JP6666916B2

JP6666916B2 - 腎疾患の検査方法

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Publication number: JP6666916B2
Application number: JP2017532411A
Authority: JP
Inventors: 宮崎　徹; 徹宮崎
Original assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 2015-08-06
Filing date: 2016-06-01
Publication date: 2020-03-18
Anticipated expiration: 2036-06-01
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Description

本発明は、典型的には、腎疾患の検査方法または診断の補助方法に関する。具体的に、本発明は、被験体の生体試料中のｆｒｅｅＡＩＭを検出することを含む、腎疾患の検査方法または診断の補助方法に関する。本発明はさらに、腎疾患の検査または診断補助用キットに関する。

ＡＩＭ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍａｃｒｏｐｈａｇｅ；ＣＤ５Ｌ、ａｐｉ６、Ｓｐαとも称する）は、組織マクロファージが特異的に産生する分子量約５０ｋＤａの分泌型タンパク質である（非特許文献１）。ＡＩＭは、システイン残基を多く含む特異的な配列であるｓｃａｖｅｎｇｅｒｒｅｃｅｐｔｏｒｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ（ＳＲＣＲ）ドメインをタンデムに３つつなげた構造をしており、それぞれのシステイン残基は各ドメイン内で互いにジスルフィド結合することで、コンパクトな球状の立体構造をしていると考えられている。

ＡＩＭは、粘着性のあるタンパク質であり、その結合パートナーとして様々な分子が報告されている。例えば、ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃａｃｉｄ（ＬＴＡ）やｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）などの細菌・菌類の病原体関連分子パターン（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｐａｔｔｅｒｎｓ：ＰＡＭＰｓ）を認識し、細菌を凝集させる能力を持つことが知られている（非特許文献２）。また、体内にはＡＩＭをその表面に結合する、あるいは細胞内に取り込む細胞も多く存在し、産生細胞であるマクロファージ自身への取り込みのほか、脂肪細胞ではスカベンジャー受容体ＣＤ３６を介してエンドサイト―シスにより取り込まれ、脂肪分解を誘導することが報告されている（非特許文献３）。

また、古くから、血液では、ＡＩＭがＩｇＭに結合することが知られている（非特許文献４）。近年では、ＡＩＭは、尿中へ排出されずに血液中で安定的に存在するために、ＩｇＭとの結合が深く関与していること、ほとんどすべてのＡＩＭは血液中ではＩｇＭに結合しており、単量体で存在することがほとんどないことが報告されている（非特許文献５、６）。

現在までに、ＡＩＭと腎疾患との関連についていくつかの報告が存在する。例えば、特許文献１には、被検者から採取した試料中のＡＩＭ濃度を測定することを含む、ＡＩＭ関連疾患の診断または検査方法が開示されており、前記関連疾患として、腎疾患が挙げられている。

非特許文献７には、ＳＨＲｓｐラットの腎組織中のマクロファージにおけるＡＩＭ発現と、マクロファージ浸潤数との相関が記載され、ＡＩＭの発現が腎硬化症の進行に重要であることが示唆されている。

非特許文献８には、血中ＡＩＭの不足が、腎障害イベントから慢性腎不全に進行するリスクを著しく高めることが記載されている。

非特許文献９には、腎障害の発症・進展過程におけるＡＩＭの役割を検討する過程で、片側尿管結紮モデルや腎虚血再灌流モデルにおいて、ＡＩＭ欠損マウスでは、野生型マウスと比較して、尿細管壊死を伴う腎組織障害が著しく亢進することが記載されている。

しかし、現在までに、他の結合パートナーと結合していない遊離の形態で存在するＡＩＭと腎疾患との関係については、報告されていない。

国際公開公報ＷＯ２０１１／１４５７２５Ａ１

Ｍｉｙａｚａｋｉ，ＪＥｘｐＭｅｄ１８９：４１３−４２２，１９９９ＳａｒｒｉａｓＭＲｅｔａｌ：ＡｒｏｌｅｆｏｒｈｕｍａｎＳｐａｌｐｈａａｓａｐａｔｔｅｒｎｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２８０：３５３９１−３５３９８，２００５ＫｕｒｏｋａｗａＪ．ｅｔａｌ：Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄＡＩＭｉｓｅｎｄｏｃｙｔｏｓｅｄｉｎｔｏａｄｉｐｏｃｙｔｅｓａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｓｌｉｐｉｄＤｒｏｐｌｅｔｓｖｉａｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｓｙｎｔｈａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＣｅｌｌＭｅｔａｂ１１：４７９−４９２，２０１０ＴｉｓｓｏｔＪＤｅｔａｌ：ＩｇＭａｒｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｔｏＳｐａｌｐｈａ（ＣＤ５ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｉｋｅ）．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ２３：１２０３−１２０６，２００２．宮崎ら,「マクロファージ由来タンパク質ＡＩＭの最新知見−その多様な機能と生活習慣病との関連性−」日本臨牀７１巻９号（２０１３−９）、１６８１頁−１６８９頁Ｍｉｙａｚａｋｉｅｔａｌ．，Ｏｂｅｓｉｔｙ−ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＡｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＲｅｑｕｉｒｅｓＡＩＭｔｏＲｅｔａｉｎｔｈｅＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＭＩｍｍｕｎｅＣｏｍｐｌｅｘｏｎＦｏｌｌｉｃｕｌａｒＤｅｎｄｒｉｔｉｃＣｅｌｌｓ，ＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ３，１１８７−１１９８，Ａｐｒｉｌ２５，２０１３ＩｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆＡｐｏｐｔｏｓｉｓＩｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆＭａｃｒｏｐｈａｇｅｓｉｎａＲａｔＨｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎＭｏｄｅｌｗｉｔｈＮｅｐｈｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＰｏｓｓｉｂｌｅＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＡｃｔｉｏｎｏｆＯｌｍｅｓａｒｔａｎａｎｄＡｚｅｌｎｉｄｉｐｉｎｅ：Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３６（８）１２７１−１２７７（２０１３）１２７１２０１４年日本獣医臨床病理学会学術大会抄録集２０１４年日本腎臓学会誌５６巻３号３２１頁

本発明の課題は、感度および特異性に優れた腎疾患の検出方法または腎疾患の診断の補助方法、およびこれらの方法に使用可能なキットを提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねたところ、腎疾患の被験体の生体試料において、ｆｒｅｅＡＩＭが顕著に増加していることを見出した。血液では、本来ｆｒｅｅＡＩＭはほとんど確認することができないと考えられていたため、とりわけ、腎疾患の被験体の血液でｆｒｅｅＡＩＭの顕著な増加が確認されたことは驚きである。

本願発明は上記知見に基づくものであり、以下の特徴を包含するものである。

すなわち、本発明は、一実施態様において、被験体に由来する生体試料中のｆｒｅｅＡＩＭを検出または定量する工程を含む、腎疾患の検査方法に関する。本発明は、別の態様において、被験体に由来する生体試料中のｆｒｅｅＡＩＭを検出または定量する工程を含む、腎疾患の診断を補助する方法であることができる。本発明は、さらに別の態様において、腎疾患を検査するために、被験体に由来する生体試料中のｆｒｅｅＡＩＭを検出または定量する方法であることができる。

本発明の方法において、前記生体試料は、体液とすることができる。また、本発明の方法の一実施態様において、前記体液は、血清、血漿、全血および尿からなる群から選択されるものとすることができる。

本発明の方法は、一実施態様において、前記検出または定量が、イムノアッセイによるものであることを特徴とする。例えば、本発明の方法において、前記検出または定量は、生体試料とｆｒｅｅＡＩＭに結合する抗体とを接触させることにより行うものとすることができる。本発明の方法の一実施態様において、前記ｆｒｅｅＡＩＭに結合する抗体は、ｆｒｅｅＡＩＭに特異的に結合する抗体である。また、本発明の一実施態様において、前記検出または定量は、ＥＬＩＳＡによる測定であることができる。

本発明の方法は、一実施態様において、前記検出または定量は、血清、血漿または全血から選択される血液試料をタンパク質変性条件に曝露することなく、かつ、還元条件に曝露することなく行うことを特徴とする。

本発明はまた、ｆｒｅｅＡＩＭに結合する抗体を含む、腎疾患の検査または診断補助用キットに関する。本発明のキットの一実施態様において、前記ｆｒｅｅＡＩＭに結合する抗体は、ｆｒｅｅＡＩＭに特異的に結合する抗体である。

本発明において、前記腎疾患は、急性腎障害又は慢性腎臓病であることができる。一実施態様において、前記慢性腎臓病は、慢性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、ＩｇＡ腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症又はＩｇＭ腎症であることができる。

本発明によれば、感度および特異性に優れた腎疾患の検出方法または腎疾患の診断の補助方法、およびこれらの方法に使用可能なキットを提供される。

図１は、健常人および急性腎障害（ＡＫＩ）患者の血清において、抗ＡＩＭ抗体を用いて、ｆｒｅｅＡＩＭおよびＩｇＭ結合のＡＩＭを検出した結果を示す電気泳動図である。図２は、それぞれ、健常人５例、ＡＫＩ患者（Ａｃｕｔｅ）５例、ＡＫＩから回復した患者（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）５例の尿中のｆｒｅｅＡＩＭ濃度を、ヒトＡＩＭモノクローナル抗体を用いて検出した、ＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。図３は、慢性腎障害（ＣＫＤ）患者の血清において、抗ＡＩＭ抗体を用いて、ｆｒｅｅＡＩＭおよびＩｇＭ結合のＡＩＭを検出した結果を示す電気泳動図である。図４は、健常人および慢性腎障害（ＣＫＤ）患者の血清において、ＨｕｍａｎＡＩＭＥＬＩＳＡｋｉｔ（ＣＹ−８０８０；ＣｉｒｃｕＬｅｘ社）を用いて、ｆｒｅｅＡＩＭを検出した結果を示す。

以下、本発明の実施の形態を具体的に説明する。

本発明に係る腎疾患の検査方法は、被験体に由来する生体試料中のｆｒｅｅＡＩＭを検出または定量する工程を含むものである。ＡＩＭは、上記のとおり、組織マクロファージが特異的に産生する分子量約５０ｋＤａの分泌型タンパク質であり、ヒトおよびヒト以外の多くの哺乳類や鳥類において発現していることが知られている。また、ＡＩＭは、血液においては、尿中へ排出されずに安定的に存在するために、その大部分がＩｇＭと複合体を形成し、単量体で存在することがほとんどないことが知られている（非特許文献５、６）。さらに、血液中のＡＩＭが不足することが、慢性腎不全への進行のリスクと関連することも報告されている（非特許文献８）。一方、これらの知見にも関わらず、今回、急性腎障害および慢性腎臓病の被験体において、血液試料を含む生体試料中のｆｒｅｅＡＩＭが顕著に増加することが見出された。したがって、被験体に由来する生体試料中のｆｒｅｅＡＩＭを検出または定量することによって、当該被験体における腎疾患を良好な検出感度および特異性で検出することができる。本明細書中、「ｆｒｅｅＡＩＭ」とは、生体試料において、ＡＩＭの他の結合パートナー、特にＩｇＭ、と複合体を形成していない、単量体のＡＩＭをいう。

別の態様では、本発明は、被験体に由来する生体試料中のｆｒｅｅＡＩＭを検出または定量する工程を含む、腎疾患の診断を補助する方法に関する。

本明細書において、「腎疾患の検査」または「腎疾患の診断の補助」とは、診断に必要な情報を得るために、被験体から採取した試料を調べることを意味する。したがって、本発明の方法は、例えば検査会社等で実施され得る。

さらに別の態様では、本発明は、腎疾患を検査するために、被験体に由来する生体試料中のｆｒｅｅＡＩＭを検出または定量する方法に関する。

本発明において、被験体は、特に制限されないが、例えば、腎疾患を発症するおそれがあるか、または発症していることが疑われる被験体が挙げられる。被験体には、また、腎疾患を既に発症している被験体も含まれ、その場合には、かかる被験体の予後を判定する目的で、または特定の腎疾患治療の効果を判定する目的で、本発明を実施することができる。被験体は、典型的にはヒトを指すが、例えば他の霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどを含む他の動物も含み得る。

本発明において、腎疾患には、急性腎障害および慢性腎臓病の両方が含まれる。慢性腎臓病としては、これに限定されるものではないが、例えば、慢性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、ＩｇＡ腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症、およびＩｇＭ腎症などが挙げられる。

本発明において、被験体に由来する生体試料は、被験体から採取可能なものである限り特に限定されず、例えば組織または体液とすることができる。組織としては、非限定的に、卵巣、子宮、乳房、甲状腺、脳、食道、舌、肺、膵臓、胃、小腸、十二指腸、大腸、膀胱、腎臓、肝臓、前立腺、胆嚢、咽頭、筋肉、骨および皮膚などが挙げられるがこれらに限定されない。体液としては、非限定的に、血清、血漿または全血などの血液、リンパ液、組織液、体腔液、消化液、鼻水、尿などが挙げられるがこれらに限定されない。取得および処理の簡便さから、生体試料として血液または尿を用いることが好ましい。また、前記体液は、被験体から採取した体液そのものであっても、採取した体液に通常行われる希釈、濃縮等の処理を行ったものであってもよい。なお、本発明に用いる被験体に由来する生体試料の採取や調製を行なう者は、本発明の工程を行う者と同一人物でもよく、別人物であってもよい。また、本発明に用いる被験体に由来する生体試料は、本発明の実施時に採取または調製されたものでもよく、予め採取または調製され保存されたものであってよい。

ｆｒｅｅＡＩＭの検出または定量方法は、ｆｒｅｅＡＩＭと、他の結合パートナー（例えばＩｇＭ等）と複合体を形成したＡＩＭ（以下、複合体ＡＩＭとも称する）とを区別して検出できる方法であれば特に制限はなく、通常用いられるタンパク質検出方法を適用することができる。また、そのようなタンパク質検出方法は、ｆｒｅｅＡＩＭを定量または半定量的に測定できる方法であることが好ましい。そのような方法として、これに限定されるものではないが、ｆｒｅｅＡＩＭに結合する抗体を用いる方法、イオン交換クロマトグラフィー、質量分析等を挙げることができる。

本発明において、ｆｒｅｅＡＩＭの検出に用いる装置には特に制限はなく、ｆｒｅｅＡＩＭの検出または測定の方法に応じて適宜選択することができる。具体的には例えば、ＨＰＬＣ機器、質量分析機器（マススペクトロメトリー）、電気泳動機器（キャピラリー電気泳動装置等）、全自動あるいは半自動酵素免疫測定機器、セルウォッシャー、全自動あるいは半自動化学発光免疫測定機器、発光測定装置、全自動あるいは半自動電気化学発光免疫測定機器、光学測定装置、プレートリーダー、ＣＣＤカメラ、全自動あるいは半自動蛍光免疫測定機器、蛍光測定装置、全自動あるいは半自動放射免疫測定機器、液体シンチレーションカウンター、クールターカウンター、表面プラズモン測定装置、ブロッティング装置、デンシトメーター等を挙げることができる。

本発明においては、検出感度、特異性および簡便性の観点から、ｆｒｅｅＡＩＭに結合する抗体（本明細書中、「抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体」とも称する）を用いる方法、例えばｆｒｅｅＡＩＭに結合する抗体を用いるイムノアッセイを使用することが好ましい。抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体は、ＡＩＭを認識して結合可能な抗体であれば特に制限されない。

抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれも公知の方法に従って作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、ｆｒｅｅＡＩＭ又はｆｒｅｅＡＩＭフラグメントで免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、ｆｒｅｅＡＩＭ又はｆｒｅｅＡＩＭフラグメントで免疫した動物の血清から得ることができる。
ｆｒｅｅＡＩＭフラグメントは、ｆｒｅｅＡＩＭの部分ペプチドであり、抗ｆｒｅｅＡＩＭフラグメント抗体は、ｆｒｅｅＡＩＭを認識する。また、免疫原としては、例えば、ヒトやサルなどの霊長類、ラットやマウスなどのげっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどのｆｒｅｅＡＩＭまたはｆｒｅｅＡＩＭフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。

なお、本明細書において「抗体」とは、天然に存在するか、遺伝子組換え技術によって産生される、全長の免疫グロブリン分子、または抗体フラグメントのような免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片をいう。特に断りがない限り、本発明の抗体はいずれのタイプ、クラス、サブクラスも含み、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１およびＩｇＡ_２などが含まれる。これらの抗体は、慣用技術を用いて作製することができ、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。抗体フラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどが挙げられる。抗体フラグメントは、例えば、これをコードする核酸を用いて遺伝子組み換え技術によって作製することもできるし、全長の抗体を酵素で切断して作製することもできる。本発明において、抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。

本発明において、抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体の例として、例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されたＡＩＭ−ＣＬ−６（受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−１０９２）およびＡＩＭ−ＣＬ−７（受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−１０９３）を挙げることができる。

本発明において使用する抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体は、ｆｒｅｅＡＩＭに特異的に結合する抗体であることが好ましい。「特異的な結合」とは、非特異的な相互作用とは測定して異なる結合を指し、本発明においてはさらに、ＩｇＭと複合体を形成したＡＩＭよりも、ｆｒｅｅＡＩＭに対して高い結合親和性を有する抗体を指す。本発明の一態様において、「特異的な結合」は、例えばｆｒｅｅＡＩＭに対して少なくとも約１０^−４Ｍ、または少なくとも約１０^−５Ｍ、または少なくとも約１０^−６Ｍ、または少なくとも約１０^−７Ｍ、または少なくとも約１０^−８Ｍ、または少なくとも約１０^−９Ｍ、または少なくとも約１０^−１０Ｍ、または少なくとも約１０^−１１Ｍ、または少なくとも約１０^−１２Ｍ、またはそれ以上のＫｄを持つ抗体によって示されうる。別の態様では、「特異的な結合」は、ＩｇＭと複合体を形成したＡＩＭを含む、ｆｒｅｅＡＩＭとは異なる他のポリペプチドに実質的に結合することなく、ｆｒｅｅＡＩＭに結合することを意味する。

本発明におけるイムノアッセイとしては、当業者に一般的に使用される方法を用いることができるが、ｆｒｅｅＡＩＭと、複合体ＡＩＭとが、区別して検出または定量される方法または条件を選択するべきである。例えば、本発明の方法において、尿以外の生体試料、例えば血清、血漿または全血から選択される血液試料を用いる場合には、抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体を用いた検出または定量に際して、ｆｒｅｅＡＩＭと、複合体ＡＩＭとが区別して検出されるように、必要に応じて、分子量に基づく生体試料の分画を行うことが好ましい。また、複合体ＡＩＭからｆｒｅｅＡＩＭを分離した後に、抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体を用いて検出または定量を行うことも好ましい。また、本発明の方法において、ＩｇＭと結合して複合体を形成したＡＩＭの結合状態が解消されるようなタンパク質変性条件または還元条件に前記生体試料を曝露しないことに留意すべきである。そのようなタンパク質変性条件または還元条件は、タンパク質の四次構造が破壊される方法または条件として当業者に周知である。

イムノアッセイは、検出可能に標識した抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体、又は、検出可能に標識した抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体に対する抗体（二次抗体）を用いる。抗体の標識法により、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）等に分類され、これらのいずれも本発明の方法に用いることができる。

ＥＬＩＳＡ法では、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、ＲＩＡ法では、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、^３Ｈ等の放射性物質、ＦＰＩＡ法では、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリスリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ＣＬＩＡ法では、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質で標識した抗体が用いられる。その他、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子で標識した抗体を検出することもできる。

また、イムノアッセイでは、抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体をビオチンで標識し、酵素等で標識したアビジンまたはストレプトアビジンを結合させて、ｆｒｅｅＡＩＭを検出、測定することもできる。

イムノアッセイの中でも、酵素標識を用いるＥＬＩＳＡ法は、簡便且つ迅速に標的を測定することができて好ましい。

ＥＬＩＳＡ法では、例えばサンドイッチ法を用いることができる。固相担体に抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体を固定し、適宜処理した生体試料を添加して反応させた後、さらに酵素で標識した別のエピトープを認識する抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体を添加して反応させる。
洗浄後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定することにより、ｆｒｅｅＡＩＭ濃度を求めることができる。また、固相担体に固定した抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体と生体試料中のｆｒｅｅＡＩＭを反応させた後、非標識ｆｒｅｅＡＩＭ抗体（一次抗体）を添加し、この非標識抗体に対する抗体（二次抗体）を酵素標識してさらに添加してもよい。

酵素基質は、酵素がペルオキシダーゼの場合、３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）、３，３’５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）等を用いることができ、アルカリホスファターゼの場合、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮＰＰ）等を用いることができる。

また、上記イムノアッセイの中で、微量のタンパク質を簡便に検出できる方法として凝集法も好ましい。凝集法としては、例えば、ラテックス粒子に抗体を結合させたラテックス凝集法が挙げられる。

ラテックス粒子に抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体を結合させて生体試料に混合すると、ｆｒｅｅＡＩＭが存在すれば、抗体結合ラテックス粒子が凝集する。そこで、試料に近赤外光を照射して、吸光度の測定（比濁法）又は散乱光の測定（比朧法）により凝集塊を定量し、抗原の濃度を求めることができる。

本発明において、ｆｒｅｅＡＩＭの検出または定量は、ｆｒｅｅＡＩＭを特異的に検出可能なキットを用いることができる。当該キットとしては、例えば、市販のキットを挙げることができ、当該キットの製品説明書に従って用いることにより、行うこともできる。そのようなキットとして、これに限定されるものではないが、ＨｕｍａｎＡＩＭＥＬＩＳＡｋｉｔ（ＣＹ−８０８０；Ｃｉｒｃｕｌｅｘ社）などを挙げることができる。

本発明の方法は、前記被験体由来の生体試料中のｆｒｅｅＡＩＭの量に基づいて、腎疾患であると判定する工程をさらに含むことができる。本発明におけるｆｒｅｅＡＩＭの量としては、前記被験体由来の生体試料中に含まれる前記ｆｒｅｅＡＩＭの濃度又はそれに対応する定量値又は半定量値であれば特に制限されない。例えば、本発明におけるｆｒｅｅＡＩＭの量としては、前記ｆｒｅｅＡＩＭの検出量を直接的に測定した測定値、前記ｆｒｅｅＡＩＭの検出量を標識の検出を介して間接的に測定した測定値等を挙げることができる。

本発明の方法における判定工程では、被験体由来の生体試料中のｆｒｅｅＡＩＭの量を、例えば対照となる健常人の生体試料中のｆｒｅｅＡＩＭの量を基準値として比較して、前記被験体由来の生体試料中のｆｒｅｅＡＩＭの量が大きい場合に、腎疾患であると判定することができる。

対照となる健常人は、腎疾患を発症していないことが予め判明している個体を意味する。また、ｆｒｅｅＡＩＭの量が大きいとは、健常人と腎疾患患者とを区別するために設定された基準値（カットオフ値）よりも、被験体に由来するｆｒｅｅＡＩＭの量のほうが大きいことをいう。

前記基準値は、例えば、腎疾患患者の生体試料におけるｆｒｅｅＡＩＭの量と、対照となる健常体群の生体試料におけるｆｒｅｅＡＩＭの量とをＲＯＣ解析等に付することよって設定することができる。ＲＯＣ解析は、例えば、疾病の検査方法の検出能、診断能を評価可能な解析方法であって、日本臨床検査自動化学会会誌「臨床検査の診断的有用性評価マニュアル」Ｖｅｒ．１．３（２００４．９．１）、Ｖｏｌ．２９Ｓｕｐｐｌ．１（通巻第１５４号）（２００４年９月１日発行）に記載された解析方法である。
また、基準値は、例えば、健常人の検出レベルの平均値に、標準偏差を２倍あるいは３倍した値を加算した値として定めることもでき、更に、感度（検出率）・特異性（偽陽性率の低さ）をバランスよく満たす値に適宜定めることができる。

別の態様において、本発明は、腎疾患の検査または診断補助用キットに関する。本発明に係るキットは、本発明の一態様において、上述した本発明に係る腎疾患の検査方法を行うためのキットであり、抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体を含む。本発明のキットの一実施形態において、抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体は、ｆｒｅｅＡＩＭに特異的に結合する抗体である。

当該検査または診断補助用キットは、ｆｒｅｅＡＩＭと、抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体との抗原抗体反応を利用するイムノアッセイによって、生体試料中のｆｒｅｅＡＩＭ濃度を測定するために必要な試薬および装置を含む。

本発明のキットは、一態様において、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によってｆｒｅｅＡＩＭ濃度を測定するためのものであり、マイクロタイタープレート；捕獲用の抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体；アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼで標識した抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体；および、アルカリホスファターゼ基質（ＮＰＰ等）又はペルオキシダーゼの基質（ＤＡＢ、ＴＭＢ、マイクロタイタープレートＯＰＤ等）、を含む。
捕獲抗体と標識抗体は、異なるエピトープを認識する。
このようなキットの場合、まず、マイクロタイタープレートに捕獲抗体を固定し、ここに適宜処理し希釈した生体試料を添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。次に、標識抗体を添加した後インキュベートし、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、ｆｒｅｅＡＩＭ濃度を求めることができる。

本発明のキットは、別の態様において、二次抗体を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりｆｒｅｅＡＩＭ濃度を測定するためのものであり、マイクロタイタープレート；捕捉用の抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体；一次抗体として、抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体；二次抗体として、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼで標識した、抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体に対する抗体；および、アルカリホスファターゼ（ＮＰＰ等）又はペルオキシダーゼの基質（ＤＡＢ、ＴＭＢ、ＯＰＤ等）、を含む。
捕獲抗体と一次抗体は、異なるエピトープを認識する。
このようなキットでは、まず、マイクロタイタープレートに捕獲抗体を固定し、ここに適宜処理し希釈した生体試料を添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。続いて、一次抗体を添加してインキュベートおよび洗浄を行い、さらに酵素標識した二次抗体を添加してインキュベートを行った後、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、ｆｒｅｅＡＩＭ濃度を求めることができる。二次抗体を用いることにより、反応が増幅され検出感度を高めることができる。

本発明のキットは、さらに、必要な緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレート等を含むことも好ましい。

標識抗体は、酵素標識した抗体に限定されず、放射性物質（^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、^３Ｈ等）、蛍光物質（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリスリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等）、発光物質（ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等）、ナノ粒子（金コロイド、量子ドット）等で標識した抗体であってもよい。また標識抗体としてビオチン化抗体を用い、キットに標識したアビジン又はストレプトアビジンを加えることもできる。

本発明の診断用キットのさらに別の態様として、ラテックス凝集法によってｆｒｅｅＡＩＭ濃度を測定するためのものも挙げられる。このキットは、抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体感作ラテックスを含み、生体試料と抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体とを混合し、光学的方法で集塊を定量する。キットに凝集反応を可視化する凝集反応板が含まれていることも好ましい。
本発明の診断用キットのさらに別の態様として、電気化学発光法によってｆｒｅｅＡＩＭ濃度を測定するためのものも挙げられる。このキットは、抗ｆｒｅｅＡＩＭ抗体を担持する担体を含み、適宜処理し希釈した生体試料を添加してインキュベート後、試料を除去して洗浄する。次に電気化学発光物質（ルテニウム等）標識抗体を加えてインキュベート後、電極上で電気エネルギーを与えて発光させる。この発光量を計測することによりｆｒｅｅＡＩＭ濃度を定量する。

以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。

実施例１：マウス抗ヒトＡＩＭモノクローナル抗体の作製
<動物感作>
抗原として全長ヒトｒＡＩＭ（２ｍｇ／ｍｌ）を等量のＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄ（Ｇ−１フナコシ）と混合しエマルジョンを作製した。免疫動物にはＢａｌｂ／ｃマウス（チャールズリバー（株））８週齢のメス２匹を用い、後ろ足底部へ５０μＬを投与した。２週間後に同様の投与を行い、更に２週間以上をおいて抗原溶液５０μｇを後ろ足底部へ投与し３日後の細胞融合に備えた。

<ミエローマ細胞>
ミエローマ細胞にはマウスＰ３Ｕ１を用い、増殖培養には、ＲＰＭＩ１６４０（１１８７５−１１９ＧＩＢＣＯ）にグルタミンとピルビン酸を加えＦＢＳ（Ｓ１５６０ＢＷＴ社）を１０％になるように添加した培地を用いた。抗生物質としてはペニシリン、ストレプトマイシンを適量加えた。

<細胞融合>
麻酔下にて心臓採血を行ったマウスから無菌的に膝窩リンパ節を摘出し、＃２００メッシュ付ビーカーにのせ、シリコン棒で押しながら細胞浮遊液を調整した。細胞はＲＰＭＩ１６４０にて２回の遠心洗浄を行った後、細胞数をカウントした。対数増殖期の状態のミエローマ細胞を遠心により集め洗浄後、リンパ細胞とミエローマ細胞の比率が５対１となるように調整し、混合遠心を行った。細胞融合はＰＥＧ１５００（７８３６４１ロシュ）を用いて行った。すなわち、細胞ペレットへ１ｍＬのＰＥＧ液を３分間かけて反応させ、その後、段階的に希釈を行い遠心にて洗浄した後、培地を加え９６ウェルプレート１５枚へ２００μＬずつ入れ、１週間の培養を行った。培地にはミエローマ細胞用培地にＨＡＴサプリメント（２１０６０−０１７ＧＩＢＣＯ）を加え、ＦＢＳ濃度を１５％にしたものを用いた。

<マウス腹水採取>
凍結保存された融合細胞を解凍し、増殖培養を行った後、１週間以上前に０．５ｍｌのプリスタン（４２−００２コスモバイオ）を腹腔内投与したヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕ日本クレア）の腹腔へ１×１０^７個を投与し、およそ２週間後に４〜１２ｍｌの腹水を得た。遠心処理にて固形物を除去した後、凍結保存を行った。

実施例２：急性腎障害患者血清における血清中ｆｒｅｅＡＩＭの発現
健常人３例、急性腎障害（ＡＫＩ）患者６例の血清におけるＡＩＭを、抗ＡＩＭ抗体を用いたウエスタンブロットにて検討した。血清を非還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、蛋白質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ，ミリポア社）に転写し、実施例１で作製したマウス抗ヒトＡＩＭモノクローナル抗体と４℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔにて一次抗体反応を行った。二次抗体にＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体、検出試薬としてＬｕｍｉｎａｔａＦｏｒｔｅＷｅｓｔｅｒｎＨＲＰＳｕｂｓｔｒａｔｅ（ミリポア社）を用い、シグナルの検出はＩｍａｇｅＱｕａｎｔＬＡＳ４０００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて行った。

非還元条件では、健常人血清では分子量>６００ｋＤａのＩｇＭと結合したＡＩＭが検出されたが、ＡＫＩ患者６血清においてはＩｇＭ結合ＡＩＭのバンドに加え、分子量<４０ｋＤａのｆｒｅｅＡＩＭのバンドが検出された（図１）。

実施例３：急性腎障害患者尿におけるｆｒｅｅＡＩＭの増加
ＡＩＭを定量するＥＬＩＳＡを用いて、健常人とＡＫＩ患者の尿中のｆｒｅｅＡＩＭ濃度を測定した。ＡＩＭＥＬＩＳＡでは、実施例１で作製されたマウス抗ヒトＡＩＭモノクローナル抗体をプレートに固相化し、患者尿を添加した。洗浄後、ＨＲＰ標識マウス抗ヒトＡＩＭモノクローナル抗体を反応させ、ＨＲＰ基質によって発色させた。尿中ではｆｒｅｅＡＩＭのみが存在することから、本ＥＬＩＳＡによって検出される尿中ＡＩＭは、ｆｒｅｅＡＩＭである。
健常人５例、ＡＫＩ患者（Ａｃｕｔｅ）５例、ＡＫＩから回復した患者（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）５例の尿中のｆｒｅｅＡＩＭ濃度を測定した。統計解析はＭａｎ−ＷｈｉｔｔｎｅｙＵｔｅｓｔを用いた。その結果、尿中のｆｒｅｅＡＩＭ濃度は、健常人と比べ、ＡＫＩ患者で有意に高かった（ｐ<０．００１）。また、ＡＫＩからの回復に伴い、尿中ｆｒｅｅＡＩＭ濃度が低下することが示された（図２）。

実施例４：慢性腎臓病患者血清における血清中ｆｒｅｅＡＩＭの発現
健常人３例、慢性腎臓病（ＣＫＤ）患者１３例の血清におけるＡＩＭを、実施例２に記載の方法による抗ＡＩＭ抗体を用いたウエスタンブロットにて検討した。ＣＫＤ患者血清では、分子量>６００ｋＤａのＩｇＭ結合ＡＩＭのバンドに加え、分子量<４０ｋＤａのｆｒｅｅＡＩＭのバンドが検出された（図３）。本方法におけるＣＫＤ患者には、慢性腎炎（慢性糸球体腎炎）、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、腎硬化症の患者が含まれていた。

実施例５：ＣＫＤ患者血清のｆｒｅｅＡＩＭ濃度
ｆｒｅｅＡＩＭを定量するＨｕｍａｎＡＩＭＥＬＩＳＡｋｉｔ（ＣｉｒｃｕＬｅｘ社ＣＹ−８０８０）を用い、健常人２０例、ＣＫＤ患者１５例の血清中のｆｒｅｅＡＩＭ濃度を測定した。測定はキットの取り扱い手順書に従って実施した。統計解析はＭａｎ−ＷｈｉｔｔｎｅｙＵｔｅｓｔを用いた。その結果、ｆｒｅｅＡＩＭ濃度は、健常人と比べ、ＣＫＤ患者で有意に高かった（図４）（ｐ<０．００１）。

本発明の方法および／または検査または診断補助キットを用いることにより、優れた感度および特異性で腎疾患を検査することができる。

Claims

腎疾患の検査方法であって、
被験体に由来する生体試料中のｆｒｅｅＡＩＭを検出または定量する工程を含む、
方法。
腎疾患の診断を補助する方法であって、
被験体に由来する生体試料中のｆｒｅｅＡＩＭを検出または定量する工程を含む、
方法。
腎疾患を検査するために、被験体に由来する生体試料中のｆｒｅｅＡＩＭを検出または定量する方法。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、
前記生体試料が、血清、血漿、全血および尿からなる群から選択される、
方法。
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、
前記腎疾患が、急性腎障害又は慢性腎臓病である、
方法。
請求項５に記載の方法であって、
前記慢性腎臓病が、慢性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、ＩｇＡ腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症又はＩｇＭ腎症である、
方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、
前記検出または定量は、イムノアッセイによるものである、
方法。
請求項７に記載の方法であって、
前記検出または定量は、生体試料とｆｒｅｅＡＩＭに結合する抗体とを接触させることにより行う、
方法。
請求項８に記載の方法であって、
前記検出または定量は、ｆｒｅｅＡＩＭに特異的に結合する抗体により行う、
方法。
請求項８または請求項９に記載の方法であって、
前記検出または定量は、ＥＬＩＳＡによる測定である、
方法。
請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、
前記検出または定量は、血清、血漿または全血から選択される血液試料をタンパク質変性条件に曝露することなく、かつ、還元条件に曝露することなく行うことを特徴とする、
方法。
ｆｒｅｅＡＩＭに結合する抗体を含む、腎疾患の検査または診断補助用キット。
請求項１２に記載のキットであって、
前記抗体が、ｆｒｅｅＡＩＭに特異的に結合する抗体である、
キット。
請求項１２または請求項１３に記載のキットであって、
前記腎疾患が、急性腎障害または慢性腎臓病である、
キット。
請求項１４に記載のキットであって、
前記慢性腎臓病が、慢性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、ＩｇＡ腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症またはＩｇＭ腎症である、
キット。