CN104650234B - 抗akr1b10蛋白单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药生物技术领域，具体地说，涉及了一种抗人类肿瘤特异性抗原醛酮还原酶1B10（AKR1B10）蛋白的特异性单克隆抗体，以及由此开发的一种用于癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测的时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，具体地说，涉及了一种抗人类肿瘤特异性抗原醛酮还原酶1B10（AKR1B10）蛋白特异性单克隆抗体，以及用于癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测的时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）试剂盒。
背景技术
乳腺癌、肺癌、甲状腺癌和肝癌等癌症均是目前多发和常见的癌症，并且致死率非常高。目前还缺乏有效地针对乳腺癌、肺癌、甲状腺癌和肝癌患者的早期检测、疗效判断、预后评估或复发监测的方法。因此，急需新的特异性高、敏感性高、易操作的、对人体无危害、能在癌症发病的早期及时诊断、并且对于疗效判断、预后评估或复发检测等具有实用价值的靶标和检测评估方法。
通过本发明人研究，AKR1B10是一种人醛酮还原酶，可用于几种癌症病变的检测。AKR1B10在肺癌、肝癌、乳腺癌等肿瘤中高表达，促进肿瘤的生长并产生耐药性。通过抑制AKR1B10可以抑制肿瘤的生长，并增加肿瘤对化疗药物的敏感性。在肿瘤细胞中表达的AKR1B10可以分泌到血液中，使癌症病人血液中的AKR1B10蛋白水平升高。因此，通过检测血清中AKR1B10蛋白的水平，可以提示肿瘤的存在/复发，及抗癌治疗的效果。
发明内容
针对上述问题，我们针对人类原发性肿瘤组织中分离鉴定出来的一个特异性蛋白，即人类肿瘤特异性抗原醛酮还原酶1B10 (Aldo-Keto Reductase 1B10，AKR1B10)蛋白，开发出一种新的特异性单克隆抗体，并以此开发出一个灵敏、特异、高效的诊断试剂盒，用于癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。
具体而言，本发明涉及如下内容：
本发明涉及一种特异性识别AKR1B10的单克隆抗体及由此单克隆抗体开发的时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）试剂盒，用于血清、尿液、乳汁、肠液、大便或组织样本中的AKR1B10蛋白的检测。
本发明获得两株鼠源性单抗细胞株，即8-DC-1和9-DC-2，保藏号分别为CGMCCNo.9249和CGMCC No.9250，于2014年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）（保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），经检测存活。
1. 一种抗人类肿瘤特异性抗原醛酮还原酶1B10 (AKR1B10)蛋白的特异性单克隆抗体；所述单克隆抗体，其是保藏号为CGMCC No.9249、或CGMCC No.9250单抗细胞株所产生的单克隆抗体。
2. 一种含有所述的特异性单克隆抗体的用于癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测的试剂盒，其包含特异性检测AKR1B10的试剂。
3. 项2所述的试剂盒，其中，所述特异性检测AKR1B10的试剂是特异性识别AKR1B10蛋白的特异性单克隆抗体。
4. 项2-3中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂可用于检测血清、尿液、乳汁和肠液等体液，大便或组织样本中的AKR1B10蛋白。
5. 项2-4中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含AKR1B10蛋白标准品。
6. 项2-5中任一项所述的试剂盒，其中所述癌症选自下组：肝癌、肺癌、甲状腺癌和乳腺癌。
7. 项2-6中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒是时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）试剂盒及化学发光检测试剂盒。
8. 项7所述的试剂盒，其还包括：
包被有肿瘤特异性抗原AKR1B10特异性捕获单克隆抗体的时间分辨免疫荧光测定（TRFIA）板；
生物素标记的另一种属来源的AKR1B10的特异性检测抗体。该捕获单克隆抗体与检测抗体均可与AKR1B10蛋白结合，所述捕获抗体是AKR1B10蛋白免疫山羊后获得的AKR1B10多克隆抗体。
9. 项8所述的试剂盒，其还包括：
包被缓冲液(1×PBS，pH7.3±0.1)；
样品稀释液(1×PBS、1%BSA、0.05%NaN3，pH 7.3±0.1)；
封闭液(1×PBS、3% BSA)；
洗脱液PBST(1×PBS、0.05% Tween-20)；
Streptavidin-Eu。
10. 根据项8或9的试剂盒，其中AKR1B10蛋白免疫山羊后获得的AKR1B10多克隆抗体作为捕获抗体；检测抗体来自用全长AKR1B10抗原免疫鼠获得的纯化抗体。
11. 根据项2-10中任一项所述的试剂盒，其中所述筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测包括：
a) 利用所述特异性检测AKR1B10的试剂测量来自受试者的生物学样品中AKR1B10蛋白的水平；
b) 将a)中测得的水平与正常样品中的相应水平比较。
12. 根据项11的试剂盒，其中所述样品是血清、尿液、乳汁、肠液等体液，大便或组织样品。
13. 特异性检测AKR1B10蛋白的试剂在制备用于癌症筛查、早期诊断、疗效判断、预后评估或复发监测的试剂盒中的用途。
14. 根据项13所述的用途，其中，所述特异性检测AKR1B10的试剂是特异性识别AKR1B10蛋白的单克隆抗体。
本发明建立的检测AKR1B10的夹心时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）试剂盒及化学发光检测试剂盒，可适用于肝癌，肺癌、甲状腺癌和乳腺癌早期诊断和人群筛查、治疗效果判断、复发监测及预后评估等方面，具有快速、客观和准确性等优点。
早期诊断：当肿瘤还很小，没有转移，病人还没有临床症状，通过检测血清中AKR1B10蛋白的改变，进行诊断。肿瘤的早期诊断是提高治愈率，减少死亡率的关键。
指导治疗：检测接受治疗的肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌病人血清中AKR1B10蛋白的改变，可判断疗效。降低则有效，升高则预示病情恶化。
监测复发：定期检测已治愈的肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌病人血清中AKR1B10蛋白的改变，若升高则预示癌症复发。
判断预后：肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌病人血清中AKR1B10蛋白的水平往往与肿瘤的大小及瘤组织中AKR1B10的表达水平有关，二者均为预后不良的征兆。再有接受治疗的肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌病人血清中AKR1B10的变化，也预示治疗的效果及病人的预后。
附图说明
图1. 鼠源性AKR1B10单克隆抗体的特异性。此为用纯化的AKR1B10单克隆抗体进行Western blot以检测其特异性。M，蛋白分子量标记物；H460，肺癌细胞系（表达AKR1B10）；293T，胚胎肾细胞系（表达AR，但不表达AKR1B10）；AKR1B10，纯化蛋白；AR，纯化蛋白（AR与AKR1B10高度相似）。抗AKR1B10单克隆抗体具有高特异性，与AR蛋白无交叉反应。
图2：用抗AKR1B10 特异性单克隆抗体检测AKR1B10蛋白在人类肝癌组织中的表达。此为用人类肝癌组织切片进行免疫组织化学检测所得结果，表明用AKR1B10特异性单克隆抗体检测到AKR1B10蛋白。
图3：用抗AKR1B10 特异性单克隆抗体检测AKR1B10蛋白在人类甲状腺癌组织中的表达。此为用甲状腺癌组织切片进行免疫组织化学检测所得结果。表明用AKR1B10特异性单克隆抗体检测到AKR1B10蛋白。
图4：用抗AKR1B10 特异性单克隆抗体检测AKR1B10蛋白在人类乳腺癌组织中的表达。此为用乳腺癌组织切片进行免疫组织化学检测所得结果。表明用AKR1B10特异性单克隆抗体检测到AKR1B10蛋白。
图5：用抗AKR1B10 特异性单克隆抗体检测AKR1B10蛋白在人类肺癌组织中的表达。此为用人类肺癌组织切片进行免疫组织化学检测所得结果。表明A用AKR1B10特异性单克隆抗体检测到AKR1B10蛋白。
图6：时间分辨免疫荧光测定（TRFIA）试剂盒的灵敏性。其中捕获抗体是AKR1B10蛋白免疫山羊后获得的AKR1B10多克隆抗体；检测抗体来自用全长AKR1B10抗原免疫鼠获得的纯化单克隆抗体。用纯化的、不同量AKR1B10蛋白作为待检样品，以确定最低检测灵敏度。
图7：正常人群和乳腺癌患者、肝癌患者血清中AKR1B10浓度。用上述TRFIA检测。
图8：肺癌患者血清中AKR1B10浓度分布。用上述TRFIA检测。
图9：甲状腺癌患者血清中AKR1B10浓度分布。用上述TRFIA检测。
具体实施方式
本发明涉及一种针对人类肿瘤特异性抗原醛酮还原酶1B10蛋白（以下简称为AKR1B10）的特异性单克隆抗体。AKR1B10蛋白是从人类原发性肿瘤组织中分离鉴定出来的。该蛋白质具有316个氨基酸 (Identification and characterization of a novel humanaldose reductase-like gene. Cao D, Fan ST, Chung SS. J Biol Chem. 1998 May 8;273(19):11429-35.)，在人类肝癌、肺癌、甲状腺癌和乳腺癌组织中明显高表达，在促进肿瘤细胞的生长、增值及侵润，以及在肿瘤的发生、发展中起极为重要的作用。
本发明涉及的抗AKR1B10蛋白特异性单克隆抗体，用免疫组织化学方法，该抗AKR1B10蛋白特异性单克隆抗体，能成功检测到AKR1B10在人类肝癌、肺癌、甲状腺癌和乳腺癌组织中的表达 (参见图1~图4)。
我们发现肿瘤细胞可分泌AKR1B10蛋白到外周血液循环中，在罹患肝癌、肺癌、甲状腺癌和乳腺癌的患者的血清中AKR1B10增加。因此AKR1B10可以作为新的肿瘤血清标记物，可用于肝癌、肺癌、甲状腺癌和乳腺癌的筛查、早期诊断、治疗指导，复发监测和预后判断。相反，我们发现人的正常肠上皮细胞可分泌AKR1B10到肠液、大便中，在肠液及大便中可检测到AKR1B10。
本发明提供的检测AKR1B10蛋白的试剂盒，包括特异性识别AKR1B10蛋白的单克隆抗体，该抗体被包被在固体载体上的。
本发明基于新开发的抗AKR1B10特异性单克隆抗体，利用夹心时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）技术建立了检测血清AKR1B10抗原的试剂盒，此试剂盒适用于肝癌、肺癌、肠癌、甲状腺癌及乳腺癌的早期诊断和大规模的人群筛查，并可用于指导治疗、判断预后以及监测复发病人。
本发明提供的检测AKR1B10抗原的夹心时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）试剂盒主要包括有：包被有捕获AKR1B10蛋白的特异性多克隆抗体的时间分辨免疫荧光测定（TRFIA）板；生物素标记的检测抗体(2μg/ml 鼠抗AKR1B10抗体)。捕获抗体与检测抗体均可与AKR1B10抗原结合。其中所述捕获抗体是AKR1B10蛋白免疫山羊后获得的AKR1B10多克隆抗体作为捕获抗体。
所述检测AKR1B10抗原的夹心时间分辨免疫荧光测定（TRFIA）试剂盒还包括有：包被缓冲液(1×PBS，pH7.3±0.1)；样本稀释液/抗体稀释液(1×PBS、1%BSA、0.05%NaN3，pH7.3±0.1)；封闭液(1×PBS、3% BSA)；洗脱液PBST(1×PBS、0.05% Tween-20)；辣根过氧化物酶(HRP)或Eu标记的Streptavidin；标准品(不同浓度AKR1B10纯抗原：0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 ng/ml)。
所述捕获抗体是AKR1B10蛋白免疫山羊后获得的AKR1B10多克隆抗体作为捕获抗体；检测抗体来自用全长AKR1B10抗原免疫鼠所获得的鼠源性单克隆抗体。
本发明的另一个目的是提供上述试剂盒的制备方法。
一种制备上述检测AKR1B10抗原的夹心时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）试剂盒的方法，包括以下步骤：
用包被缓冲液将捕获抗体稀释成7-10 μg/ml，在时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）板的每孔中加入100μl上述抗体稀释液，4ºC过夜；取出，置于37ºC 30分钟；甩去液体，用PBST洗涤5次；空干，每孔加入100 μl封闭液，37ºC 2小时；甩去液体，用PBS洗2次；在室温下，自然风干2小时；用锡箔纸真空密封，放于4ºC，备用。
使用时，将血清样本1:10稀释，每孔加入100μl稀释血清和标准品(0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20ng/ml AKR1B10纯蛋白稀释品)，37 ºC孵育1小时。去除样本液，用PBST洗5次，用Antibody/Conjugate buffer稀释生物标记的兔抗AKR1B10抗体(1:500)，然后每孔加入100μl抗体稀释液，37 ºC孵育1小时。去除抗体液，用PBST洗5次，用Antibody/Conjugate buffer稀释Streptavidin-EU(1:5000)，然后每孔加入100μl稀释液，37ºC孵育1小时。去除Streptavidin-Eu稀释液，用PBST洗5次，每孔加入100μl Stop solution终止反应，读取OD值。以标准品制作标准曲线，计算出稀释血清中AKR1B10的浓度，然后将浓度乘以10，得到血清样本中的终浓度。
任选地，该试剂盒还可以包含下述：与正常或疾病样本产生的信号相关的信息、标准化材料、如用于对照的来自正常和/或疾病样本的AKR1B10蛋白标准品、适当的酶、缓冲液和溶液。任选地，所述试剂盒还可包含任何描述如何实施本发明方法的说明书、任选地提供用于解析实施本发明方法时获得的结果的标准图、数据和软件。
实施例
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实验中使用的试剂购自西格玛奥德里奇中国公司（Sigma-Aldrich Co. LLC）。
实施例1: 鼠源性抗AKR1B10蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备
用纯化的AKR1B10全长蛋白抗原1.0mg，加入等体积弗氏佐剂，以便增强抗原的特异性免疫反应，用5ml注射器将上述混合物反复抽吸进行乳化，达到有油包水的状态。选用2只6-8周龄的健康雄性,分三次免疫,300 μL/只,每次将乳化好的AKR1B10特异抗原注射到小鼠皮下与腹腔,每隔2周进行一次免疫,免疫剂量和途径均不变,细胞融合前3天,将抗原与PBS直接混合不添加任何佐剂,直接注射到小鼠腹腔进行加强免疫。然后，无菌条件下,取出已取血的小鼠脾脏,研磨成细胞悬液,置于50 mL离心管中,室温 1,400 r/min 离心 3min。弃上清,用10 mL红细胞裂解液将脾细胞重悬,混勾后,静置l0min,再直接加入15 mLMD6无血清培养基终止红细胞裂解,室温,1,400 r/min,离心3 min。弃上清,用10 mL MD6无血清培养基将脾细胞重悬,混匀后吸取少许用台盼蓝染色,加入细胞计数板,于倒置显微镜上计数，与黑色素瘤细胞按1:1~5:1的比例混匀,室温,1,400/min,离心3 min。弃上清,轻轻弹击离心管底使两种细胞沉淀松动,45s内沿离心管内壁加入1.2 mL的PEG细胞融合剂,边加边转动离心管,使PEG充分接触细胞。加入45 mL已37°C预热的MD6无血清培养基,终止PEG的作用,缓慢颠倒离心管2~3次,37℃下静置5 min。室温,1,400 r/min,离心3 min。弃上清,于96孔细胞培养板中37℃，5%C02培养。第10天即可观察杂交瘤细胞的生长状态,若观察到明显的单个细胞集落，即可取杂交瘤细胞培养上清液, 使用间接ELISA方法进行抗AKR1B10抗体检测,筛选选能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。进一步使用有限稀释法获得分泌针对单一表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明获得两株鼠源性单抗细胞株，即8-DC-1和9-DC-2，保藏号分别为CGMCC No.9249和CGMCC No.9250。然后，用使用蛋白G亲和层析方法纯化单克隆抗体，透析、定量。此两株单克隆细胞株及其产生的抗体具有高活性及高AKR1B10特异性。特别地，此单克隆抗体可以作为检测抗体，用于夹心时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）试剂盒，进行AKR1B10蛋白检测。
实施例2: 制备检测AKR1B10蛋白的夹心时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）试剂盒
实施例1中所获得的单克隆抗体（即从保藏的8-DC-1和9-DC-2细胞株提取纯化AKR1B10单克隆抗体）用作检测抗体，并用生物素标记；用野生型全长AKR1B10蛋白免疫山羊后获得的AKR1B10多克隆抗体作为捕获抗体，构建夹心时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）试剂盒。本发明获得的捕获抗体和检测抗体的灵敏度和特异性都很强，如图5所示，时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）可检测到0.3125ng/ml的AKR1B10蛋白。其中生物素标记试剂盒购自Pierce 公司。Streptavidin-Eu购自Perkin Elmer 公司。检测AKR1B10的时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）板自制，制备方法如下：用包被缓冲液将捕获抗体稀释成7-10 μg/ml，在时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）板的每孔中加入100μl上述抗体稀释液，4ºC过夜；取出，置于37ºC 30分钟；甩去液体，用PBST洗涤5次；空干，每孔加入250 μl封闭液，37ºC 2小时；甩去液体，用PBS洗2次；在室温下，自然风干2小时；用锡箔纸真空密封，放于4ºC，备用。所用试剂自配：包被缓冲液(1×PBS，pH7.3±0.1)；样本稀释液/抗体稀释液(1×PBS、1%BSA、0.05%NaN3，pH 7.3±0.1)；封闭液(1×PBS、3% BSA)；洗脱液PBST(1×PBS、0.05% Tween-20)；检测抗体(1μg/ml 鼠抗AKR1B10抗体)；标准品(不同浓度AKR1B10抗原：0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 ng/ml)。
实施例3：正常人群和乳腺癌患者、肝癌患者血清中AKR1B10浓度
血清样本的检测：血清样本用PBS以1:10稀释，每孔加入100 μl样品稀释液或标准品(不同浓度AKR1B10抗原：0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 ng/ml)，37ºC，60分钟；甩去液体，用洗涤缓冲液洗涤5次，空干；检测抗体用抗体稀释液以1:500稀释，每孔加入100 μl检测抗体稀释液，37ºC，60分钟；甩去液体，用洗涤缓冲液洗涤5次，空干；Streptavidin-Eu用抗体稀释液以1:80000稀释，每孔加入100 μl Streptavidin-Eu稀释液，37ºC，60分钟；甩去液体，用洗涤缓冲液洗涤5次，空干；100 μl加入反应液；用酶标仪以450 nm波长测定OD值。绘制标准曲线，根据标准曲线，计算出血清样本中AKR1B10的浓度，并×10，得到血清AKR1B10终浓度。
检测结果分析
选取100例健康人、35例乳腺癌患者和40例原发性肝癌患者进行血清样本检测，结果用Graphpad 4.0统计学软件进行分析。t检验结果显示，平均AKR1B10抗原水平在两组人群中有显著性统计学差异(p < 0.001)。在这100例正常人群中，血清AKR1B10的浓度平均为150pg/ml，乳腺癌患者血清AKR1B10的浓度为812 pg/ml，肝癌患者血清AKR1B10的浓度为1102pg/ml。
实施例4: 肺癌与甲状腺癌患者血清中AKR1B10浓度
采用与实施例4相同的方法检测血清样本，选取50位肺癌患者30例甲状腺癌患者进行血清样本检测，结果用Graphpad 4.0统计学软件进行分析。t检验结果显示，平均AKR1B10抗原水平在肺癌与甲状腺癌患者中明显高于正常人群(p < 0.001) （图7和8）。
本发明发现了一种新的AKR1B10蛋白作为一种肿瘤血清标记物，该AKR1B10蛋白具有很强的肝癌、肺癌、甲状腺癌及乳腺癌特异性。本发明提供了检测血清、肠液中AKR1B10抗原的实验方法和夹心时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）试剂盒。本发明所述方法的特异性强，本底水平低。此外本发明所述的夹心时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）试剂盒的灵敏度高，可检测到0.03125ng/ml AKR1B10。另外本发明所述方法简单快捷。整个实验操作对于实验仪器和试剂的要求都不高，在一般实验室均可进行，其准确度高，结果由酶标仪定量分析，排除了主观性。
Claims (4)
1.一种抗人类肿瘤特异性抗原醛酮还原酶1B10 (Aldo-Keto Reductase 1B10，AKR1B10)蛋白的特异性单克隆抗体在制备用于癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测的试剂盒中的应用，其中所述抗体是保藏号为CGMCC No.9249、或CGMCC No.9250单抗细胞株所产生的单克隆抗体；所述癌症选自肝癌、肺癌、甲状腺癌和乳腺癌；并且所述试剂盒是检测血清样本中的AKR1B10蛋白。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒是时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）试剂盒、或化学发光检测试剂盒。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，进一步包括：
包被有肿瘤特异性抗原AKR1B10特异性捕获多克隆抗体的时间分辨免疫荧光测定（TRFIA）板；所述特异性捕获多克隆抗体是用野生型全长AKR1B10蛋白免疫兔后获得的AKR1B10多克隆抗体，
生物素标记的所述的AKR1B10的特异性单克隆抗体作为检测抗体。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其还包括：
包被缓冲液：1×PBS，pH7.3±0.1；
样品稀释液：1×PBS、1%BSA、0.05%NaN3，pH 7.3±0.1；
封闭液：1×PBS、3% BSA；
洗脱液PBST：1×PBS、0.05% Tween-20；
Streptavidin-Eu。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测包括：
a) 利用所述特异性单克隆抗体测量来自受试者的血清样本中AKR1B10蛋白的水平；
b) 将a)中测得的水平与正常样品中的相应水平比较。
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