CN102586189A - 一种循环肿瘤细胞特异性富集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富集循环肿瘤细胞的方法，(a)根据所需制备肿瘤细胞表面受体的一抗和二抗；(b)固定肿瘤细胞表面受体二抗；(c)孵育一抗与待测样品；(d)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞。本发明方法操作简单，只需对二抗进行固定，通过固定的二抗捕获孵育的循环肿瘤细胞；富集方便快速，操作过程只需45分钟；富集后可快速检测，通过富集可以应用于体液中循环肿瘤细胞基因突变检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种循环肿瘤细胞特异性富集方法。
背景技术
癌症是导致人类死亡的最主要死因之一，世界卫生组织(WHO)的数据显示，2008年全球癌症新发病例约为1270万，癌症死亡例数为760万。目前全球每年新增癌症患者约为900万人，预计到2020年全世界癌症发病率将比现在增加50％，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。目前全世界发病率最高的癌症是肺癌，依次是乳腺癌，是肠癌、胃癌、肝癌和宫颈癌。中国是世界上癌症发病率和死亡率最高的国家之一，全世界有20％的新发癌症病人在中国，有1/4的癌症死亡病人在中国。
癌症的发病是源于机体的某些器官或组织，癌症的发生开始于单个癌细胞，单癌细胞不断的分裂、增值、分化就可以产生一小团癌细胞而形成肿瘤。当肿瘤生长到一定体积时，癌细胞就会脱落，并通过血管或淋巴管扩散到机体的其它组织或器官，这会形成癌症转移。癌细胞进入血液循环是实现肿瘤转移的最初阶段，为最终形成肿瘤的转移病灶提供了可能。循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)是指进入人体外周血的肿瘤细胞。通过检测外周血中的肿瘤细胞可以有效预测肿瘤转移的发生。大多数的癌症患者致死的主要原因是肿瘤细胞获得转移能力，通过血液扩散到其他器官或组织。因此在血液中检测循环肿瘤细胞具有重要的临床应用价值，CTCs的检测对于临床早期筛查和诊断、监测病情、治疗预后等具有重要意义。
多项研究显示，检测乳腺癌患者的CTCs有利于更精确的分期和病情评估，有助于乳腺癌早期诊断，复发转移监控。传统乳腺癌的临床病理分期和肿瘤细胞分化分级的方法，可以大致反映不同病人术后生存率的差别，但这些临床病理特征并不能准确病理分期、预测转移复发和病人预后。检测乳腺癌患者的CTCs可以更精确的进行临床病理分期和病情评估。此外，检测CTCs是用于评估乳腺癌患者预后的主要指标之一，CTCs能有效预测和监测辅助治疗的效果，对CTCs状态及生物学特性进行分析，可为乳腺癌辅助治疗方案的选择提供更多依据(Bauernhofer et al.，Oncol Rep，13(2)，2005；Cristofanilli，SeminOncol，33(3Suppl 9)2006)。
对于前列腺癌患者，CTCs是一个重要的预后因子。Shaffer等人(Shaffer et al.，ClinCancer Res，13(7)，2007)的研究显示超过65％转移性前列腺癌患者CTCs大于5，CTCs大于5患者的中位生存时间小于1年；而CTCs小于5患者的中位生存时间则大于4年。Olmos等人(Olmos et al.，Ann Oncol，20(1)，2009)的研究得出了相似的研究结论，所研究的191例前列腺癌患者治疗前和治疗后CTCs数与总生存时间的关系。结果表明CTCs大于5患者的总生存时间只有19.5个月，而CTCs小于5患者的总生存时间超过30个月。因此，检测CTCs可以有效地用于前列腺癌的治疗及生存预后，有助于临床医生为前列腺癌患者制定科学的治疗方案。
研究表明对于肺癌和结直肠癌等癌症患者，CTCs可作为预后判断重要指标之一。研究发现结直肠肿瘤患者在手术之后，通过检测CTCs的数量能较为准确地预测肿瘤的复发和预后(Sergeant，et al.J Surg Res，150(1)，2008)。另一项研究表明，手术后的非小细胞癌患者外周血CTCs检测阳性，与患者发生复发性及临床预后密切相关。进一步表明检测CTCs对于包括肺癌和结肠癌在内的多种癌症具有重要的临床应用价值，可以用于临床病理分期、病情监测、病情评估及治疗预后。
此外，大多数癌症的筛查、早期诊断、治疗预后及个体化诊疗都面临获取病理样本较难，即使可以取得病理组织样本，一般样本量都较少，在少样本量检测和评估下，会导致漏检和假阴性的发生。不能满足临床筛查，诊断和检测的实际需求，从而使肿瘤患者错失了最佳的治疗时期。众所周知，血液检测不需肿瘤组织标本、技术相对简单、小创伤、便于在同一患者多次重复进行，易于被患者接受，对于临床具有更重要的应用价值。如果可以从外周血或淋巴液等体液中捕获癌细胞，就可以解决临床晚期患者无病理样本，或病理样本少的问题，可以为临床医生的诊疗，化疗预后提供快速科学的参考依据。
目前的CTCs的检测技术主要有免疫磁珠分选法和密度梯度离心法。免疫磁珠分选法(如CN201110005376.8，一种从组织中分离富集靶细胞的方法；循环肿瘤细胞的检测及其在乳腺癌患者中的临床应用，马德亮等，临床肿瘤学杂志，2010年11月第15卷第11期；循环肿瘤细胞的检测，李帅等，医学综述，2010年3月第16卷第6期)的基本原理是将磁珠作为抗体载体形成抗体磁珠复合物，其与细胞特异性抗原结合后形成抗原抗体磁珠复合体，该复合体在外加磁场的作用下发生移动并与其他非选择物分离，从而达到分离细胞的目的。免疫磁珠分离方法虽然可以较好地进行CTCs的分离和富集，但是该方法的费用较高，操作较复杂，不能满足临床快速检测和实际检测的需求。密度梯度离心法(如CN97195305.8，富集稀少细胞的方法)具有操作相对简单，可操作性强，经济实用，然而多次离心可造成CTCs的破坏和损失，检测的敏感性相对不足，无法特异性识别肿瘤细胞，细胞回收率只有40％-65％，其富集的敏感性远达不到临床的检测的实际需求。因此，临床上迫切需要开发一种灵敏度高，经济适用，操作性强，简单实用的CTCs富集检测技术，以实现采用特异性的检测方法对CTCs进行富集和检测。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，提供一种快速、操作简便、经济实用的CTCs富集和检测方法。
一种富集循环肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：
(a)根据所需制备肿瘤细胞表面受体的一抗和二抗；
(b)固定肿瘤细胞表面受体二抗；
(c)孵育一抗与待测样品；
(d)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞；
或包括以下步骤：
(A)根据所需制备肿瘤细胞表面受体的一抗；
(B)固定肿瘤细胞表面受体一抗；
(C)孵育待测样品；
(D)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞。
其中，所述的肿瘤细胞的表面受体包括EGFR、VEGFR、FGFR或PDGFR等，这些表面受体的第一抗体可以通过商业购买得到，也可以自制。
其中，所述步骤b或步骤B的固定为将二抗或一抗固定在聚苯乙烯或聚丙烯材料的固相载体上或其它现有的固相载体上。固定的固相载体可以选用聚苯乙烯或聚丙烯材料的酶标板，酶标板可以为96孔，48孔或12孔板，其中任意一种。
抗体和固相载体的固定方法有多种，较佳地，本发明的一抗或二抗按如下步骤进行操作进行固定：
(a)酶标板使用前用PBS冲洗，将一抗或二抗用H缓冲液(pH 9.6)稀释为3-10μg/mL，加入酶标板中；
(b)盖上膜板包被4℃10-15小时，或37℃放置1-2小时；
(c)弃去包被液用PBST洗涤液洗涤1次，轻拍孔板使洗涤液甩干；
(d)每孔中加入200μL封闭液封板，在37℃放置1小时；
(e)甩去孔板里面的溶液，用PBST洗涤2次后拍干，置于4℃保存备用。
在本发明中，所述的一抗可以单克隆抗体或者多克隆抗体。
在本发明的较佳实施例中，所述的一抗为兔抗人细胞表面受体。
在本发明的较佳实施例中，所述的二抗为羊抗兔一抗的抗体。
在本发明的较佳实施例中，步骤d或步骤D之后，还包括步骤(e)循环肿瘤细胞的检测。例如，采用荧光PCR检测。
本发明另一方面提供了用于孵育一抗与循环肿瘤细胞的方法，步骤c的操作为：将一抗用PBS液稀释，调整其浓度为2-10μg/mL，取50μL加入到经Red Cell Lysis液处理的待检测患者血液的离心管中，混匀、37℃下微震荡孵育10-20分钟，使之充分接触；将上述孵育后的血液转移到第二抗体固定的酶标板内。
其中，处理血液的方法包括：加入Red Cell Lysis液后，再加入福尔马林或70％乙醇溶液。
本发明另一方面提供了用于检测富集的循环肿瘤细胞的EGFR基因突变的方法，检测的试剂盒包括如下体系：
所述引物和探针序列包括：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：24。
本发明方法设计运用CTCs的表面特有表面抗原作为靶标，通过其对应的抗体识别结合CTCs表面抗原，使其变为带“锚”的肿瘤细胞，然后通过固相载体固定化表面受体的第二抗体，特异性捕获“锚肿瘤细胞”，达到分离的目的。并采用高灵敏的PCR检测方法高灵敏的检测试剂盒检测。
本发明的CTCs富集方法特异性强，高效快速、操作简便、经济实用，所用检测方法灵敏度高，检测效率高，同时具备了特异性富集、高灵敏检测、简单实用、快速准确等特点。实现CTCs的特异性捕获和高灵敏检测的优势双重结合。
本发明的有益效果是：本发明建立了一种特异性富集循环肿瘤细胞的方法，此方法(1)可以在血液，淋巴液或胸腔积体液中快速高效富集循环肿瘤细胞；(2)操作简单，只需对一抗或二抗进行固化，通过固化的二抗捕获循环肿瘤细胞；(3)富集方便快速，操作过程只需45分钟；(3)富集后可快速检测，通过富集可以快速应用于循环肿瘤细胞基因突变检测；(4)特异性强，可以特异性富集血液中的肿瘤细胞。(5)成本比磁珠分离法低。(6)整个富集和检测方法灵敏度高，其最低检测限可以检测出5个肿瘤细胞每5ml的血液中。
附图说明
图1为富集循环肿瘤细胞的原理模式图
图2为实施例1的操作示意图。
图3为实施例中3个不同细胞浓度下检测的PCR图。
具体实施方式
本发明通过循环肿瘤细胞表面抗原制备其特异性抗体，基于抗原和抗体的特异性亲和力来捕获CTCs。其基本原理是将固相载体作为二抗的载体形成二抗载体复合物，将一抗作为循环肿瘤细胞表面特异性抗原识别体形成一抗细胞结合物，即形成为“锚肿瘤细胞”，二抗载体复合物可以特异结合一抗，在一定条件通过特异亲和力形成二抗一抗细胞复合体，从而实现捕获CTCs，达到分离细胞的目的。然后通过高灵敏的检测方法对富集的肿瘤细胞进行检测，实现了对CTCs的特异性捕获和高灵敏检测。CTCs富集及检测方法包括如下步骤：
(1)制备细胞肿瘤细胞表面受体一抗和二抗
(a)兔抗人细胞表面受体一抗的制备
将200μg抗原溶入1mL的PBS缓冲溶液中，取上述抗原1mL加常规的1mL完全福氏佐剂，剧烈震荡使之充分乳化，制得抗原乳化液。取上述乳化的抗原对兔进行后背皮下注射，每点注射量约为500μL。首次免疫后，每2-3周注射抗原加强免疫，并在末次免疫后的7-14天收集血液。收集的血液置于37℃恒温箱放置下半小时左右，在4℃放置过夜后，在4℃，10000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，将上述抗血清用亲和柱层析进行纯化，得到第一抗体，后贮于-20℃以下冰箱保存备用。
(b)羊抗兔二抗的制备
将上述得到一抗经过纯化之后，取400ug作为抗原溶入3mL的PBS缓冲溶液中，将其等比例的与完全福氏佐剂混合乳化后，注射于绵羊后腿肌肉。两周后，按照相同的方法再免疫一次。末次免疫后两周，采血。采集的血液置于37℃恒温箱放置下半小时，然后在4℃，10000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，将上述抗血清用亲和柱层析进行纯化，得到纯的羊抗兔第二抗体，后贮于-20℃以下冰箱保存备用。
其中所述细胞表面受体可以为(a)表面生长因子受体(Epidermal Growth FactorReceptor，EGFR)；(b)血管内皮生长因子受体(Vascular Endothelial Growth FactorReceptor，VEGFR)；(c)成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor receptor，FGFR)；(d)人血小板衍生生长因子受体(Platelet-Derived Growth Factor Receptor，PDGFR)。
(2)固定细胞表面受体二抗
采用聚苯乙烯或聚丙烯材料的固相载体作为第二抗体的载体，通过二抗的Fc端与固相载体一定条件下结合形成二抗载体复合物，其形成二抗载体复合物的过程称为固定。固定的固相载体可以选用聚苯乙烯或聚丙烯材料的酶标板，酶标板可以为96孔，48孔或12孔板，其中任意一种。将纯化后的抗体按如下步骤进行操作进行固定：
(f)酶标板使用前用PBS冲洗，将二抗用H缓冲液(pH 9.6)稀释为3-10μg/mL，加入酶标板中；
(g)盖上膜板包被4℃，放置6-24小时，或37℃放置1-2小时；
(h)弃去包被液用PBST洗涤液洗涤1次，轻拍孔板使洗涤液甩干；
(i)每孔中加入200μL封闭液封板，在37℃放置1-2小时；
(j)甩去孔板里面的溶液，用PBST洗涤2次后拍干，置于4℃保存备用；
所述溶液配制如下：
PBS液：1.2g Na2HPO4，0.1g KCl，0.1g K3PO4，4.0g NaCl，
调整pH至7.4，定溶于500mL超纯水中，
封闭液：PBS液加5％BSA；
PBST洗涤液：PBST(pH 7.4+0.05％吐温20)；
H缓冲液：3.0g Na2CO3，6.0g NaHCO3，溶解于1000mL超纯水中，调整pH至9.6；
(3)孵育一抗和循环肿瘤细胞
制备的一抗可以特异性识别循环肿瘤细胞表面特有的抗原，并通过抗原和抗体间的亲和力，实现特异性结合，形成一抗肿瘤细胞结合体，从而使肿瘤细胞变为带“锚”肿瘤细胞。按如下实施步骤孵育包被“锚肿瘤细胞”：
取5mL的含肿瘤细胞的血液加入Red Cell Lysis溶液(具体操作步骤按试剂盒说明书操作)，离心后弃上清液，加入3ml的PBS溶液；将上述制备的兔抗人表面受体的一抗用PBS液稀释，调整其浓度为2-10μg/mL，取50μL加入经Red Cell Lysis液处理的待检测患者血液的离心管中，混匀、37℃下微震荡孵育10-20分钟，使之充分接触。
(4)捕获“锚肿瘤细胞”
将经步骤(3)处理孵育后的血液转移到经步骤(2)处理的带有固定二抗的酶标板内。在37℃下孵育30-40分钟，使其充分反应结合；反应后移去多余血液，然后用PBST洗涤1次；通过抗原抗体的特异性亲和力“锚肿瘤细胞”即被捕获，如图1所示。待洗毕后，采用步骤5所述的荧光PCR方法检测。
(5)检测循环肿瘤细胞
(a)富集细胞DNA的提取：
经PBST洗涤后，加入蛋白酶K和Buffer ATL，56℃消化裂解1小时，加入200mL BufferAL混匀再加入200μL无水乙醇充分混匀；将上清小心转移到QIA 2mL离心柱中，6000×g(8000rpm)离心1min，加入500μL Buffer AW1，6000×g(8000rpm)离心1min，小心打开盖子加入500μL Buffer AW2，6000×g(8000rpm)离心1min，空管离心20000×g(14000rpm)离心3min，加入100μL Buffer ATE于膜中央，温育5分钟，20000×g(14000rpm)离心1min。
所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L，pH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L，pH 8.0)调整DNA浓度2ng/μL作为PCR扩增的模板。
(b)荧光PCR扩增体系
根据检测目的之不同设计不同的探针及引物进行检测，提取的DNA模板后，应于如下实时荧光PCR进行扩增，荧光PCR扩增体系为：
所述荧光PCR的反应条件是95℃预变性5分钟，15个循环；94℃变性15秒，66℃退火40秒，72℃延伸10秒，35个循环；94℃变性15秒，56℃退火40秒，72℃延伸10秒，35个循环，后35个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。
检测FAM和HEX荧光信号的Ct值，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct＞16)时表明上样DNA的量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值为0或31：阴性；Ct小于30：阳性。
下面结合实施例，来对本发明检测体系进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学技术术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。
实施例1
本实施例以肿瘤细胞表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)为特异性结合靶点，以EGFR为抗原制备第一抗体及第二抗体，以肿瘤细胞H1975和健康人血液为介质捕获肿瘤细胞为例，对本发明富集和检测体系作进一步阐述和验证。富集和检测的方法包括以下步骤：
1.制备EGFR一抗及二抗
(a)兔抗人EGFR一抗的制备
将200μg抗原溶入1mL的PBS缓冲溶液中，取上述抗原1mL加常规的1mL完全福氏佐剂，剧烈震荡使之充分乳化，制得抗原乳化液。取上述乳化的抗原对兔进行后背皮下注射，注射量约为500μL。首次免疫后，每2-3周注射抗原加强免疫，并在注射后的7-10天收集血液。收集的血液置于37℃恒温箱放置下半小时，放置4℃过夜；然后于4℃，10000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，将上述抗血清用亲和柱层析进行纯化，后贮于-20℃以下冰箱保存。
(b)羊抗兔EGFR二抗的制备
将上述得到一抗经过纯化之后，取400ug作为抗原溶入3mL的PBS缓冲溶液中，将其等比例的与完全福氏佐剂混合乳化后，注射于绵羊后腿肌肉。两周后，按照相同的方法再免疫一次。末次免疫后两周，采血。采集的血液置于37℃恒温箱放置下半小时左右；然后在4℃，10000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，将上述抗血清用亲和柱层析进行纯化，后贮于-20℃以下冰箱保存。
2.固定表面受体二抗
以聚苯乙烯或聚丙烯材料制得的96孔酶标板为固定的固相载体，包被前用PBS冲洗酶标板1次，按如下步骤操作进行包被：
(a)将EGFR二抗用H缓冲液(pH 9.6)稀释的为5μg/mL的工作液；每孔加200μL的抗体工作液于酶标板中；
(b)盖上膜板在4℃包被孵育12小时；
(c)弃去包被液用PBST洗涤液洗涤1次，轻拍孔板使洗涤液甩干；
(d)每孔中加入200μL封闭液封板，37℃放置1小时；
(e)甩去孔板里面的溶液，用PBST洗涤2次后拍干，室温晾干，4℃保存备用；
所述溶液配制如下：
PBS液：1.2g Na2HPO4，0.1g KCl，0.1g K3PO4，4.0g NaCl，溶于500mL超纯水中，调整pH至7.4；
封闭液：PBS液加5％BSA；
PBST洗涤液：PBS加0.05％吐温20(pH 7.4)；
H缓冲液：3.0g Na2CO3，6.0g NaHCO3，溶于1000mL超纯水中，调整pH至9.6；
3.孵育一抗和H1975肿瘤细胞
取人工培养的对数生长期肿瘤细胞H1975，用细胞计数板计数后，确定初始细胞数为105/mL，经10倍梯度稀释，调整细胞数分别为104/mL，103/mL和102/mL。将上述3个浓度的稀释细胞各取50uL，分别加入到含有5mL健康人血(EDTA抗凝)的离心管中，微振荡混合均匀。同时，将上述104/mL，103/mL和102/mL 3个浓度的稀释细胞各50uL，分别加入到5mL的PBS溶液中，微振荡混合均匀，作为阳性对照。以不含肿瘤细胞的健康人各取50uL加到5mL血液，作为阴性对照。
分别取上述血液5mL的加入Red Cell Lysis溶液(具体操作步骤按试剂盒说明书操作)，离心后弃上清液，加入3ml的PBS溶液；将上述制备的兔抗人表面受体的一抗用PBS液稀释，调整其浓度为2-10μg/mL，取50μL加入经Red Cell Lysis处理后的待检测血液的离心管中，混匀、37℃下微震荡孵育10-20分钟，使之充分接触。
4.捕获“锚肿瘤细胞”
将上述步骤(3)孵育的一抗血液分别转移到经步骤(2)固定的二抗酶标板内，在37℃下孵育30分钟，继续反应，反应后移去多余血液，然后用PBST洗涤1次，如图2所示。待洗毕后，采用步骤5所述的荧光PCR方法检测。
5.检测循环肿瘤细胞
(a)循环肿瘤细胞DNA的提取：
经PBST洗完后，加入蛋白酶K和Buffer ATL，56℃消化裂解1小时，加入200mL BufferAL混匀再加入200μL无水乙醇充分混匀；将上清小心转移到QIA 2mL离心柱中，6000×g(8000rpm)离心1min，加入500μL Buffer AW1，6000×g(8000rpm)离心1min，小心打开盖子加入500μL Buffer AW2，6000×g(8000rpm)离心1min，空管离心20000×g(14000rpm)离心3min，加入100μL Buffer ATE于膜中央，温育5分钟，20000×g(14000rpm)离心1min。
所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L，pH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L，pH 8.0)调整DNA浓度2ng/μl作为PCR扩增的模板。
(b)PCR扩增体系
将上述所提DNA样本应于如下实时荧光PCR进行扩增，所述扩增引物为特异引物，探针为新型双环探针，引物和探针序列见表2.EGFR的荧光PCR扩增体系为：
所述荧光PCR的反应条件是95℃预变性5分钟，15个循环94℃变性15秒，66℃退火40秒，72℃延伸10秒，35个循环94℃变性15秒，56℃退火40秒，72℃延伸10秒，31个循环，后31个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。
采用Mx3000P荧光PCR扩增仪，检测FAM和HEX荧光信号的Ct值，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果：检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以HEX信号达到设定阈值(Ct＞16)时表明上样DNA量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值为0或31：阴性；Ct小于30：阳性。
实验结果表明，在含有肿瘤细胞的血液可以检测出含有肿瘤细胞，其最低检测限可以检测出5个肿瘤细胞每5ml的血液中，检测结果见图3。表明该方法具有很好的富集效果，可以满足临床检测实际的需求。
表1 EGFR突变特异性引物和探针核苷酸序列
实施例2
本实施例和实施例1基本相同，所不同的是，本实施例中，只有一抗，而无二抗。
1.制备EGFR一抗
(a)兔抗人EGFR一抗的制备
将200μg抗原溶入1mL的PBS缓冲溶液中，取上述抗原1mL加常规的1mL完全福氏佐剂，剧烈震荡使之充分乳化，制得抗原乳化液。取上述乳化的抗原对兔进行后背皮下注射，注射量约为500μL。首次免疫后，每2-3周注射抗原加强免疫，并在注射后的7-10天收集血液。收集的血液置于37℃恒温箱放置下半小时，放置4℃过夜；然后于4℃，10000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，将上述抗血清用亲和柱层析进行纯化，后贮于-20℃以下冰箱保存。
2.固定表面受体一抗
以聚苯乙烯或聚丙烯材料制得的96孔酶标板为固定的固相载体，包被前用PBS冲洗酶标板1次，按如下步骤操作进行包被：
(a)将EGFR一抗用H缓冲液(pH 9.6)稀释的为5μg/mL的工作液；每孔加200μL的抗体工作液于酶标板中；
(b)盖上膜板在4℃包被孵育12小时；
(c)弃去包被液用PBST洗涤液洗涤1次，轻拍孔板使洗涤液甩干；
(d)每孔中加入200μL封闭液封板，37℃放置1小时；
(e)甩去孔板里面的溶液，用PBST洗涤2次后拍干，室温晾干，4℃保存备用；
所述溶液配制如下：
PBS液：1.2g Na2HPO4，0.1g KCl，0.1g K3PO4，4.0g NaCl，溶于500mL超纯水中，调整pH至7.4；
封闭液：PBS液加5％BSA；
PBST洗涤液：PBS加0.05％吐温20(pH 7.4)；
H缓冲液：3.0g Na2CO3，6.0g NaHCO3，溶于1000mL超纯水中，调整pH至9.6；
3.孵育检测样品
取血液5mL的加入Red Cell Lysis溶液(具体操作步骤按试剂盒说明书操作)，离心后弃上清液，加入2-3ml的PBS溶液后混匀。将处理后的血液转移到经步骤(2)固定的酶标板内，在37℃下孵育20-30分钟，继续反应。待洗毕后，采用步骤4所述的荧光PCR方法检测。
4.检测循环肿瘤细胞
同实施例1。
Claims (9)
1.一种富集循环肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：
(a)根据所需制备肿瘤细胞表面受体的一抗和二抗；
(b)固定肿瘤细胞表面受体二抗；
(c)孵育一抗与待测样品；
(d)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞；
或包括以下步骤：
(A)根据所需制备肿瘤细胞表面受体的一抗；
(B)固定肿瘤细胞表面受体一抗；
(C)孵育待测样品；
(D)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞。
2.如权利要求1所述的一种富集循环肿瘤细胞的方法，其特征在于：表面受体包括EGFR、VEGFR、FGFR或PDGFR。
3.如权利要求1所述的一种富集循环肿瘤细胞的方法，其特征在于：所述步骤b或步骤B的固定为将二抗或一抗固定在聚苯乙烯或/和聚丙烯材料的固相载体上。
4.如权利要求1所述的一种富集循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，二抗或一抗按如下步骤进行固定：
(a)酶标板使用前用PBS冲洗，将一抗或二抗用缓冲液稀释为3-10μg/mL，加入酶标板中；
(b)盖上膜板包被4℃10-15小时，或37℃放置1-2小时；
(c)弃去包被液用PBST洗涤液洗涤1次，轻拍孔板使洗涤液甩干；
(d)每孔中加入200μL封闭液封板，在37℃放置1小时；
(e)甩去孔板里面的溶液，用PBST洗涤2次后拍干，置于4℃保存备用。
5.如权利要求1所述的一种富集循环肿瘤细胞的方法，其特征在于：所述的一抗为单克隆抗体或者多克隆抗体。
6.如权利要求1所述的一种富集循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，步骤c的操作为：将一抗用PBS液稀释，调整其浓度为2-10μg/mL，取50μL加入到经Red Cell Lysis液处理的待检测患者血液的离心管中，混匀、37℃下微震荡孵育10-20分钟，使之充分接触；将上述孵育后的血液转移到第二抗体固定的酶标板内。
7.如权利要求6所述的步骤c的操作，其特征在于：处理血液的方法包括：加入Red CellLysis液步骤后，再加入福尔马林或70％乙醇溶液。
8.如权利要求1至7任一项所述的一种富集循环肿瘤细胞的方法，其特征在于：步骤d或步骤D之后，还包括步骤(e)循环肿瘤细胞的检测。
9.用于检测富集的循环肿瘤细胞的EGFR基因突变的引物和探针，其特征在于：所述引物和探针序列包括：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：24。
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