CN107907689A

CN107907689A - 外泌体蛋白cd5l的检测方法

Info

Publication number: CN107907689A
Application number: CN201710935374.6A
Authority: CN
Inventors: 纪建国; 王青松; 费丹霞
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2017-10-10
Filing date: 2017-10-10
Publication date: 2018-04-13

Abstract

本发明提供了一种外泌体上CD5L的检测方法，包括以下步骤：1)处理血清；2)包被抗体CD5L于固相载体上；3)将所得血清样品加入所述固相载体上孵育；4)在所得固相载体中加入辣根过氧化物酶二抗显色，酶标仪记录OD值。本发明采用TMT技术鉴定到外泌体上的CD5L蛋白，并且还提供了可在外泌体CD5L定量检测中应用的操作方法。本发明提供的血清外泌体CD5L蛋白的检测方法灵敏度较高，需要样本量小，同时检测所用设备成本低、小型化且可高通量、特异性地检测血清中表达CD5L蛋白的特定外泌体的含量，对外泌体的临床检测应用潜力挖掘具有重要意义。

Description

外泌体蛋白CD5L的检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，具体地，涉及一种外泌体蛋白CD5L的检测方法。

背景技术

外泌体，是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜结构，直径大约40-100nm。最近几年，人们发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能。常常用于鉴定外泌体的经典的Marker有CD9，CD81，CD63，HSP70，TSG101等。这些发现点燃了人们对细胞分泌膜泡的兴趣。最近的研究发现外泌体在很多生理病理机制中起着重要的作用，如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。不同细胞分泌的外泌体具有不同的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。

随着外泌体特异性蛋白研究的逐渐兴起，许多新型蛋白被发现，血清外泌体膜表面除含有CD9，CD63和CD81标志蛋白外，还含有新型的特定标记蛋白，如黑色素瘤患者体内血清外泌体中特定表达caveolin-1蛋白，人体血细胞产生的外泌体上的特异性蛋白CD34+，尿液外泌体上特异性的蛋白CD24等。

目前，血清外泌体的分离主要有基于超速离心的分离技术，基于分子大小的分离技术(色谱法)，PEG沉淀法，基于免疫吸附的分离技术等。离心法对外泌体得率较高，但其耗时耗力，不适合大量样本操作。色谱法提取的外泌体纯度较高，但其分离易受杂蛋白干扰,操作稳定性差。大分子聚合物沉淀外泌体耗时短，所得外泌体纯度低，并且不能高通量的比较不同样本中外泌体的含量。

因此开发出高灵敏度、高选择性、价钱低廉、直接测定血清中外泌体的CD5L的方法引起了人们的研究兴趣。

发明内容

本发明的目的是提供一种外泌体蛋白CD5L的检测方法，优点是所需样本量小，同时检测所用设备成本低、小型化，可高通量、特异性地检测含有CD5L蛋白的特定外泌体含量，对外泌体的临床检测应用具有重要意义。

本发明的基本思想是使用酶联免疫吸附的方法定量检测血清外泌体中所含CD5L的量。

本发明提供了一种外泌体蛋白CD5L的检测方法，该方法包括以下步骤：

1)预处理，取新鲜血清，经离心，初步去除杂质，取上清，进行超声破碎；

2)于固相载体(例如96孔酶标板)上包被单克隆抗体CD5L；

3)向步骤2)所得固相载体上(例如96孔酶标板)加入封闭液进行封闭；

4)向步骤3)封闭之后的固相载体(例如96孔酶标板)中加入步骤1)预处理的血清，孵育；

5)向步骤4)封闭之后的固相载体(例如96孔酶标板)中加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育；

6)在步骤5)中得到的产物在加入TMB(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)显色液，显色，检测OD值(如用酶标仪)。

进一步地，步骤1)包括室温下取新鲜血清，与室温条件下离心，3000g，30分钟；初步去除杂质，取上清；将上清与含1％脱脂奶的PBS按照体积比1∶29进行稀释，然后进行超声破碎。

进一步地，所述超声破碎条件为5s on(开)，5s off(关)，即间隔5s开关一次，至少60cycles(循环)，low frequncy(低频)。

进一步地，步骤2)中固相载体上所述包被蛋白即包被单克隆抗体CD5L的含量为200ng/孔；包被温度为4℃，包被时间为12小时，包被稀释液为碳酸盐缓冲液。

进一步地，步骤3)所述固相载体(例如96孔酶标板)需要经过PBST(10％tween 20溶于PBS)洗涤至少5遍；步骤3)所述封闭液为含5％脱脂奶的PBS，封闭时间为2小时。

进一步地，步骤4)所述固相载体(例如96孔酶标板)需要经过PBST(10％tween 20溶于PBS)洗涤至少3遍；步骤4)所述预处理的血清添加量与包被单克隆抗体CD5L的质量比为(70～100ug):200ng；孵育时间优选为3.5小时。

进一步地，步骤5)所述辣根过氧化物酶标记的二抗用含1％脱脂奶的PBS按照1∶3500的比例稀释，孵育时间优选为1.5小时。

进一步地，步骤6)中加入的TMB显色液与所述包被单克隆抗体CD5L的体积质量比为100ul:200ng；37℃，孵育至少10分钟，加入50mM H₂SO₄终止反应，于450nm处检测OD值。

若无特殊指明，本发明所述TMB显色液购自美国Amresco公司。

本发明的技术特点在于：

本发明采用TMT技术鉴定到外泌体上的CD5L蛋白，并且还提供了可在外泌体CD5L定量检测中应用的操作方法。本发明提供的外泌体CD5L蛋白的检测方法灵敏度较高，需要样本量小，同时检测所用设备成本低、小型化且可高通量、特异性地检测CD5L蛋白的特定外泌体含量，对外泌体的临床检测应用潜力挖掘具有重要意义。

附图说明

图1，超速离心得到外泌体中CD5L的谱图，经过鉴定后，在外泌体中CD5L蛋白表达量较高。

图2，不同血清样本中外泌体CD5L蛋白表达量的Western图。

图3，采用上述方法，运用不同的血清样本进行ELISA检测，定量分析血清中外泌体CD5L蛋白的表达水平。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

下述实施例中使用的主要仪器及试剂:恒温培养箱；超声破碎仪(Bioruptor Plus)；酶标仪；兔抗人CD5L多克隆抗体(Abcam公司,美国)；HRP标记二抗(Jackson Immuno Research，美国)；TMB(Amresco，美国)。

实施例1血清外泌体蛋白CD5L的检测

实验步骤：

1)收集新鲜血清，置于离心机中，室温3000g离心30分钟，弃细胞碎片沉淀，取离心上清液，按照血清；PBS配置的1％脱脂奶为1∶29的比例稀释，将产物进行超声破碎，超声破碎所需条件为5s on，5s off，60cycles，low frequncy；

2)于96孔酶标板上包被单克隆抗体CD5L 200ng/孔，用碳酸盐缓冲液稀释，在4℃孵育12小时；

3)在步骤2)最终得到酶标板用PBST(10％tween 20溶于PBS)轻柔的洗涤5遍，在孔中加入封闭液(PBS配置的5％脱脂奶)进行封闭，于37℃封闭2小时；

4)用PBST(10％tween 20溶于PBS)轻柔洗涤酶标板3遍，在封闭之后的酶标板中加入步骤1)所得的血清70～100ug，于37℃孵育3.5小时；

5)用PBST(10％tween 20溶于PBS)轻柔洗涤酶标板5遍，在酶标板中加入辣根过氧化物酶标记的二抗用1％脱脂奶PBS按照1∶3500的比例稀释，与37℃孵育1.5小时；

6)用PBST(10％tween 20溶于PBS)轻柔洗涤酶标板5遍，在步骤5)所得酶标板中，加入100ul TMB，于37℃，孵育10min，加入50mM H₂SO₄终止反应，测量A450nm处的OD值。

实验结果：

如图1示，超速离心得到外泌体中CD5L的质谱图，经过鉴定后，在外泌体中CD5L蛋白表达量较高。

图2，不同血清样本中外泌体CD5L蛋白表达量的Western图，所示结果显示CD5L蛋白在血清中含量较低，在外泌体中含量很高。Exo表示外泌体。

图3，采用该方法，运用不同的血清样本进行ELISA检测，定量分析血清中外泌体CD5L蛋白的含量，所示结果显示，不同血清样本中所含有的CD5L蛋白量存在显著差异。图3纵坐标表示所读取的OD值的读数。

Claims

1.一种外泌体蛋白CD5L的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)于固相载体上包被单克隆抗体CD5L；

3)向步骤2)所得固相载体上加入封闭液进行封闭；

4)向步骤3)封闭之后的固相载体中加入步骤1)预处理的血清，孵育；

5)向步骤4)封闭之后的固相载体中加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育；

6)在步骤5)中得到的产物在加入TMB显色液显色，检测OD值。

2.根据权利要求1所述的外泌体蛋白CD5L的检测方法，其特征在于，步骤1)将所述上清与含1％脱脂奶的PBS按照体积比1:29进行稀释，然后进行超声破碎；

优选地，所述超声破碎条件为间隔5s开关一次，至少60循环。

3.根据权利要求1或2所述的外泌体蛋白CD5L的检测方法，其特征在于，步骤1)所述离心在室温或4℃条件下进行，3000g，30分钟。

4.根据权利要求1或2所述的外泌体蛋白CD5L的检测方法，其特征在于，步骤2)中固相载体上所述包被单克隆抗体CD5L的含量为200ng/孔；包被稀释液为碳酸盐缓冲液；优选地，包被温度为4℃，包被时间为12小时。

5.根据权利要求1或2所述的外泌体蛋白CD5L的检测方法，其特征在于，步骤3)所述固相载体需要经过PBST洗涤至少5遍；所述封闭液为含5％脱脂奶的PBS；优选地，封闭时间为2小时。

6.根据权利要求1或2所述的外泌体蛋白CD5L的检测方法，其特征在于，步骤4)所述固相载体需要经过PBST洗涤至少3遍；步骤4)所述预处理的血清添加量与包被单克隆抗体CD5L的质量比为(70～100ug):200ng；孵育时间优选为3.5小时。

7.据权利要求1或2所述的外泌体蛋白CD5L的检测方法，其特征在于，步骤5)所述辣根过氧化物酶标记的二抗用含1％脱脂奶的PBS按照1:3500的比例稀释，孵育时间优选为1.5小时。

8.根据权利要求1或2所述的外泌体蛋白CD5L的检测方法，其特征在于，步骤6)中加入的TMB显色液与所述包被单克隆抗体CD5L的体积质量比为100ul:200ng；优选加入TMB显色液后于37℃，孵育至少10分钟，然后加入50mM H₂SO₄终止反应。

9.根据权利要求1-8任一项所述的外泌体蛋白CD5L的检测方法，其特征在于，于450nm处检测OD值。