CN106706912A - 诊断炎症相关肝癌的标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及炎症相关肝癌的联合诊断标志物及其应用。首次提出联合应用外周血单核细胞(monocyte)或血浆中STK4蛋白和外周血单核细胞中磷酸化p65(p-p65)、磷酸STAT3(p-STAT3)及血浆中的IL-6蛋白水平作为炎症相关肝癌的标志物，为肝癌的快速、早期诊断和监测提供了理论基础和更简易的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于疾病诊断领域，更具体地，本发明涉及早期大规模、特异性筛查炎症相关肝癌的诊断标志物以及针对标志物表达异常的靶点确定个体化治疗方案应用。
背景技术
目前，癌症仍是世界上对人类健康危害最大的疾病之一，同时也是最难攻克的疾病之一，而肝癌是我国最为常见的恶性肿瘤之一。临床上确诊的肝癌患者一般都已是中晚期，肝脏功能损伤严重，即便通过手术和化疗等方法，生存率也很低。因此，早期发现早期治疗至关重要。近年来，随着生命科学领域研究的飞速发展，血清中肿瘤标志物检测如甲胎蛋白(AFP)已用于肿瘤早期诊断、评估预后及观察疗效复发及转移等方面。
炎症在肿瘤形成的不同阶段发挥着决定性作用，包括肿瘤起始、促进恶性转化、侵袭和转移方面，同时炎症亦会影响免疫监视和治疗反应。许多研究证实炎症可诱发肿瘤的形成，如乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒(HCV)感染可增加患肝癌的风险性；血吸虫、拟杆菌感染分别与膀胱癌和结肠癌相关等。虽然炎症保护性反应对维持机体的健康和正常功能至关重要，但炎症反应的非可控性持续和放大却往往会诱导肿瘤的发生发展。免疫系统的作用贯穿于炎症诱导肿瘤的整个过程。巨噬细胞、T细胞等通过复杂的促炎因子信号网络直接参与了炎症的发生发展过程，起到了促炎及促瘤作用。更重要的是，部分重要的信号分子在肝癌细胞和免疫细胞中都表达，并通过类似的信号通路调控两类细胞的功能，在炎症相关肝癌(chronic inflammation associated-HCC)发生发展中起协同促进作用。根据临床，HCC分成非炎症相关肝癌和炎症相关肝癌两类，针对这两类肝癌，应采取不同方式的临床治疗，但现有技术中对这两类肝癌的进行区分的技术还不够理想。
因此，发展一种新型诊断方法，能区别非炎症肝癌和炎症相关肝癌，在早期对炎症相关肝癌进行特异性诊断、评估；以及针对个体病人外周血单核细胞核中异常表达的靶蛋白，确定个体化治疗的方案具有重要的临床意义。
发明内容
本发明涉及炎症相关肝癌标志物的鉴定，并且联合多种标志物的表达水平，作为特异性、早期大规模筛查炎症相关肝癌、作为诊断评估指标、确定个体化治疗方案的临床应用。
在本发明的第一方面，提供STK4蛋白和IL-6蛋白，以及可选的磷酸化p65(p-p65)、磷酸化STAT3(p-STAT3)的用途，用于作为诊断炎症相关肝癌的诊断标志物，或用于作为对肝癌分型的诊断标志物，或用于作为对肝癌分期的诊断标志物，或用于作为诊断肝癌转移的诊断标志物。
在一个优选例中，所述的诊断标志物是血清诊断标志物，血浆诊断标志物或外周血单个核细胞诊断标志物。
在另一优选例中，所述的诊断包括：早期诊断，预后评估。
在另一优选例中，所述的对肝癌分型包括：区分非炎症的肝癌与炎症相关肝癌。
在本发明的另一方面，提供STK4蛋白和IL-6蛋白，以及可选的磷酸化p65(p-p65)、磷酸化STAT3(p-STAT3)的用途，用于制备诊断炎症相关肝癌、对肝癌分期或诊断肝癌转移的诊断试剂。
在一个优选例中，所述的诊断试剂是以血清为待测样品的诊断试剂，以血浆为待测样品的诊断试剂或以外周血单个核细胞为待测样品的诊断试剂。
在本发明的另一方面，提供一种用于对肝癌分型(包括区分非炎症的肝癌与炎症相关肝癌)、对肝癌分期或诊断肝癌转移的试剂盒，所述试剂盒中包括：特异性检测STK4蛋白表达水平的试剂和特异性检测IL-6蛋白表达水平的试剂；
以及可选的：特异性检测磷酸化p65(p-p65)水平的试剂和/或特异性检测磷酸化STAT3(p-STAT3)水平的试剂。
在一个优选例中，所述的特异性检测STK4蛋白表达水平的试剂是抗STK4蛋白的抗体；和/或
所述的特异性检测IL-6蛋白表达水平的试剂是抗IL-6蛋白的抗体；和/或
所述的特异性检测磷酸化p65(p-p65)水平的试剂是抗p-p65蛋白的抗体；和/或
所述的特异性检测磷酸化STAT3(p-STAT3)水平的试剂是抗p-STAT3蛋白的抗体。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：FACS流式细胞学检测试剂和/或酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂。
在本发明的另一方面，提供特异性检测STK4蛋白表达水平的试剂和特异性检测IL-6蛋白表达水平，以及可选的特异性检测磷酸化p65(p-p65)水平或特异性检测磷酸化STAT3(p-STAT3)水平的试剂的用途，用于制备对肝癌分型(包括区分非炎症的肝癌与炎症相关肝癌)、对肝癌分期或诊断肝癌转移的试剂盒。
在本发明的另一方面，提供一种诊断炎症相关肝癌的方法，所述方法包括：
(1)应用所述的试剂盒检测受试者血浆、血清或外周血分离出的单核细胞中STK4蛋白表达水平和IL-6蛋白表达水平；以及可地联合检测磷酸化p65(p-p65)水平及磷酸化STAT3(p-STAT3)水平；
(2)分析各蛋白表达水平，若STK4蛋白显著性低表达和IL-6蛋白显著性高表达，以及可选地检测到磷酸化p65(p-p65)水平及磷酸化STAT3(p-STAT3)水平显著性高表达，表明受试者为炎症相关肝癌的高危人群或患者。
在本发明的另一方面，提供一种对肝癌分期或诊断肝癌转移的方法，所述方法包括：
(1)应用所述的试剂盒检测受试者血浆、血清或外周血分离出的单核细胞中STK4蛋白表达水平和IL-6蛋白表达水平；
(2)分析各蛋白表达水平，若对比健康对照人群，STK4蛋白显著性低表达和IL-6蛋白水平小幅度提高表达，则表明肝癌为早期或中期肝癌；若对比健康对照人群，STK4蛋白无显著性降低,并且IL-6蛋白显著性高表达，则表明为晚期肝癌或发生癌转移。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、STK4在小鼠肝癌巨噬细胞中蛋白表达水平和肝癌小鼠血清中IL-6的含量检测。Isotype表示同型二抗染色的对照，Veh表示未经化合物及LPS处理的对照组。
图2、IL-6在炎症相关肝癌患者和正常(Normal)人血浆中的蛋白表达水平检测。
图3、STK4、p-p65和p-STAT3在炎症相关肝癌患者和正常人的外周血单核细胞中的蛋白表达水平检测以及相关性检测；针对表达异常的靶点，为确定个体化治疗方案提供重要指标。
图4、STK4在炎症相关肝癌患者和正常人血浆中的蛋白表达水平检测。
图5、STK4在低水平炎症性与高水平炎症性肝癌患者中的检测。
图6、联合STK4与IL-6水平，早期筛查炎症相关肝癌的分期或是否转移的应用。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(STK4)和IL-6在炎症相关肝癌患者血浆、血清或外周血单个核细胞中的表达发生显著性改变，表现为与健康样本相比，STK4表达显著性降低及IL-6显著性提高，并且磷酸化p65(p-p65)水平及磷酸化STAT3(p-STAT3)水平显著性提高。基于此，本发明人建立了一种炎症相关肝癌、肝癌分期或肝癌转移的联合诊断方法，该方法较应用单一因素具有更好的准确性。
本发明人首次发现，与健康人群相比，炎症相关肝癌的病人外周血的血浆中STK4含量显著降低。而且，与健康人群或动物相比，病患血浆中IL-6含量显著增高。同病患血浆中IL-6含量的绝对值相比，病患血浆中STK4的含量明显降低，与炎症相关肝癌正相关，并与肿瘤转移等发展密切相关。在患者外周血单核细胞中，p-p65和p-STAT3水平上升，STK4的表达水平降低，并且STK4与p-p65和p-STAT3具有明显的负相关性，可以作为一种辅助性检测指标，结合血浆中STK4与IL-6的含量，联合应用成为临床上早期大规模筛查炎症相关肝癌的重要生物学标志物。并且，下调的STK4水平与升高的磷酸化p65和磷酸化STAT3水平，共同调控免疫细胞和肿瘤细胞的功能，协同促进炎症相关肝癌的发展。针对表达异常的上述生物学标志物，确定个体化治疗方案如利用特异性p65和STAT3的抑制子，为早期阻断炎症相关肝癌提供重要上述用药的指征。
为了准确地测定样本中STK4蛋白，IL-6蛋白和/或磷酸化p65(p-p65)及磷酸化STAT3(p-STAT3)的水平，本发明人建立了针对STK4蛋白，或联合IL-6和/或磷酸化p65(p-p65)、磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白的灵敏检测系统。更重要的是，可以利用血浆样品或外周血单核细胞作为检测对象，避免从肝组织取样，从而利于方便、快捷地用于临床检测。作为本发明的优选方式，所述的检测系统是一种检测试剂盒和或FACS细胞流式检测试剂，所述的试剂盒和或检测试剂中含有特异性结合STK4蛋白和，IL-6蛋白和/或磷酸化p65(p-p65)、磷酸STAT3(p-STAT3)蛋白的抗体。
作为本发明的优选方式，所述的特异性检测STK4蛋白表达水平的试剂是抗STK4蛋白的抗体；和/或所述的特异性检测IL-6蛋白表达水平的试剂是抗IL-6蛋白的抗体；和或所述的特异性检测磷酸化p65(p-p65)水平的试剂是抗p-p65蛋白的抗体；和或所述的特异性检测磷酸化STAT3(p-STAT3)水平的试剂是抗p-STAT3蛋白的抗体。
制备抗体的技术是本领域中众所周知的。本发明的抗体可以是对STK4或IL-6、磷酸化p65(p-p65)、磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白具有特异性的单克隆抗体。单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。所述单克隆抗体可以利用STK4或IL-6，p-65，p-STAT3蛋白或蛋白片段或功能区，通过免疫技术获得。此外，还可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。
本发明的抗体也可以是对STK4蛋白或IL-6蛋白具有特异性的多克隆抗体。所述的多克隆抗体可通过常规的方法来制备，例如，可通过将所述的STK4或IL-6蛋白导入动物中来获得，例如，将STK4或IL-6蛋白与弗氏佐剂按照适当比例(如1:1)混合后免疫动物。免疫方法可使用动物皮下注射。所述动物可选自兔、羊、鼠等。
在获得了特异性检测STK4蛋白表达水平的试剂和特异性检测IL-6蛋白、磷酸化p65(p-p65)、磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白表达水平的试剂后，可以方便地制备出用于特异性检测STK4和IL-6蛋白的检测试剂盒以及特异性检测STK4和或磷酸化p65(p-p65)及磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白的FACS细胞流式检测方法。所述试剂盒中除了含有所述抗体以外，还可以包含：携带有可检测信号分子的检测抗体(如用于抗STK4抗体或抗IL-6、p-STAT3、p65抗体结合的抗体)，以及疫组化试剂和或荧光标记的二抗及FACS细胞流式检测相关试剂。所述的免疫组化试剂包括但不限于：显色试剂，二甲苯，乙醇，H2O2甲醇液，抗原修复液，封闭液，PBS，中性树脂等。所述的FACS细胞流式检测试剂包括但不限于：细胞固定液，细胞穿膜液，细胞染色液，细胞染色洗涤液等。
如本文所用，所述的“可检测信号分子”是指用于确定待检测样品中STK4和或IL-6蛋白、磷酸化p65(p-p65)、磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白的存在与否以及存在的量的标志物。在确定了本发明的试剂盒所采用的特异性抗体和检测抗体后，可以采用本领域常规用于与检测抗体结合来进行检测的各种可检测信号分子。例如，可检测信号分子可以选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β–D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。
当采用如上所示的一些酶作为可检测信号分子时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导可检测信号分子的存在情况或者存在量。所述的底物例如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate，p-NPP)；等等。本领域人员可根据所采用的可检测信号分子的种类和特性，选择适宜的底物。
在获得了本发明提供的试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中STK4和IL-6蛋白、磷酸化p65(p-p65)、磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白的表达量，这些方法均被包含在本发明中。
作为一种优选方式，本发明提供了使用上述试剂盒用于体外检测STK4和或IL-6、磷酸化p65(p-p65)、磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白在肝癌组织中和或患者血浆中的表达量的方法，该方法包括以下步骤：
(1)应用所述的试剂盒检测受试者血浆或外周血单核细胞中STK4蛋白表达水平和/或IL-6、磷酸化p65(p-p65)及磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白表达水平；
(2)分析蛋白表达水平，若STK4蛋白显著性低表达和/或IL-6、磷酸化p65(p-p65)及磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白显著性升高，则该受试者为肝癌高危人群或肝癌罹患者。
作为一种优选的检测方法，利用三明治法ELISA技术检测STK4的含量。操作步骤为：将特异性STK4一次抗体固着于塑胶孔上，完后洗去多余抗体，并利用含有BSA的封闭液封闭未被STK4抗体附着的孔盘表面，获得到的孔板经干燥处理，可长期冷藏备用；加入待测血浆样品和标准样品(人STK4标准蛋白梯度稀释液)，待测样品中STK4即可作为抗原与塑胶孔盘上的抗体进行特异性结合；经数次清洗，加入偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的另外一种STK4抗体(与前一种抗体具有不同抗原表位，称为二次抗体)，与待测抗原(STK4)结合；洗去多余未结合的二次抗体，加入显色剂反应后，加入2N硫酸终止反应，测定450nm处的黄色光光吸收值(OD)，利用标准蛋白的OD值做标准曲线，即可根据待测血清样品的不同OD值推算出其STK4蛋白含量。也采用ELISA方法检测血清中IL-6的水平，原理和实施步骤同检测STK4的方法。
作为一种优选的检测方法，利用FACS流式细胞染色检测外周血单核细胞中STK4和磷酸化p65(p-p65)及磷酸化STAT3(p-STAT3)的水平。操作步骤为：表面染色人的巨噬细胞marker(CD14与CD11b)1hr后洗去多余抗体，用细胞固定液处理后进行穿膜液处理，以便进行胞内染色；加入相应的检测抗体STK4，磷酸化p65(p-p65)及磷酸化STAT3(p-STAT3)与细胞悬浮液共同孵育；洗去多余结合的抗体后，加入相应的二抗(针对抗体种属来源的不同荧光基团标记的IgG抗体)反应后，再次洗涤，最后流式检测。
本发明第一次提出检测外周血单核细胞和或血浆中STK4蛋白和或IL-6、磷酸化p65(p-p65)及磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白联合应用作为早期肝炎以及肝癌标志物，检测方法具有简易、灵敏、高效的优点，为肝癌的快速、早期诊断和监测提供了理论基础和更简易的检测方法，对基础研究和临床应用均有重要的意义。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
外周血样本的收集
本发明人收集了多例确诊为肝癌的外周血样品作为实验组，收集了多例健康人的外周血样品作为对照组。
各份血液样品收集在EDTA抗凝管中，体积为3ml左右，放于4℃冰箱冷藏。在15ml离心管中，加入等体积的密度为1.077g/ml的Ficoll聚蔗糖分离液，然后将血液样品加入到分离液的上层，水平转子800g室温离心20分钟。分层结束后，最上层浅黄色部分即为血浆，可直接用于ELISA等方法检测，中间层外周血单核细胞可经PBS缓冲液洗涤后用于其他检测。血清的分离方法为Ficoll分离法，还可以其它方法如可以将血液样品收集在促凝管中，室温下凝血2小时，4000rpm离心5分钟取上清即可。血清分装冻存于-80℃待测。
ELISA方法检测STK4、IL-6的浓度
将收集到的炎症相关肝癌患者血清取出50ul(稀释5倍)，以及溶解于封闭液中的不同浓度STK4标准样品各50ul，分别加入到预包被有抗STK4特异性抗体(一抗)的8联排孔中，37℃孵育30分钟后，用洗涤液洗涤5次，每次每孔200ul；洗涤后加入偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的另外一种抗STK4抗体(HRP酶标记的STK4二抗)，37℃孵育30分钟；洗涤5次后，每孔加入100ul底物工作液，孵育10分钟后，加入50ul终止液，即可测量450nm光吸收值。根据标准样品(如120、80、40、20、10pg/ml等的STK4梯度样品)的OD值，作标准曲线和方程拟合，再利用血清中待测样本的OD值，即可推算出其含STK4的浓度(pg/ml)。
同样的，利用ELISA方法和相关试剂组合，本发明人检测血清中IL-6的浓度。
FACS细胞流式方法检测外周血单核细胞中STK4和磷酸化p65(p-p65)及磷酸化STAT3(p-STAT3)的表达水平
将收集到的炎症相关肝癌患者的外周血单核细胞进行人巨噬细胞marker的表面染色，加入CD14和CD11b抗体，4℃孵育1小时后，加入1ml洗涤缓冲液洗涤，1200rpm离心5min；弃上清后加入细胞固定和穿膜液4℃反应50min后，加入1ml洗涤缓冲液洗涤，1600rpm离心5min；弃上清后加入相应的抗体STK4和或p-p65，p-STAT3反应1小时后，加入1ml洗涤缓冲液洗涤，1600rpm离心5min；弃上清后再加入偶联有荧光标记基团的二抗染色1小时，最后洗涤一次，1600rpm离心5min，弃上清后用细胞染色液重悬后进行流式细胞仪检测，其平均荧光强度MFI即可指示其表达水平。
统计学分析
本发明人利用GraphPad Prism 6软件对收集的临床资料和对应血清中STK4和IL-6的浓度进行了统计分析。组间比较用非配对two tailed T检验或非参数Mann-Whitney检验分析，确定p<0.05为差异有显著性(*)，p<0.01为差异有极显著性(**)。利用SPSS软件进行相关性分析，用Pearson检验方法分析，确定p<0.05为差异有显著性(*)。
实施例1、肝癌小鼠中STK4蛋白及IL-6蛋白水平
利用DEN+CCl4+LPS诱导炎症相关肝癌的过程，DEN腹腔注射6周大小的野生型小鼠，注射后第三周进行每天的低剂量LPS注射，第四周开始一周一次的CCl4注射，持续12周后观察。11个月后取出肝脏，利用Percoll分离肝中淋巴细胞并进行FACS流式染色F4/80和STK4，检测巨噬细胞中STK4的蛋白水平。同时经眼球采血后血液室温凝固60分钟，3000rpm/min离心20分钟，收集上清血清。利用ELISA试剂盒检测血清中IL-6的含量。
结果如图1，未经处理的正常对照组(Veh)和DEN+CCl4+LPS诱导的炎症相关肝癌小鼠肝巨噬细胞中STK4含量和血清中IL-6含量均有显著性差异(p值均小于0.05)。
通过上述流式细胞术和ELISA检测方法，本发明人得出结论，肝癌组织中浸润的巨噬细胞显著性下调表达STK4蛋白的水平，同时血清中IL-6蛋白水平增高。
实施例2、肝癌患者外周血中IL-6的水平
收集40例正常健康人和59例肝癌患者血浆。抗凝管收集的正常健康人或肝癌病人血液3ml，经Ficoll分离，取最上层血浆，通过ELISA检测血浆中IL-6的含量。
结果如图2，通过ELISA方法检测到肝癌患者血浆中有高水平的IL-6；而正常健康人水平极低，最高不到20pg/ml，两者具有极显著性差异。
实施例3、联合检测肝癌患者外周血单核细胞中STK4和p-p65和p-STAT3水平，在个体化治疗中的应用
收集7例正常健康人和12例肝癌患者外周血单核细胞。抗凝管收集的正常健康人或肝癌病人血液3ml，经Ficoll分离，取中间层单核细胞，通过FACS流式检测CD14+CD11b+外周血单核细胞中STK4和p-p65和p-STAT3的含量。
结果如图3，在肝癌患者CD14+CD11b+外周血单核细胞中，通过流式技术检测到CD14+CD11b+外周血单核细胞中的STK4相对于正常人表达水平较低。相反，phos-p65和phos-STAT3都较正常人水平高。
并且，利用SPSS软件分析Pearson相关系数，STK4与p-p65以及STK4与p-STAT3都具有明显的负相关性。
实施例4、肝癌患者血浆中的STK4蛋白水平
收集正常人对照血样共计45例，肝癌病人血样共计59例。抗凝管收集的正常健康人或肝癌病人血液3ml，经Ficoll分离，取最上层血浆，通过ELISA检测血清中STK4的含量。
结果如图4，正常健康人血浆中STK4浓度最高达300pg/ml，而肝癌患者中最高不到150pg/ml，两者具有显著性差异(p值小于0.05)。
通过ELISA方法，检测到肝癌患者血浆中的STK4蛋白水平比正常健康人对照显著性降低。
实施例5、联合STK4与IL-6区分诊断非炎症和炎症相关肝癌患者的临床应用或大规模早期筛查炎症相关肝癌的应用
收集正常人对照血样共计45例，肝癌病人血样共计59例。抗凝管收集的正常健康人或炎症相关肝癌病人血液3ml，经Ficoll分离，取最上层血浆，通过ELISA检测血清中STK4和IL-6的含量。
结果如图5，根据血浆中IL-6的浓度分为IL-6lo(<50pg/ml，均值为23.29pg/ml)和IL-6hi(>50pg/ml，均值为209.7pg/ml)两群肝癌患者，与正常人(均值为12pg/ml)对比，IL-6显著性上升。并且炎症水平高的肝癌患者(IL-6hi)与炎症水平低的患者(IL-6lo)相比，IL-6也是显著性升高。检测正常人和相应的两群肝癌患者血浆中的STK4蛋白水平，如图5所示，与正常人相比，炎症水平低的患者(均值为99.29pg/ml)没有显著性降低STK4的表达水平(均值为117.8pg/ml)。而在炎症水平高的肝癌患者中，STK4较正常人显著降低(均值为86.33pg/ml)；同时，炎症水平高的肝癌患者(IL-6hi)的STK4水平也是显著低于炎症水平低的患者(IL-6lo)。
因此，利用IL-6和STK4蛋白的联合检测，可对炎性肝癌患者进行分型，鉴定出高炎症/低STK4水平患者(为炎症相关肝癌)和低炎症/高STK4水平患者这两类患者，指导后期临床个体化治疗。
实施例6、结合STK4与IL-6水平分析患者病情
获得30位原发性肝癌患者，根据临床巴塞罗那分期对患者病程程度进行分类如下：Phase A是早期阶段；Phase B是中期阶段(有多个或单个大于5cm的肿瘤)；Phase C是晚期阶段(有血管侵袭和转移现象)。
检测上述肝癌患者的IL-6和STK4水平。与健康人(Health，27例)相比，不同时期的肝癌患者血浆中IL-6水平均上升，提示这些原发性肝癌患者均为炎症相关肝癌患者，如图6所示。同时，检测相应的患者中STK4的蛋白水平，发现早期和中期阶段肝癌患者与健康人对比均有显著降低(图6所示)，说明血浆中STK4蛋白水平可以作为炎症相关肝癌患者的早期或中期阶段诊断的一个新的血清标志物。而晚期肝癌患者并没有看到STK4蛋白水平下降，和正常组无显著差别，那么单独利用STK4水平降低诊断是否肝癌患者时就可能会忽视这样一群病人，但是在晚期肝癌患者中IL-6还是有显著性升高。另外，IL-6蛋白水平在中期和晚期并没有显著性的差异，所以单独IL-6检测也并不能预测病情进展或恶化。而与中期相比，晚期的STK4蛋白水平显著升高，提示当炎症性肝癌患者中，若STK4和正常人相比没有显著性降低，并且显著高于其他肝癌患者时(如图6所示)，这些患者将有可能出现恶化转移的风险。所以STK4和IL-6的联合诊断可以更加准确判断是否属于肝癌患者或肝癌患者是否有恶化转移的风险。
总之，本发明中联合应用STK4和IL-6血清水平的变化预测是否是炎性肝癌高危人群，或肝癌早中期患者是否有恶化转移的风险，提示IL-6与STK4血清水平的联合应用对于病情监控是个很好的肿瘤标志物应用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.STK4蛋白和IL-6蛋白，以及可选的磷酸化p65、磷酸化STAT3的用途，用于作为诊断炎症相关肝癌的诊断标志物，或用于作为对肝癌分型的诊断标志物，或用于作为对肝癌分期的诊断标志物，或用于作为诊断肝癌转移的诊断标志物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的诊断标志物是血清诊断标志物，血浆诊断标志物或外周血单个核细胞诊断标志物。
3.STK4蛋白和IL-6蛋白，以及可选的磷酸化p65、磷酸化STAT3的用途，用于制备诊断炎症相关肝癌、对肝癌分期或诊断肝癌转移的诊断试剂。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的诊断试剂是以血清为待测样品的诊断试剂，以血浆为待测样品的诊断试剂或以外周血单个核细胞为待测样品的诊断试剂。
5.一种用于对肝癌分型、对肝癌分期或诊断肝癌转移的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：特异性检测STK4蛋白表达水平的试剂和特异性检测IL-6蛋白表达水平的试剂；
以及可选的：特异性检测磷酸化p65水平的试剂和/或特异性检测磷酸化STAT3水平的试剂。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性检测STK4蛋白表达水平的试剂是抗STK4蛋白的抗体；和/或
所述的特异性检测IL-6蛋白表达水平的试剂是抗IL-6蛋白的抗体；和/或
所述的特异性检测磷酸化p65水平的试剂是抗p-p65蛋白的抗体；和/或
所述的特异性检测磷酸化STAT3水平的试剂是抗p-STAT3蛋白的抗体。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：FACS流式细胞学检测试剂和/或酶联免疫吸附检测试剂。
8.特异性检测STK4蛋白表达水平的试剂和特异性检测IL-6蛋白表达水平，以及可选的特异性检测磷酸化p65水平或特异性检测磷酸化STAT3水平的试剂的用途，用于制备对肝癌分型、对肝癌分期或诊断肝癌转移的试剂盒。
9.一种诊断炎症相关肝癌的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)应用权利要求5-7任一所述的试剂盒检测受试者血浆、血清或外周血分离出的单核细胞中STK4蛋白表达水平和IL-6蛋白表达水平；以及可地联合检测磷酸化p65水平及磷酸化STAT3水平；
(2)分析各蛋白表达水平，若STK4蛋白显著性低表达和IL-6蛋白显著性高表达，以及可选地检测到磷酸化p65水平及磷酸化STAT3水平显著性高表达，表明受试者为炎症相关肝癌的高危人群或患者。
10.一种对肝癌分期或诊断肝癌转移的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)应用权利要求5-7任一所述的试剂盒检测受试者血浆、血清或外周血分离出的单核细胞中STK4蛋白表达水平和IL-6蛋白表达水平；
(2)分析各蛋白表达水平，若对比健康对照人群，STK4蛋白显著性低表达和IL-6蛋白水平小幅度提高表达，则表明肝癌为早期或中期肝癌；若对比健康对照人群，STK4蛋白无显著性降低，并且IL-6蛋白显著性高表达，则表明为晚期肝癌或发生癌转移。
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