定キットには、ほかに、他の検査試薬、検体希釈液、及び／又は使用説明書などを含むこともできる。
本発明の遊離ＡＩＭ量の測定キットは、抗ＩｇＭ抗体と遊離ＡＩＭに特異的に反応する少なくとも１つの抗体とを含む。本発明の測定キットには、ほかに、他の検査試薬、検体希釈液、及び／又は使用説明書などを含むこともできる。
本発明の遊離ＡＩＭ量の測定キットは、好ましくは、以下の（１）～（３）を含むＥＣＬ法による遊離ＡＩＭ分析キットであることができる。
（１）遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固定化した固相、
（２）電気化学発光物質で標識した、固定化抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭ抗体、並びに
（３）抗ＩｇＭ抗体。
ＥＣＬ法を使用する場合、本発明の測定キットは、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固定化した固相とルテニウム錯体等の電気化学発光物質で標識した抗ＡＩＭ抗体とを含むことが好ましい。例えば、固相としてマイクロビーズを用いたキットでは、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固相化したマイクロビーズに、抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料を添加して反応させた後、試料を除去して洗浄する。続いて、電気化学発光物質を標識した、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭ抗体を添加して反応させる。マイクロビーズを洗浄後、電気エネルギーを加えて発光させ標識物質の発光量を測定することにより、遊離ＡＩＭ濃度を求めることができる。
また、固定抗体及び標識抗体の少なくとも一方が遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体であればよく、電気化学発光物質標識抗体として、固相抗体とは異なるエピトープを認識する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を使用することもできる。
（１）遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固定化した固相、
（２）電気化学発光物質で標識した、固定化抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭ抗体、並びに
（３）抗ＩｇＭ抗体。
ＥＣＬ法を使用する場合、本発明の測定キットは、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固定化した固相とルテニウム錯体等の電気化学発光物質で標識した抗ＡＩＭ抗体とを含むことが好ましい。例えば、固相としてマイクロビーズを用いたキットでは、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を固相化したマイクロビーズに、抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料を添加して反応させた後、試料を除去して洗浄する。続いて、電気化学発光物質を標識した、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭ抗体を添加して反応させる。マイクロビーズを洗浄後、電気エネルギーを加えて発光させ標識物質の発光量を測定することにより、遊離ＡＩＭ濃度を求めることができる。
また、固定抗体及び標識抗体の少なくとも一方が遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体であればよく、電気化学発光物質標識抗体として、固相抗体とは異なるエピトープを認識する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を使用することもできる。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用する場合、測定キットは少なくとも、以下の（１）～（３）を含むサンドイッチＥＬＩＳＡ法による遊離ＡＩＭ分析キットであることができる。
（１）遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体（固相抗体）を固定化した不溶性担体、
（２）標識物質で標識された、固相抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭ抗体（標識抗体）、及び
（３）抗ＩｇＭ抗体。
このようなキットでは、まず、固相抗体を固定化した不溶性担体に、抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料を添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。次に、標識抗体を添加した後インキュベートし、基質を加えて発色させる。プレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、生物学的試料中における遊離ＡＩＭ濃度を求めることができる。
また、固定抗体及び標識抗体の少なくとも一方が遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体であればよく、標識抗体として、固相抗体とは異なるエピトープを認識する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を使用することもできる。
（１）遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体（固相抗体）を固定化した不溶性担体、
（２）標識物質で標識された、固相抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭ抗体（標識抗体）、及び
（３）抗ＩｇＭ抗体。
このようなキットでは、まず、固相抗体を固定化した不溶性担体に、抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料を添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。次に、標識抗体を添加した後インキュベートし、基質を加えて発色させる。プレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、生物学的試料中における遊離ＡＩＭ濃度を求めることができる。
また、固定抗体及び標識抗体の少なくとも一方が遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体であればよく、標識抗体として、固相抗体とは異なるエピトープを認識する、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体を使用することもできる。
ＬＴＩＡ法を使用する場合、測定キットは少なくとも、以下の（１）～（３）を含むＬＴＩＡ法による遊離ＡＩＭ分析キットであることができる。
（１）遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体（第一固相抗体）を固定化したラテックス粒子、
（２）固相抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭ抗体（第二固相抗体）を固定化したラテックス粒子、及び
（３）抗ＩｇＭ抗体。
このようなキットでは、抗ＩｇＭ抗体存在下において、遊離ＡＩＭを介して第一固相抗体と第二固相抗体とが凝集する。凝集の程度を光学的手段を用いて検出することにより、生物学的試料中における遊離ＡＩＭ濃度を求めることができる。
（１）遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体（第一固相抗体）を固定化したラテックス粒子、
（２）固相抗体とは異なるエピトープを認識する抗ＡＩＭ抗体（第二固相抗体）を固定化したラテックス粒子、及び
（３）抗ＩｇＭ抗体。
このようなキットでは、抗ＩｇＭ抗体存在下において、遊離ＡＩＭを介して第一固相抗体と第二固相抗体とが凝集する。凝集の程度を光学的手段を用いて検出することにより、生物学的試料中における遊離ＡＩＭ濃度を求めることができる。
（ＮＡＳＨ）
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は肝細胞に脂肪が沈着するのみの単純性脂肪肝と、脂肪沈着とともに肝細胞の変性・壊死、炎症と共に線維化を伴う脂肪性肝炎に大別され、「ＮＡＳＨ」は後者を意味する。すなわち、本明細書において、「ＮＡＳＨ」とは、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）のうち、肝細胞に脂肪が沈着するのみの単純性脂肪肝以外の疾患を意味する。
ＮＡＳＨの病理学的診断は、例えば、日本消化器病学会ＮＡＦＬＤＮＡＳＨ診療ガイドライン（２０１４年版）に従い行うことができる。具体的には、前記ガイドラインの８０頁に記載のＭａｔｔｅｏｎｉ分類に基づき患者を分類し、Ｔｙｐｅ３及び４をＮＡＳＨと診断することができる。Ｔｙｐｅ１及び２は、ＮＡＦＬと診断することができる。なお、また、前記ガイドラインの８２頁に記載のＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ）に基づき患者を分類し、ＮＡＳ５点以上はＮＡＳＨの可能性が高い。また、前記ガイドラインの８２頁に記載のＹｏｕｎｏｓｓｉの診断基準に基づき、以下の（１）又は（２）を満たす場合をＮＡＳＨと診断することができる。
（１）肝細胞の脂肪化（程度は問わない）に加え小葉中心性の肝細胞の風船様変性（ｃｅｎｔｒｉｌｏｂｕｌａｒ ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ）やＭａｌｌｏｒｙ－Ｄｅｎｋ体を認めるもの。
（２）肝細胞の脂肪化に加え小葉中心性の細胞周囲／類洞周囲（ｐｅｒｉｃｅｌｌｕｌａｒ／ｐｅｒｉｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ）の線維化または架橋形成（ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を認めるもの。
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は肝細胞に脂肪が沈着するのみの単純性脂肪肝と、脂肪沈着とともに肝細胞の変性・壊死、炎症と共に線維化を伴う脂肪性肝炎に大別され、「ＮＡＳＨ」は後者を意味する。すなわち、本明細書において、「ＮＡＳＨ」とは、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）のうち、肝細胞に脂肪が沈着するのみの単純性脂肪肝以外の疾患を意味する。
ＮＡＳＨの病理学的診断は、例えば、日本消化器病学会ＮＡＦＬＤＮＡＳＨ診療ガイドライン（２０１４年版）に従い行うことができる。具体的には、前記ガイドラインの８０頁に記載のＭａｔｔｅｏｎｉ分類に基づき患者を分類し、Ｔｙｐｅ３及び４をＮＡＳＨと診断することができる。Ｔｙｐｅ１及び２は、ＮＡＦＬと診断することができる。なお、また、前記ガイドラインの８２頁に記載のＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ）に基づき患者を分類し、ＮＡＳ５点以上はＮＡＳＨの可能性が高い。また、前記ガイドラインの８２頁に記載のＹｏｕｎｏｓｓｉの診断基準に基づき、以下の（１）又は（２）を満たす場合をＮＡＳＨと診断することができる。
（１）肝細胞の脂肪化（程度は問わない）に加え小葉中心性の肝細胞の風船様変性（ｃｅｎｔｒｉｌｏｂｕｌａｒ ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ）やＭａｌｌｏｒｙ－Ｄｅｎｋ体を認めるもの。
（２）肝細胞の脂肪化に加え小葉中心性の細胞周囲／類洞周囲（ｐｅｒｉｃｅｌｌｕｌａｒ／ｐｅｒｉｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ）の線維化または架橋形成（ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を認めるもの。
本明細書において「ＮＡＳＨ」は、ＮＡＳＨが進行した肝硬変を含むが、ＮＡＳＨが進行した肝細胞癌を含まないものとする。
特許文献１においては、ＮＡＦＬに罹患する対象とＮＡＳＨに罹患している対象の血清中の遊離ＡＩＭ量において、差異は見受けられなかったことが記載されている。それにもかかわらず、抗ＩｇＭ抗体の存在下で分析を行ったところ、ＮＡＦＬに罹患する対象とＮＡＳＨに罹患している対象の血清中の遊離ＡＩＭ量において、有意差を確認することができた。特許文献１においては、遊離ＡＩＭの免疫学的分析において複合体ＡＩＭによる非特異的反応が生じ、両者の間に有意差が生じなかったものと推定される。
本発明のＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨの検出又方法を行った後、必要に応じて、他のＮＡＳＨの検出方法の患者への実施、及び／又はＮＡＳＨ治療薬の患者への投与を実施してもよい。
（シグナル）
シグナルは、遊離ＡＩＭ量を正確に測定できる限り特に限定されることはなく、当業者に公知の任意のシグナルを採用することができる。シグナルは、抗体に標識した標識物質が発するシグナルであることができる。抗体に標識した標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、又は放射性同位体、金コロイド粒子、着色ラテックス粒子等が挙げられる。また標識物質と抗体との結合方法としては、当業者に利用可能なグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、又は過ヨウ素酸法等の方法を用いることができる。標識物質、結合方法のいずれも、上記に限定されることなく公知の方法を用いることができる。例えば、パーオキシダーゼやアルカリホスファターゼ等の酵素を標識物質として用いる場合には、その酵素の特異的基質（酵素が西洋ワサビパーオキシダーゼの場合には、例えば1,2-フェニレンジアミンあるいは3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン、アルカリホスファターゼの場合には、p-ニトロフェニルホスフェート等）を用いて酵素活性を測定することができ、ビオチンを標識物質として用いる場合には少なくともビオチン以外の標識物質で標識されたアビジンを反応させるのが一般的である。
シグナルは、遊離ＡＩＭ量を正確に測定できる限り特に限定されることはなく、当業者に公知の任意のシグナルを採用することができる。シグナルは、抗体に標識した標識物質が発するシグナルであることができる。抗体に標識した標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、又は放射性同位体、金コロイド粒子、着色ラテックス粒子等が挙げられる。また標識物質と抗体との結合方法としては、当業者に利用可能なグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、又は過ヨウ素酸法等の方法を用いることができる。標識物質、結合方法のいずれも、上記に限定されることなく公知の方法を用いることができる。例えば、パーオキシダーゼやアルカリホスファターゼ等の酵素を標識物質として用いる場合には、その酵素の特異的基質（酵素が西洋ワサビパーオキシダーゼの場合には、例えば1,2-フェニレンジアミンあるいは3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン、アルカリホスファターゼの場合には、p-ニトロフェニルホスフェート等）を用いて酵素活性を測定することができ、ビオチンを標識物質として用いる場合には少なくともビオチン以外の標識物質で標識されたアビジンを反応させるのが一般的である。
ＬＴＩＡ法を使用する場合は、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を用いてラテックスの凝集の度合いを光学的に測定し、このラテックスの凝集度合いをシグナルとして用いることもできる。上記光学的測定には、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出できる光学機器、またはこれらの検出方法を複数備えた光学機器などに代表される一般の生化学自動分析機であればいずれも使用することができる。上記凝集の度合いを光学的に測定する方法としては従来公知の方法が用いられ、例えば、凝集の形成を濁度の増加としてとらえる比濁法、凝集の形成を粒度分布又は平均粒径の変化としてとらえる方法、凝集の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し透過光強度との比を比較する積分球濁度法等が挙げられる。
（基準値）
本発明のＮＡＳＨの検出方法は、測定した遊離ＡＩＭ量を基準値と比較することを含む。本発明のＮＡＳＨの検出方法では、対象における遊離ＡＩＭ量の量が、健常人群又はＮＡＦＬ群の遊離ＡＩＭ量よりも高いことを指標としてＮＡＳＨの検出を行うことができる。具体的には、例えば、対象における遊離ＡＩＭ量が健常人群又はＮＡＦＬ群との判定用閾値（基準値）以上となった場合に、ＮＡＳＨを罹患している可能性が高いと判定することができる。
本発明のＮＡＳＨの検出方法は、測定した遊離ＡＩＭ量を基準値と比較することを含む。本発明のＮＡＳＨの検出方法では、対象における遊離ＡＩＭ量の量が、健常人群又はＮＡＦＬ群の遊離ＡＩＭ量よりも高いことを指標としてＮＡＳＨの検出を行うことができる。具体的には、例えば、対象における遊離ＡＩＭ量が健常人群又はＮＡＦＬ群との判定用閾値（基準値）以上となった場合に、ＮＡＳＨを罹患している可能性が高いと判定することができる。
数値の範囲を基準値とすることもできる。ＮＡＳＨに罹患しているか否かを診断する際には、予め、ＮＡＳＨに罹患していると診断された対象、および、ＮＡＳＨではないと診断された対象の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量の範囲を計測しておき、対象の生物学的試料中の前記遊離ＡＩＭ量が、健常な対象又はＮＡＦＬを罹患している対象の生物学的試料中の前記遊離ＡＩＭ量の範囲に入る場合は、この対象はＮＡＳＨを罹患していない可能性が高く、ＮＡＳＨに罹患している対象の生物学的試料中の前記遊離ＡＩＭ量の範囲に入る場合は、ＮＡＳＨに罹患している可能性が高い。
判定用閾値（基準値）は、種々条件、例えば、基礎疾患、性別、年齢などにより変化することが予想されるが、当業者であれば、対象に対応する適当な母集団を適宜選択して、その集団から得られたデータを統計学的処理を行うことにより、正常値範囲又は判定用閾値を決定することができる。基準値は、例えば、ヒト血清中の値において０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．６μｇ／ｍＬ、０．７μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬ、０．９μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、１．１μｇ／ｍＬ、１．２μｇ／ｍＬ、１．３μｇ／ｍＬ、１．４μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ、１．６μｇ／ｍL、１．７μｇ／ｍＬ、１．８μｇ／ｍＬ、１．９μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬ、２．１μｇ／ｍＬ、２．２μｇ／ｍＬ、２．３μｇ／ｍＬ、２．４μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、２．６μｇ／ｍＬ、２．７μｇ／ｍＬ、２．８μｇ／ｍＬ、２．９μｇ／ｍＬ、３．０μｇ／ｍＬ、３．１μｇ／ｍＬ、３．２μｇ／ｍＬ、３．３μｇ／ｍＬ、３．４μｇ／ｍＬ、又は３．５μｇ／ｍＬとすることができる。
本発明のＮＡＳＨの検出方法は、対象のＮＡＦＬからＮＡＳＨへの進行をモニタリングすることもできる。特定の時点でのＮＡＦＬを罹患している対象の遊離ＡＩＭ量を測定し、一定期間後（例えば、１、３、６、又は１２か月後、又は３～６か月後など）に再度この対象の遊離ＡＩＭ量を測定し、遊離ＡＩＭ量が基準値以上になれば、ＮＡＦＬからＮＡＳＨへ進行したと判断することができる。逆に、基準値より低ければ、ＮＡＦＬからＮＡＳＨへ進行していないと判断することができる。
（ＮＡＳＨの診断キット）
前述の遊離ＡＩＭ量の測定キットをＮＡＳＨの診断キットとして用いることができる。特に、前述の、（１）～（３）を含むＥＣＬ法による遊離ＡＩＭ分析キット、（１）～（３）を含むサンドイッチＥＬＩＳＡ法による遊離ＡＩＭ分析キット、及び（１）～（３）を含むＬＴＩＡ法による遊離ＡＩＭ分析キットをＮＡＳＨの診断キットとして使用することができる。
前述の遊離ＡＩＭ量の測定キットをＮＡＳＨの診断キットとして用いることができる。特に、前述の、（１）～（３）を含むＥＣＬ法による遊離ＡＩＭ分析キット、（１）～（３）を含むサンドイッチＥＬＩＳＡ法による遊離ＡＩＭ分析キット、及び（１）～（３）を含むＬＴＩＡ法による遊離ＡＩＭ分析キットをＮＡＳＨの診断キットとして使用することができる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、「％」は特に説明のない限り重量％を示す。
〔製造例１：遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体の作製〕
１．マウス抗ヒトＡＩＭモノクローナル抗体の作製
以下の手順により、マウス抗ヒトＡＩＭモノクローナル抗体であるＮｏ．１抗体及びＮｏ．２抗体を得た。
抗原として全長ヒトｒＡＩＭ（１ｍｇ／ｍｌ）を等量のＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄ（Ｇ－１フナコシ）と混合しエマルジョンを作製した。免疫動物にはＢａｌｂ／ｃマウス（チャールズリバー（株）６週齢のメス２匹を用い、後ろ足底部へ抗原溶液１００μＬを投与した。２週間後に同様の投与を行い、更に２週間以上をおいて抗原溶液１００μｇを後ろ足底部へ投与し３日後の細胞融合に備えた。ミエローマ細胞にはマウスＰ３Ｕ１を用いた。
麻酔下にて心臓採血を行ったマウスから、無菌的に膝窩リンパ節を摘出し、＃２００メッシュ付ビーカーにのせ、シリコン棒で押しながら、細胞浮遊液を調製した。細胞はＲＰＭＩ１６４０にて２回の遠心洗浄を行った後、細胞数をカウントした。対数増殖期の状態のミエローマ細胞を遠心により集め、洗浄後、リンパ細胞とミエローマ細胞の比率が５対１となるように調製し、混合遠心を行った。細胞融合はＰＥＧ１５００（７８３６４１ ロシュ）を用いて行った。すなわち、細胞ペレットへ１ｍＬのＰＥＧ液を３分間かけて反応させ、その後段階的に希釈を行い、遠心にて洗浄した後、培地を加え９６ウェルプレート１５枚へ２００μＬずつ入れ、１週間の培養を行った。培地にはミエローマ細胞用培地にＨＡＴサプリメント（２１０６０－０１７ ＧＩＢＣＯ）を加え、ＦＢＳ濃度を１５％にしたものを用いた。
凍結保存された細胞を解凍し、増殖培養を行った後、１週間以上前に０．５ｍｌのプリスタン（４２－００２ コスモバイオ）を腹腔内投与したヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ－ｎｕ／ｎｕ 日本クレア）の腹腔へ、１×１０8個を投与し、およそ２週間後に４～１２ｍｌの腹水を得た。遠心処理にて固形物を除去した後、凍結保存を行った。その後、凍結保存した腹水から抗体を精製し、Ｎｏ．１抗体及びＮｏ．２抗体を得た。
１．マウス抗ヒトＡＩＭモノクローナル抗体の作製
以下の手順により、マウス抗ヒトＡＩＭモノクローナル抗体であるＮｏ．１抗体及びＮｏ．２抗体を得た。
抗原として全長ヒトｒＡＩＭ（１ｍｇ／ｍｌ）を等量のＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄ（Ｇ－１フナコシ）と混合しエマルジョンを作製した。免疫動物にはＢａｌｂ／ｃマウス（チャールズリバー（株）６週齢のメス２匹を用い、後ろ足底部へ抗原溶液１００μＬを投与した。２週間後に同様の投与を行い、更に２週間以上をおいて抗原溶液１００μｇを後ろ足底部へ投与し３日後の細胞融合に備えた。ミエローマ細胞にはマウスＰ３Ｕ１を用いた。
麻酔下にて心臓採血を行ったマウスから、無菌的に膝窩リンパ節を摘出し、＃２００メッシュ付ビーカーにのせ、シリコン棒で押しながら、細胞浮遊液を調製した。細胞はＲＰＭＩ１６４０にて２回の遠心洗浄を行った後、細胞数をカウントした。対数増殖期の状態のミエローマ細胞を遠心により集め、洗浄後、リンパ細胞とミエローマ細胞の比率が５対１となるように調製し、混合遠心を行った。細胞融合はＰＥＧ１５００（７８３６４１ ロシュ）を用いて行った。すなわち、細胞ペレットへ１ｍＬのＰＥＧ液を３分間かけて反応させ、その後段階的に希釈を行い、遠心にて洗浄した後、培地を加え９６ウェルプレート１５枚へ２００μＬずつ入れ、１週間の培養を行った。培地にはミエローマ細胞用培地にＨＡＴサプリメント（２１０６０－０１７ ＧＩＢＣＯ）を加え、ＦＢＳ濃度を１５％にしたものを用いた。
凍結保存された細胞を解凍し、増殖培養を行った後、１週間以上前に０．５ｍｌのプリスタン（４２－００２ コスモバイオ）を腹腔内投与したヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ－ｎｕ／ｎｕ 日本クレア）の腹腔へ、１×１０8個を投与し、およそ２週間後に４～１２ｍｌの腹水を得た。遠心処理にて固形物を除去した後、凍結保存を行った。その後、凍結保存した腹水から抗体を精製し、Ｎｏ．１抗体及びＮｏ．２抗体を得た。
〔実施例１：抗ヒトＩｇＭ抗体添加による非特異反応の防止効果の確認〕
１．ヒト検体のカラムクロマトグラフィーでの分離
ヒト検体10μLをサイズ排除クロマトグラフィー（TSKgel G3000 SWXL，東ソー） にてサイズ分画し、複合体ＡＩＭと遊離ＡＩＭの各フラクションを得た（複合体ＡＩＭ：フラクションＮｏ．６， ７、遊離ＡＩＭ：フラクションＮｏ．１４，１５）。またHPLCはリン酸バッファーを用いて流速１ｍL／分で実施し各フラクションを５００μLずつ分取した。
１．ヒト検体のカラムクロマトグラフィーでの分離
ヒト検体10μLをサイズ排除クロマトグラフィー（TSKgel G3000 SWXL，東ソー） にてサイズ分画し、複合体ＡＩＭと遊離ＡＩＭの各フラクションを得た（複合体ＡＩＭ：フラクションＮｏ．６， ７、遊離ＡＩＭ：フラクションＮｏ．１４，１５）。またHPLCはリン酸バッファーを用いて流速１ｍL／分で実施し各フラクションを５００μLずつ分取した。
２．Ｎｏ．２抗体結合磁気ビーズの作製
１）１５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で透析したＮｏ．２抗体の吸光度を測定し、同緩衝液を用いてＡｂｓ ０．５に調製した。
２）Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ 社製 Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－４５０ Ｅｐｏｘｙ
１ｍＬ（３０ ｍｇ／ｍＬ）を上記緩衝液で３回洗浄し、１）の抗体液を１ｍＬ添加した。２５℃にて回転攪拌を１８時間以上実施した。
３）ビーズブロッキングバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，ｐＨ７．８］でビーズを２回洗浄した。洗浄により緩衝液を取り除くことで溶液中に残存していたビーズ未結合の抗体を除去した。その後ビーズブロッキングバッファーを１ｍＬ加え攪拌し２５℃にて回転攪拌を１８時間以上実施した。
４）ビーズブロッキングバッファーでビーズを２回洗浄後、ビーズブロッキングバッファーを１ｍＬ加え攪拌した。これを抗体結合磁気ビーズとし、使用時まで４℃で保存した。
１）１５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で透析したＮｏ．２抗体の吸光度を測定し、同緩衝液を用いてＡｂｓ ０．５に調製した。
２）Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ 社製 Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－４５０ Ｅｐｏｘｙ
１ｍＬ（３０ ｍｇ／ｍＬ）を上記緩衝液で３回洗浄し、１）の抗体液を１ｍＬ添加した。２５℃にて回転攪拌を１８時間以上実施した。
３）ビーズブロッキングバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，ｐＨ７．８］でビーズを２回洗浄した。洗浄により緩衝液を取り除くことで溶液中に残存していたビーズ未結合の抗体を除去した。その後ビーズブロッキングバッファーを１ｍＬ加え攪拌し２５℃にて回転攪拌を１８時間以上実施した。
４）ビーズブロッキングバッファーでビーズを２回洗浄後、ビーズブロッキングバッファーを１ｍＬ加え攪拌した。これを抗体結合磁気ビーズとし、使用時まで４℃で保存した。
３．ルテニウム標識Ｎｏ．１抗体の作製
１）１５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で透析済みＮｏ．１抗体液３１２．５μＬに１０ｍｇ／ｍＬのルテニウム錯体（ＩＧＥＮ社製 Ｏｒｉｇｉｎ Ｔａｇ－ＮＨＳ ＥＳＴＥＲ）を１４．１μＬ加え、３０分間攪拌した。その後、２Ｍ グリシンを５０μＬ添加し、２０分間攪拌した。
２）直径１ｃｍ、高さ３０ｃｍのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５）にルテニウム錯体標識抗体をアプライし、未標識のルテニウム錯体とルテニウム錯体標識抗体を単離精製した。溶出は、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて行った。
１）１５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で透析済みＮｏ．１抗体液３１２．５μＬに１０ｍｇ／ｍＬのルテニウム錯体（ＩＧＥＮ社製 Ｏｒｉｇｉｎ Ｔａｇ－ＮＨＳ ＥＳＴＥＲ）を１４．１μＬ加え、３０分間攪拌した。その後、２Ｍ グリシンを５０μＬ添加し、２０分間攪拌した。
２）直径１ｃｍ、高さ３０ｃｍのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５）にルテニウム錯体標識抗体をアプライし、未標識のルテニウム錯体とルテニウム錯体標識抗体を単離精製した。溶出は、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて行った。
４．抗ヒトＩｇＭ抗体添加による非特異反応の防止効果の確認
１）複合体ＡＩＭフラクション（No. ６， ７）を１０μＬずつ取り、合計２０μＬ分を２００μＬの反応用溶液［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％ ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，１００μｇ／ｍＬ マウスＩｇＧ，ｐＨ７．８］又は抗IgM抗体含有反応用溶液へ添加した。同様に、遊離ＡＩＭフラクション（Ｎｏ．１４，１５）を１０μＬずつ取り、合計２０μＬ分を２００μＬの反応用溶液又は抗ＩｇＭ抗体含有反応用溶液へ添加した。抗IgM抗体としては、ＨＢＲ－１、ＨＢＲ－３、ＨＢＲ－６、ＨＢＲ－９、ＨＢＲ－２０、ＨＢＲ－２１、ＨＢＲ－２３、又はＨＢＲ－２６を反応用溶液基準でいずれも５０μｇ／ｍＬとなるように調整して用いた。ＨＢＲ－６及びＨＢＲ－２０は抗ＩｇＭモノクローナル抗体である。
２）そこにビーズ希釈液［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％ ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，ｐＨ７．８］で０．５ｍｇ／ｍＬ濃度に希釈したＮｏ．２抗体結合磁気ビーズを２５μＬずつ添加し、３０℃で９分間反応させた（第一反応）。
その後、磁気ビーズを磁石でトラップし、反応管内の液体を抜き取り、洗浄液［５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，０．０１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，ｐＨ７，５］３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。
３）次にルテニウム用希釈溶液［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％ ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，１００μｇ／ｍＬ マウスＩｇＧ，ｐＨ７．８］で０．６μｇ／ｍＬ濃度に希釈したルテニウム標識Ｎｏ．１抗体を２００μＬ加えて３０℃で９分間反応させた（第二反応）。
反応後の磁気ビーズを磁石でトラップし反応管内の液体を抜き取り、洗浄液３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。
４）その後、反応管に３００μＬのトリプロピルアミンを入れ、磁気ビーズと混合した。この状態で電気エネルギーを与えることでルテニウム錯体が発光し、その発光強度を検出機で検出した。
なお、上記反応管への磁気ビーズ添加操作以降は、ルテニウム錯体発光自動測定機であるピコルミＩＩＩ上で実施した。
１）複合体ＡＩＭフラクション（No. ６， ７）を１０μＬずつ取り、合計２０μＬ分を２００μＬの反応用溶液［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％ ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，１００μｇ／ｍＬ マウスＩｇＧ，ｐＨ７．８］又は抗IgM抗体含有反応用溶液へ添加した。同様に、遊離ＡＩＭフラクション（Ｎｏ．１４，１５）を１０μＬずつ取り、合計２０μＬ分を２００μＬの反応用溶液又は抗ＩｇＭ抗体含有反応用溶液へ添加した。抗IgM抗体としては、ＨＢＲ－１、ＨＢＲ－３、ＨＢＲ－６、ＨＢＲ－９、ＨＢＲ－２０、ＨＢＲ－２１、ＨＢＲ－２３、又はＨＢＲ－２６を反応用溶液基準でいずれも５０μｇ／ｍＬとなるように調整して用いた。ＨＢＲ－６及びＨＢＲ－２０は抗ＩｇＭモノクローナル抗体である。
２）そこにビーズ希釈液［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％ ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，ｐＨ７．８］で０．５ｍｇ／ｍＬ濃度に希釈したＮｏ．２抗体結合磁気ビーズを２５μＬずつ添加し、３０℃で９分間反応させた（第一反応）。
その後、磁気ビーズを磁石でトラップし、反応管内の液体を抜き取り、洗浄液［５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，０．０１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，ｐＨ７，５］３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。
３）次にルテニウム用希釈溶液［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％ ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，１００μｇ／ｍＬ マウスＩｇＧ，ｐＨ７．８］で０．６μｇ／ｍＬ濃度に希釈したルテニウム標識Ｎｏ．１抗体を２００μＬ加えて３０℃で９分間反応させた（第二反応）。
反応後の磁気ビーズを磁石でトラップし反応管内の液体を抜き取り、洗浄液３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。
４）その後、反応管に３００μＬのトリプロピルアミンを入れ、磁気ビーズと混合した。この状態で電気エネルギーを与えることでルテニウム錯体が発光し、その発光強度を検出機で検出した。
なお、上記反応管への磁気ビーズ添加操作以降は、ルテニウム錯体発光自動測定機であるピコルミＩＩＩ上で実施した。
５．結果
結果を図１に示す。Ｆ６＋Ｆ７のカウント比率が基準よりも低くなるほど、抗体の複合体ＡＩＭへの非特異的反応が抑制されたと考えられる。また、Ｆ１４＋Ｆ１５のカウント比率が基準よりも低くなるほど、抗体の遊離ＡＩＭへの感度が低下したと考えられる。抗ＩｇＭ抗体を添加した測定系では、添加していない測定系に対して、Ｆ６＋Ｆ７のカウント比率が、94.3%、88.3%、87.6%、92.3%、81.8%、91.2%、91.3%、又は91.0%となった。すなわち、抗ＩｇＭ抗体を添加したいずれの測定系においても、抗体の複合体ＡＩＭへの非特異的反応が抑制された。
結果を図１に示す。Ｆ６＋Ｆ７のカウント比率が基準よりも低くなるほど、抗体の複合体ＡＩＭへの非特異的反応が抑制されたと考えられる。また、Ｆ１４＋Ｆ１５のカウント比率が基準よりも低くなるほど、抗体の遊離ＡＩＭへの感度が低下したと考えられる。抗ＩｇＭ抗体を添加した測定系では、添加していない測定系に対して、Ｆ６＋Ｆ７のカウント比率が、94.3%、88.3%、87.6%、92.3%、81.8%、91.2%、91.3%、又は91.0%となった。すなわち、抗ＩｇＭ抗体を添加したいずれの測定系においても、抗体の複合体ＡＩＭへの非特異的反応が抑制された。
〔実施例２：本発明の測定系における抗ヒトＩｇＭ抗体添加による非特異反応の防止効果の確認〕
本発明の測定系における抗ヒトＩｇＭ抗体添加による非特異反応の防止効果をＥＣＬ法を用いて以下の手順で検証した。
本発明の測定系における抗ヒトＩｇＭ抗体添加による非特異反応の防止効果をＥＣＬ法を用いて以下の手順で検証した。
１．抗体結合磁気ビーズの作製
実施例１と同様の手順で実施した。
実施例１と同様の手順で実施した。
２．ルテニウム標識抗体の作製
実施例１と同様の手順で実施した。
実施例１と同様の手順で実施した。
３．遊離ＡＩＭ特異的抗体による遊離ＡＩＭ量及びＩｇＭ-ＡＩＭ量の測定
１）健常人血清サンプルを実施例１と同様の手順で各フラクションに分離し、ＩｇＭ-ＡＩＭを含むフラクションと遊離ＡＩＭを含むフラクションを反応用溶液［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％ ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，１００μｇ／ｍＬ マウスＩｇＧ，５０μｇ／ｍＬ 抗ヒトＩｇＭ抗体，ｐＨ７．８］を用いて１／１０に希釈し、検体希釈液を作製した。次に、反応管に１００μＬの反応用溶液を入れ、検体希釈液２μＬを添加した。
２）そこにビーズ希釈液［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％ ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，ｐＨ７．８］で０．５ｍｇ／ｍＬ濃度に希釈したＮｏ．２抗体結合磁気ビーズを２５μＬずつ添加し、３０℃で９分間反応させた（第一反応）。
その後、磁気ビーズを磁石でトラップし、反応管内の液体を抜き取り、洗浄液［５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，０．０１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，ｐＨ７，５］３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。
３）次にルテニウム用希釈溶液［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％ ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，１００μｇ／ｍＬ マウスＩｇＧ，ｐＨ７．８］で０．６μｇ／ｍＬ濃度に希釈したルテニウム標識Ｎｏ．１抗体を２００μＬ加えて３０℃で９分間反応させた（第二反応）。
反応後の磁気ビーズを磁石でトラップし反応管内の液体を抜き取り、洗浄液３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。
４）その後、反応管に３００μＬのトリプロピルアミンを入れ、磁気ビーズと混合した。この状態で電気エネルギーを与えることでルテニウム錯体が発光し、その発光強度を検出機で検出した。
なお、上記反応管への磁気ビーズ添加操作以降は、ルテニウム錯体発光自動測定機であるピコルミＩＩＩ上で実施した。
５）健常人血清サンプルを抗ヒトＩｇＭ抗体を含まない反応溶液を用いて１／１０で希釈して作製した検体希釈液について、操作１）～４）を繰り返したものをコントロールとした。
１）健常人血清サンプルを実施例１と同様の手順で各フラクションに分離し、ＩｇＭ-ＡＩＭを含むフラクションと遊離ＡＩＭを含むフラクションを反応用溶液［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％ ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，１００μｇ／ｍＬ マウスＩｇＧ，５０μｇ／ｍＬ 抗ヒトＩｇＭ抗体，ｐＨ７．８］を用いて１／１０に希釈し、検体希釈液を作製した。次に、反応管に１００μＬの反応用溶液を入れ、検体希釈液２μＬを添加した。
２）そこにビーズ希釈液［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％ ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，ｐＨ７．８］で０．５ｍｇ／ｍＬ濃度に希釈したＮｏ．２抗体結合磁気ビーズを２５μＬずつ添加し、３０℃で９分間反応させた（第一反応）。
その後、磁気ビーズを磁石でトラップし、反応管内の液体を抜き取り、洗浄液［５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，０．０１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，ｐＨ７，５］３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。
３）次にルテニウム用希釈溶液［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ ＥＤＴ－４Ｎａ，０．５％ ＢＳＡ，０．０９％ ＮａＮ3，１００μｇ／ｍＬ マウスＩｇＧ，ｐＨ７．８］で０．６μｇ／ｍＬ濃度に希釈したルテニウム標識Ｎｏ．１抗体を２００μＬ加えて３０℃で９分間反応させた（第二反応）。
反応後の磁気ビーズを磁石でトラップし反応管内の液体を抜き取り、洗浄液３５０μＬで２回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した（ＢＦ分離）。
４）その後、反応管に３００μＬのトリプロピルアミンを入れ、磁気ビーズと混合した。この状態で電気エネルギーを与えることでルテニウム錯体が発光し、その発光強度を検出機で検出した。
なお、上記反応管への磁気ビーズ添加操作以降は、ルテニウム錯体発光自動測定機であるピコルミＩＩＩ上で実施した。
５）健常人血清サンプルを抗ヒトＩｇＭ抗体を含まない反応溶液を用いて１／１０で希釈して作製した検体希釈液について、操作１）～４）を繰り返したものをコントロールとした。
図２に、ＩｇＭ－ＡＩＭ検出量及び遊離ＡＩＭ検出量の合計量に対するＩｇＭ－ＡＩＭ検出量のパーセンテージ又は遊離ＡＩＭ検出量のパーセンテージを示す。実施例２の測定系は、遊離ＡＩＭに特異的なモノクローナル抗体であるNO．２抗体を用いた測定系であることから、ＩｇＭ－ＡＩＭ量及び遊離ＡＩＭ量の合計に対するＩｇＭ－ＡＩＭ量のパーセンテージが少ないほど、ＩｇＭ－ＡＩＭに由来する非特異反応が少ないと考えられる。すなわち、検出されたＩｇＭ－ＡＩＭの量は、NO．２抗体に対するＩｇＭ－ＡＩＭ由来の非特異反応の程度を表すと考えられる。
抗ヒトＩｇＭ抗体を添加した測定系では、ＩｇＭ－ＡＩＭ量及び遊離ＡＩＭ量の合計量に対するＩｇＭ－ＡＩＭ量が２．４％となり、抗ヒトＩｇＭ抗体を添加しなかった測定系では、ＩｇＭ－ＡＩＭ量及び遊離ＡＩＭ量の合計量に対するＩｇＭ－ＡＩＭ量が７．５％となった。したがって、抗ヒトＩｇＭ抗体を添加することにより、遊離ＡＩＭに特異的に結合する抗体のＩｇＭ-ＡＩＭに由来する非特異反応を抑制できることが分かった。
抗ヒトＩｇＭ抗体を添加した測定系では、ＩｇＭ－ＡＩＭ量及び遊離ＡＩＭ量の合計量に対するＩｇＭ－ＡＩＭ量が２．４％となり、抗ヒトＩｇＭ抗体を添加しなかった測定系では、ＩｇＭ－ＡＩＭ量及び遊離ＡＩＭ量の合計量に対するＩｇＭ－ＡＩＭ量が７．５％となった。したがって、抗ヒトＩｇＭ抗体を添加することにより、遊離ＡＩＭに特異的に結合する抗体のＩｇＭ-ＡＩＭに由来する非特異反応を抑制できることが分かった。
〔実施例３：本発明の測定系と既存の測定系との比較〕
本発明の測定系と既存の測定系とで、ＩｇＭ－ＡＩＭ量に由来する非特異反応の程度を比較した。
（３－１）本発明の測定系
実施例２のＥＣＬ法と同様の手順を用いて、ＩｇＭ-ＡＩＭを含むフラクションと遊離ＡＩＭを含むフラクションの各々に関して、遊離ＡＩＭ量及びＩｇＭ-ＡＩＭ量の測定を行った。
（３－２）既存の測定系
Ｈｕｍａｎ ＡＩＭ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＣＹ－８０８０，ＣｉｒｃｕＬｅｘ社）を用いて、ＩｇＭ-ＡＩＭを含むフラクションと遊離ＡＩＭを含むフラクションの各々に関して、遊離ＡＩＭ量及びＩｇＭ-ＡＩＭ量の測定を行った。プロトコルは、Ｈｕｍａｎ ＡＩＭ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔの添付文書に従った。結果を図３に示す。
本発明の測定系と既存の測定系とで、ＩｇＭ－ＡＩＭ量に由来する非特異反応の程度を比較した。
（３－１）本発明の測定系
実施例２のＥＣＬ法と同様の手順を用いて、ＩｇＭ-ＡＩＭを含むフラクションと遊離ＡＩＭを含むフラクションの各々に関して、遊離ＡＩＭ量及びＩｇＭ-ＡＩＭ量の測定を行った。
（３－２）既存の測定系
Ｈｕｍａｎ ＡＩＭ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＣＹ－８０８０，ＣｉｒｃｕＬｅｘ社）を用いて、ＩｇＭ-ＡＩＭを含むフラクションと遊離ＡＩＭを含むフラクションの各々に関して、遊離ＡＩＭ量及びＩｇＭ-ＡＩＭ量の測定を行った。プロトコルは、Ｈｕｍａｎ ＡＩＭ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔの添付文書に従った。結果を図３に示す。
本発明の測定系では、ＩｇＭ－ＡＩＭ量及び遊離ＡＩＭ量の合計量に対するＩｇＭ－ＡＩＭ量が２．５％となり、既存の測定系では、ＩｇＭ－ＡＩＭ量及び遊離ＡＩＭ量の合計量に対するＩｇＭ－ＡＩＭ量が１９．７％となった。したがって、本発明の測定系は、既存の測定系と比較して非特異反応が顕著に少ないことが示された。
〔実施例４：本発明の測定系又は既存測定系によるＮＡＳＨの検出〕
（４－１）本発明の測定系
実施例２のＥＣＬ法と同様の手順を用いて、ＮＡＦＬ患者血清４２検体、ＮＡＳＨ患者血清１４１検体、及びＮＡＳＨ－ＨＣＣ患者血清２６検体において遊離ＡＩＭ量を測定し、各患者間で有意差が生じるか否かについて検討した。
（４－２）既存の測定系
Ｈｕｍａｎ ＡＩＭ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＣＹ－８０８０，ＣｉｒｃｕＬｅｘ社）を用いて、ＮＡＦＬ患者血清４２検体、ＮＡＳＨ患者血清１４１検体、及びＮＡＳＨ－ＨＣＣ患者血清２６検体において遊離ＡＩＭ量を測定し、各患者間で有意差が生じるか否かについて検討した。プロトコルは、Ｈｕｍａｎ ＡＩＭ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔの添付文書に従った。結果を図４に示す。
（４－１）本発明の測定系
実施例２のＥＣＬ法と同様の手順を用いて、ＮＡＦＬ患者血清４２検体、ＮＡＳＨ患者血清１４１検体、及びＮＡＳＨ－ＨＣＣ患者血清２６検体において遊離ＡＩＭ量を測定し、各患者間で有意差が生じるか否かについて検討した。
（４－２）既存の測定系
Ｈｕｍａｎ ＡＩＭ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＣＹ－８０８０，ＣｉｒｃｕＬｅｘ社）を用いて、ＮＡＦＬ患者血清４２検体、ＮＡＳＨ患者血清１４１検体、及びＮＡＳＨ－ＨＣＣ患者血清２６検体において遊離ＡＩＭ量を測定し、各患者間で有意差が生じるか否かについて検討した。プロトコルは、Ｈｕｍａｎ ＡＩＭ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔの添付文書に従った。結果を図４に示す。
本発明の測定系において、ＮＡＳＨ患者血清における遊離ＡＩＭ量は、ＮＡＦＬ患者血清における遊離ＡＩＭ量よりも有意に多くなった。既存の測定系では、ＮＡＳＨ患者血清における遊離ＡＩＭ量は、ＮＡＦＬ患者血清における遊離ＡＩＭ量と同程度であり、両者に有意差は見られなかった。本発明の測定系においては、抗ＩｇＭ抗体を測定系に添加することにより遊離ＡＩＭ特異的抗体に対するＩｇＭ-ＡＩＭの非特異反応を抑制することができ、ＮＡＳＨ患者血清における遊離ＡＩＭ量とＮＡＦＬ患者血清における遊離ＡＩＭ量との間で有意差を生じたと考えられる。
本発明によれば、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料の免疫学的分析において、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体の遊離ＡＩＭに対する特異性をさらに向上させることができる。本発明によれば、患者及び医療従事者に負担をかけず、ＮＡＳＨの診断を行うことができる。
Claims (16)
- 抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを接触させることを含む、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法。
- 前記生物学的試料が、体液試料である、請求項１に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法。
- 前記遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法。
- 抗ＩｇＭ抗体と、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体と、を含む、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット。
- 前記生物学的試料が、体液試料である、請求項４に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット。
- 遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体が、モノクローナル抗体である、請求項４又は５に記載の生物学的試料中の遊離ＡＩＭ分析キット。
- 抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを接触させることを含む、複合体ＡＩＭ及び遊離ＡＩＭを含む生物学的試料中の遊離ＡＩＭの免疫学的分析における非特異反応抑制方法。
- 前記生物学的試料が、体液試料である、請求項７に記載の非特異反応抑制方法。
- 前記非特異反応が、生物学的試料中のＩｇＭに由来する非特異反応である、請求項７又は８に記載の非特異反応抑制方法。
- 抗ＩｇＭ抗体の存在下で、生物学的試料と遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体とを接触させることと
シグナルを検出することにより、生物学的試料中の遊離ＡＩＭ量を測定することと
測定した遊離ＡＩＭ量を基準値と比較することと
を含む、ＮＡＳＨの検出方法。 - 前記生物学的試料が、体液試料である、請求項１０に記載のＮＡＳＨの検出方法。
- 前記遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１０又は１１に記載のＮＡＳＨの検出方法。
- ＮＡＦＬとＮＡＳＨとを判別する、請求項１０～１２のいずれかに記載のＮＡＳＨの検出方法。
- 抗ＩｇＭ抗体と、遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体と、を含む、ＮＡＳＨの診断キット。
- 体液試料中の遊離ＡＩＭ濃度を測定する、請求項１４に記載のＮＡＳＨの診断キット。
- 遊離ＡＩＭに特異的に反応する抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１４又は１５に記載のＮＡＳＨの診断キット。
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