CN105950558A - 一种基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法 - Google Patents

一种基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法,该方法包括如下步骤:在粒径为30‑100µm、密度为1.16‑3g/mL的羟基微球表面化学键合上一层20‑100nm厚的明胶,得到包裹明胶的羟基微球;在包裹明胶的羟基微球表面修饰上抗体anti‑EpCAM和anti‑CD146;将病人血样与修饰抗体的羟基微球混匀孵育得混合样品,滴加到1.15‑1.20g/mL细胞分离液的上层,离心分离后,捕获住肿瘤细胞的微球沉积在细胞分离液底部;将捕获住肿瘤细胞的微球使用明胶酶降解微球表面明胶,释放肿瘤细胞。本发明分选效率及纯度更高,并且分选出来的肿瘤细胞能够被释放及培养。

Description

一种基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及肿瘤细胞分选方法,具体涉及一种基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法。
背景技术
[0003] 循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells, CTCs)是从原发肿瘤组织上脱离下来进入到肿瘤患者外周血中的肿瘤细胞,对于肿瘤的早期诊断和治疗评估有很重要的临床研究价值。鉴于实体肿瘤患者因癌症导致死亡的原因多数是因肿瘤转移这个事实,以及血液循环系统中监测到CTCs将预示着肿瘤向远处转移的可能性,早期的循环肿瘤细胞诊断在人体肿瘤活组织检查和判断疾病进展中起着关键作用。然而,血液循环系统中的CTCs含量是极低的,转移癌患者体内每毫升血液中只有几个到几百个CTCs,却存在着19个干扰血细胞,因此对于CTCs的富集分选是一个非常大的技术挑战。CTCs的分选效果(分选效率以及分选纯度)直接影响了其对病人肿瘤诊断的预判以及后续的基因检测等,因此高的分选灵敏度、高的分选纯度、高通量以及高的CTCs活性的细胞分选成为近年来的研究热点和难点。
[0004]近年来,越来越多的灵敏的、具有特异性的CTCs的捕获与鉴定技术已经逐渐发展成熟。目前,CTCs的分选机理最常用的是利用特异性抗体对其表面表达的肿瘤标记物,如上皮细胞粘附因子(epithelial cell adhes1n molecule, EpCAM),进行特异性的抗原-抗体吸附达到细胞分选的目的。这些特异性识别方法均依赖于CTCs表面的EpCAM抗原表达的情况,然而研究发现,肿瘤细胞在迀移过程中会出现上皮-间质转换(epithel ia-mesenchymal transit1n, EMT)过程,在这个过程中CTCs表面的EpCAM或者CK抗原的表达会降低,而这些EpCAM阴性的CTCs可以揭示肿瘤转移的机理,而这些很重要的CTCs将会被基于ant1-EpCAM抗体的捕获方法所遗失,导致了较低的CTC捕获效率。其次应用较为广泛的是利用CTCs与其他血细胞的物理特性差异进行非特异性的分选,如细胞尺寸、密度和形变等的差异性。其中密度梯度离心法,因其成本低廉和操作简单的优势而被应用在患者外周血CTCs的探测中。根据不同种类的细胞密度不同(其中CTCs密度范围为1.06-1.llg/mL,红细胞密度范围为1.10-1.15g/mL,白细胞密度范围为1.07-1.09g/mL),利用密度梯度离心法将细胞按照不同密度分布在离心液中。然而这种方法只能去除血样中大量的红细胞,由于CTCs与白细胞的密度有交叉部分,在离心分选过程中,CTCs可能会与白细胞共沉积,导致纯度、灵敏度降低。
[0005]因此本发明在抗原-抗体特异性识别技术和密度梯度离心技术的基础上引入了一种新的更有效的基于密度大小的细胞分选技术。本发明添加了一种新的肿瘤标记物CD146,来加强CTCs的捕获。作为EMT的诱导因子,CD146跟肿瘤细胞表面EpCAM的表达呈互补关系,故使用ant1-CD146抗体可以捕获到EpCAM阴性表达的CTCs,尤其已经经历过EMT过程的CTCs。本发明通过特异性识别选择性的增大CTC密度,从而扩大其与血细胞密度的差异性,使用一种优化的特定密度的细胞分离液对处理过的血样进行分层,提高CTC分选纯度。
发明内容
[0006]本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足,提供一种基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法,该方法基于抗原-抗体特异性识别技术和密度梯度离心技术,其分选效率及纯度更高,并且分选出来的肿瘤细胞能够被释放及培养。
[0007]为了达到以上目的,本发明采用以下技术方案:
一种基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法,包括如下步骤:
(I)配制密度为1.15-1.20g/mL的细胞分离液。所述的细胞分离液包括Ficoll或Percoll细胞分离液。
[0008] (2)在粒径为30-100μπι、密度为1.16_3g/mL的羟基微球表面化学键合上一层20-1OOnm厚的明胶,得到包裹明胶的羟基微球。所述的羟基微球包括二氧化硅微球、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA微球。
[0009] (3)在包裹明胶的羟基微球表面修饰上具有特异性免疫识别肿瘤细胞功能的抗体ant 1-EpCAM和ant 1-⑶146,得到双抗体修饰的羟基微球。
[0010] (4)将病人血样与双抗体修饰的羟基微球混匀孵育(使微球表面修饰的抗体与肿瘤细胞表面抗原特异性结合以捕获住肿瘤细胞)得混合样品,将混合样品缓慢滴加到1.15-1.20g/mL细胞分离液的上层,离心分离后,上述微球处理过的血样被分层,其中所有的血细胞悬浮在细胞分离液上方,所有的捕获住肿瘤细胞的微球(CTC-beads)沉积在细胞分离液底部,从而将外周血样中的CTC-beads完全从周围的血细胞中分离出来,得到非常高的CTC-beads纯度。
[0011] (5)将收集的捕获住肿瘤细胞的微球使用明胶酶降解微球表面明胶,释放肿瘤细胞。
[0012] 步骤(I)中所述的Percoll细胞分离液的密度优选为1.15g/mL。从美国Sigma公司购买的Percoll原液的密度是1.13g/mL,通过使用1.316g/mL的蔗糖溶液以体积比1:9的比例浓缩密度为1.13g/mL的Percoll原液得到密度为1.15g/mL的Percoll细胞分离液。
[0013]步骤(2)中所述的羟基微球优选为粒径为50μπι、密度1.2g/mL的二氧化硅微球。
[0014]所述的羟基微球为二氧化硅微球时,步骤(2)优选包括如下步骤:I)将二氧化硅微球加入到无水乙醇中,加热升温至60°C后滴入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilane, APS)磁力搅拌2_4h,然后经过无水乙醇、去离子水离心冲洗后得到了氨基修饰的二氧化硅微球(NH2-S12)。2)将NH2-S1道新分散到去离子水中,加入戊二醛,室温下搅拌5-20h,然后经过去离子水离心冲洗后得到了醛基修饰的二氧化硅微球(CHO-S12)。3)将CHO-S12再次分散到明胶溶液,室温下搅拌3-12h后用去离子水离心洗涤去除未反应完全的明胶溶液得到表面均匀包裹上一层厚明胶的二氧化硅微球(S12OGeD0
[0015]步骤(3)优选包括如下步骤:I)使用EDC/NHS对包裹明胶的羟基微球表面羧基进行活化30_120min,使用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solut1n, PBS)离心清洗3次。2)将I)处理的微球浸入到链霉亲和素(streptavidin,SA)溶液中,反应40_120min在微球表面引入链霉亲和素,PBS离心清洗3次。3)将2)处理的微球加入到生物素化的ant1-EpCAM和ant 1-⑶146抗体溶液中,室温下反应I _3h,用PBS漂洗得到双抗体修饰的羟基微球。
[0016]步骤(4)混合样品中双抗体修饰的羟基微球的数量优选为1.5 X 105/mL。
[0017] 步骤(4)中离心所用离心力优选为40_400g。
[0018]在步骤(4)中,密度为1.2g/mL的二氧化硅微球特异性地捕获CTCs,使用将得到密度>1.2g/mL的CTC-bead,使用密度为1.15g/mL的Percoll溶液对血样进行分层,在这个密度下,红细胞很难沉降,离心后,所有血细胞悬浮在Percol I溶液上层,CTC-beads沉降在最底层,彻底地跟所有的血细胞区分开来。
[0019] 步骤(5)中所述的明胶酶优选为基质金属蛋白酶9(metalloproteinases_9, MMP-9)0
[0020]优选的,所述的基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法,还包括对收集的肿瘤细胞进行活性鉴定步骤。
[0021]本发明相对于现有技术具有如下优点和效果:
(I)本发明用的二氧化硅微球密度在1.2g/mL左右,远大于肿瘤细胞和正常血细胞的密度,修饰上相应的抗体后捕获住肿瘤细胞,选择性的增大了肿瘤细胞的密度,大幅扩大了其与血细胞密度差异性,提高了肿瘤细胞的筛选纯度。
[0022] (2)本发明使用双抗体(ant1-EpCAM和ant1-CD146抗体)来特异性捕获肿瘤细胞,大大加强了肿瘤细胞的捕获效率。
[0023] (3)本发明用双抗体修饰的Si02@Gel能特异性吸附靶细胞,而不吸附血细胞,从而实现了对CTCs的特异性识别和捕获。
[0024] (4)本发明同时结合了基于细胞密度和抗原-抗体特异性识别,区分、筛选肿瘤细胞的方法。
[0025] (5)本发明初次使用优化的Percoll细胞分离液,分选得到的纯度极高的肿瘤细胞。
[0026] (6)本发明在二氧化硅微球表面包裹了一层明胶,在收集到捕获肿瘤细胞的二氧化硅微球后,通过明胶酶降解即可释放肿瘤细胞,释放的肿瘤细胞活性不受影响。
[0027] (7)本发明可以对释放下来的肿瘤细胞进行再培养,肿瘤细胞传代并未受到影响,且验证了肿瘤细胞相对血细胞极强的无限增殖能力。
[0028] (8)本发明的分选过程具有简单、方便、易操作等优势。
附图说明
[0029]图1是本发明S12OGel微球捕获、分选和释放细胞的示意图。
[0030]图2是明胶、包裹明胶后的二氧化硅微球(S12OGel)和S12微球的表征结果图,其中a)为傅里叶红外图,b)为XRD图。
[0031] 图3是S12微球和S12OGel及其捕获肿瘤细胞的TEM和SEM图,其中a)为S12微球TEM图,b)为S12OGel TEM图,c)为S12微球表面捕获肿瘤细胞的SEM图,d)为S12OGel表面捕获肿瘤细胞的SEM图。
[0032]图4是S12微球和S12OGel对肿瘤细胞系的捕获效率结果图。
[0033] 图5是结直肠癌细胞(HCT116)和乳腺癌细胞(MCF-7)表面EpCAM和⑶146抗原表达的测试结果图,其中a)为两种肿瘤细胞表面EpCAM和CD146抗原表达的共聚焦荧光图,b)为流式结果图,c)为聚合酶链式反应(PCR)结果图。
[0034]图6是不同抗体修饰的S12OGel对肿瘤细胞系的捕获效率比较图,其中对照组为未修饰任何抗体的Si02@Gel。
[0035]图7是不同抗体修饰的S12OGel对人造CTC血样中肿瘤细胞的捕获效率比较图,其中对照组为未修饰任何抗体的S12OGel。
[0036]图8是不同密度的Percoll溶液对肿瘤细胞的分选结果图。
[0037] 图9是CTC-beads经Percoll细胞分离液分选前后对照图,a)为S12OGel选择性的捕获血样中肿瘤细胞的显微镜明场图,b)为CTC-beads经Percoll细胞分离液离心分选后的显微镜明场图,其中黑色箭头所指为捕获住的肿瘤细胞。
[0038]图10是丽P-9降解S12OGel表面的明胶及肿瘤细胞被释放下来的效果图,其中a)为S12微球表面化学修饰上明胶纳米颗粒的TEM图,b)为S12OGel表面明胶被MMP-9酶降解后的TEM图,c)为S12OGel捕获住肿瘤细胞的显微镜明场图,d)为S12OGel表面明胶降解后被捕获的肿瘤细胞被释放下来的明场图。
[0039]图11是使用三色荧光对释放下来的肿瘤细胞以及白细胞进行鉴定的荧光显微图,其中a)为纯化前人造CTC血样中投掷的肿瘤细胞跟白细胞比例图,b)为人造CTC血样经捕获、分选纯化释放后肿瘤细胞跟白细胞的比例图。
[0040]图12是MMP-9酶降解CTC-beads释放下来的肿瘤细胞和白细胞的数量总结图。
[0041]图13是使用流式细胞仪测定释放前后肿瘤细胞活性结果图,其中对照组为未经染色的细胞的荧光强度,肿瘤细胞经历捕获释放流程前的细胞活性为94.9%,最终经历捕获和释放后的肿瘤活性为92.5%。
[0042]图14是释放下来的肿瘤细胞进行再培养的显微镜下的视野图,其中上面三张图为明场图,下面二张图为暗场图。
[0043]图15是使用四色免疫化学荧光鉴定和计数癌症患者外周血样中捕获到CTCs的结果图,其中a)为CTC的荧光鉴定图,b)为表面表达⑶146的CTC,c)为20例癌症病人ImL血样中捕获到的CTC数量。
具体实施方式
[0044]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明,实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0045]本发明基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法的原理见图1。在包裹明胶的二氧化娃微球Si02@Gel表面修饰上ant1-EpCAM和ant1-⑶146抗体,将修饰上双抗的S12OGel与病人血样混匀使微球捕获住血样中的肿瘤细胞,选择性的增大肿瘤细胞密度(>1.2g/mL);将血样滴加到密度为1.15g/mL的Percoll细胞分离液上层,离心分离后,所有的血细胞悬浮在Percoll溶液上层,捕获肿瘤细胞的微球(CTC-beads)全部沉降在溶液底部,达到肿瘤细胞完全从血细胞中分离的目的;最后将分选提纯后的CTC-beads使用MMP-9酶对二氧化硅微球表面的明胶进行降解,CTCs从二氧化硅微球表面保持很高活性地脱离下来,得到完全纯化的CTCs。
[0046]实施例1 S12OGel的制备及包裹明胶前后捕获肿瘤细胞效率的比较 (I)S12OGel 的制备
称取0.1g尺寸为50μπι、密度为1.2g/mL的S12微球,经过无水乙醇离心清洗3次后,移入锥形瓶内,加入50mL无水乙醇,置于加热搅拌台上;待温度升高到600C后,滴加0.2mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS),搅拌3h后在S12微球表面引入氨基得到氨基修饰的S12微球(NH2-S12)5NH2-S12分别用无水乙醇、去离子水离心洗涤3次后,重新悬浮在50mL的去离子水中,滴加0.2mL浓度为50%的戊二醛溶液,室温下搅拌1h后在微球表面引入醛基得到醛基修饰的S12微球(CHO-S12) ; CHO-S12用去离子水离心洗涤3次后,加入40mL浓度为I%的明胶溶液,室温下搅拌4h,去离子水离心洗涤去除未反应完全的明胶溶液,最终得到表面均匀包裹一层明胶(厚度50nm左右)的二氧化娃微球(Si02@Gel)。
[0047 ]图2a是明胶、包裹明胶后的二氧化硅微球(S i O2OGe I)和S i O2微球表面的官能团的红外光谱图,其中S12OGel在波长1635cm—1处有吸收带,这个吸收带属于明胶N-H的伸缩振动吸收峰,而在S12表面无此吸收峰,说明了S12OGel表面明胶的存在;图2b是相应的X射线衍射衍射图谱,看出这三种材料都处于非晶的无定型结构,其中S12OGel的衍射角(2Θ21.7° )相对S12的衍射角(2Θ 22.8° )有一个稍微偏移的角度并且衍射峰稍微尖锐一些。
[0048] (2)Si02微球和S12OGel对肿瘤细胞的捕获效率将107-7细胞系使用01^]«配制成104/1^的浓度,加入1.5\105/1^ S12微球、S12OGel
微球,混匀,室温孵育20min,样品经过脱水、固定以后,使用显微镜观察比较细胞在S12和S12OGel微球上的贴附状态。图3为S12微球和S12OGel及其捕获肿瘤细胞的TEM和SEM图,S12微球通过化学键合上一层明胶之后,在光滑的S12微球表面形成了明胶的纳米结构。从细胞贴壁的SEM图可以看出,光滑的S12微球衬底上细胞呈现球状,可能不利于细胞捕获在基底上;而在明胶纳米颗粒基底上,细胞摊开,伸出很长的伪足,利于细胞爬片,可能会增加捕获效率。
[0049]据此,进一步研究微球表面纳米结构的形貌对肿瘤细胞捕获效率的影响。将MCF-7和!1(:1'116两种细胞系使用0腿1均配制成105/1^的浓度,分别加入1.5\105/11^ S12微球、S12OGel微球,混匀,室温孵育20min后,显微镜下进行观察计数,结果见图4。从图4看出,相比S12微球,S12OGel微球对肿瘤细胞的捕获效率提高了 25%,说明微球表面的纳米结构对肿瘤细胞的捕获具有增强作用。
[0050]实施例2肿瘤细胞表面标记物的选择
CTCs在转移的过程中会发生复杂的EMT过程,在这个过程中,很多CTCs表面的EpCAM会低表达或者不表达,同时细胞表面会高表达CD146抗原,因此为了提高CTCs的捕获效率,选用抗体ant1-⑶146和ant1-EpCAM—起来开展癌症患者外周血中CTCs的捕获工作。
[0051 ] 本实施例研究了乳腺癌细胞MCF-7和结直肠癌细胞HCTl 16表面CD146和EpCAM的表达。用嫁接荧光素的抗体PE-ant1-CD146和APC-ant1-EpCAM来标记肿瘤细胞相应抗原的表达,使用共聚焦显微镜和流式细胞仪对细胞进行观察计数,并且对两种肿瘤细胞进行了 RT-PCR测序,具体方法和实验结果如下:
(I)共聚焦显微镜观察
将15个肿瘤细胞培养在共聚小皿上,37°C、5%⑶2条件下培养I天后,加入1yL PE-anti_CD146( 10yg/mL)和1yL APC-ant1-EpCAM(10yg/mL)室温下孵育1min ; PBS清洗后,加入4%多聚甲醛(PFA)室温下将细胞固定1min JpAlOlIL DAPIUyg/mL)溶液染色来识别细胞核;使用激光扫描共聚焦显微镜(LCS SP9 STED Leica, Germany)对细胞进行拍照。实验结果如图5a所示,两种肿瘤细胞均表达CD146和EpCAM这两种抗原。
[0052] (2)流式分析
将16个MCF-7和此1116细胞使用含1% BSA的I3BS溶液清洗,避免后续细胞染料非特异性吸附在细胞表面;离心去除I3BS之后,将细胞重新悬浮在在101IL PBS溶液中,加入1yLPE-anti_CD146( 10yg/mL)和(或)10yL APC-anti_EpCAM( 10yg/mL)孵育1min;经过PBS离心清洗去除多余的染色试剂,将细胞重新悬浮在在101IL PBS溶液中,使用流式细胞仪(Accuri C6, BD B1sciences)对细胞进行计数,同时未染色的细胞将作为对照组。实验结果显示,两种肿瘤细胞都高表达⑶146和EpCAM这两种抗原(图5b),同时从图5b看出,有的肿瘤细胞只表达CD146或者EpCAM。依据上述流式结果,说明基于肿瘤细胞表面表达的EpCAM开展的免疫识别CTCs的技术,将会丢失表面不表达EpCAM的CTCs,而同时利用肿瘤细胞表面表达的⑶146来识别CTCs理论上会加强CTCs的捕获效率。
[0053] (3)RT-PCR
使用反车专录聚合酉每链反应(reverse transcript1n-polymerase chain react1n,RT-PCR)方法、实时焚光定量PCR系统(StepOnePlus system)和TaqMan基因表达分析(Applied B1systems)来分析肿瘤细胞表面蛋白(如⑶146,EpCAM和E-Cadherin)的表达,结果如图5(:所示。其中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase, GAPDH)几乎在所有组织中都高水平表达,将高表达的GAPDH作为其他蛋白表达的对照。实验结果显示,两种肿瘤细胞表面⑶146和EpCAM这两种抗原的表达属于互补关系。
[0054] 实施例3 S12OGel表面抗体的修饰
(I)使用PBS配制0.1M 的MES(2_morpholinoethanesulfonic acid )溶液,用MES溶液配制含4mg/mL EDC(N-(3-dimethylamino propyl-N’-ethylcar-bodiimide))和6mg/mL -NHS(N-hydroxysuc-cinimide)的溶液,将 100口1^数量为I.5 X 15 Si02@Gel悬浮液跟10yL上述EDC/NHS溶液在室温下搅拌40min,激活明胶表面的羧基,PBS离心清洗3次。
[0055] (2)使用PBS配制浓度为SOyg/mL的链霉亲和素(streptavidin, SA)溶液,将上一步处理过的微球浸入101IL SA溶液中,室温下反应60min,PBS离心清洗3次。
[0056] (3)使用I3BS配制浓度为lOyg/mL的生物素化ant1-EpCAM溶液和lOyg/mL的生物素化ant1-⑶146溶液,将上一步处理过的微球浸入lOOyL ant1-EpCAM溶液和/或lOOyL ant1-CD146溶液中,室温下反应2h,得到双抗(ant1-EpCAM和ant1-CD146)修饰的Si02@Gel、ant1-EpCAM 修饰 S12OGel 和 ant1-CD146 修饰的 S12OGel。
[0057]实施例4不同抗体修饰的S12OGel捕获肿瘤细胞效率的比较
(I)使用MCF-7和HCTl 16细胞系来研究加入的ant1-CD146抗体对肿瘤细胞捕获效率的影响。
[0058]将胰酶消化下来的肿瘤细胞系经过DMEM多步稀释得到浓度为15个/mL的细胞悬浮液。将未经过抗体修饰的1.5 X 15 S12OGel和不同抗体修饰的1.5 X 15 S12OGel分别与ImL 15个/mL细胞悬液混合30min,在Olympus IX 71显微镜下对悬浮液中未被捕获的细胞进行计数,归一化计算不同抗体修饰的S i 02iGe I对肿瘤细胞的回收效率。实验结果如图6所示,表面同时修饰ant1-EpCAM和ant1-⑶146的S12OGel对肿瘤细胞的回收效率要比单独使用一种抗体的回收效率要高,回收效率约为90%,预示了两种抗体的结合在癌症患者外周血内加强CTCs捕获的可行性。而不修饰任何抗体的S12OGe I捕获效率〈4%,说明修饰抗体的Si02iGe I对细胞的捕获是特异性的非物理吸附。
[0059] (2)在进行临床病人外周血样中CTCs的捕获实验之前,先将上述肿瘤捕获条件应用在人造血样中肿瘤细胞的模拟捕获实验中。
[0060]首先,将一定数量的经过羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(carboxy-fluorescein succinimidyl ester, CFSE, 5口8/!111^)预染色的]\^^'-7和!1(71116细胞加入11111^健康人外周血中,分别制备成肿瘤细胞浓度为20、50、100和250个/mL的人造CTC血样。接着,将未经抗体修饰的1.5 X 15 S12OGel以及不同抗体修饰的1.5 X 15 S12OGel分别加入ImL不同浓度的人造CTC血样中,室温下共孵育20min,荧光显微镜下观察计数不同S12OGel表面捕获到的肿瘤细胞数。实验结果如图7所示,即使在人外周血复杂的微环境条件下,表面同时修饰ant1-EpCAM和ant1-⑶146的S12OGel依然能高效率(〜85%)地回收血样中的肿瘤细胞,并且同时使用两种抗体比单独使用任一抗体的捕获效率要高。进一步验证了病人血中双抗对CTCs捕获潜在的有效性。
[0061 ]实施例5 Percoll细胞分离液的制备和优化
在一个固定的离心力和分离液粘度下,溶液中不同颗粒的沉降速率跟颗粒的尺寸和密度有关,使用一定浓度的分离液和选择一个固定的离心力离心一段时间后,不同颗粒将会停留在分离液的不同层。由此本实施例研究了癌症患者外周血中各种细胞在分离液中的分层情况,其中红细胞的密度为1.10-1.15g/mL,单核细胞(包括白细胞和肿瘤细胞)的密度为1.07-1.09g/mL。上面选择了一种尺寸为50μηι、密度为1.2g/mL的二氧化娃微球包裹明胶、修饰上双抗特异性地捕获CTCs,将得到尺寸>50μπι、密度>1.2g/mL的CTC-bead,由于CTC-bead直径和密度远远大于白细胞,故CTC-bead沉降速率将远远大于白细胞。
[0062] 从美国Sigma公司购买的Percoll原液的密度是1.13g/mL;使用10倍浓缩的PBS(1.075g/mL)溶液以体积比1:9的比例稀释Percoll原液,得到密度为1.077g/mL的较低密度的Per Co 11溶液;使用2.5M( 1.316g/mL )的蔗糖溶液以体积比1:9的比例浓缩Per co 11原液,得到密度为1.15的较高密度的Percoll溶液。
[0063]往装有2mL 不同密度(1.077g/L、1.13g/mL、1.15g/mL)的Percoll细胞分离液的15mL离心管中缓慢地滴加ImL上述完成肿瘤细胞捕获的人造CTC血样,400g离心力下离心1min,观察细胞的沉降情况,结果见图8。细胞分离液密度在1.077-1.13g/mL范围内(图8b-
c),离心后会有相当大数量的红细胞沉降在分离液底层,跟CTC-beads混在一起,降低了CTCs的分选纯度。细胞分离液密度为1.15g/mL时,所有血细胞悬浮在Per co 11细胞分离液上层,CTC-beads沉降在最底层,彻底地跟所有的血细胞区分开来(图8d)。
[0064] 实施例6
往装有2mL 1.15g/mL的Percoll细胞分离液的15mL离心管中缓慢地滴加ImL上述完成肿瘤细胞捕获的人造CTC血样,400g离心力下离心1min后,去除上清液和悬浮的血细胞,收集离心管底部的CTC-beads用显微镜观察。如图9显示,显微镜明场下观察发现,经过Percoll细胞分离液分选之后,CTC-beads完全跟血细胞分离开来。经过荧光染色鉴定计算得到肿瘤细胞的回收纯度达到>90%。
[0065] 将经I.15g/mL Percoll细胞分离液分选的CTC-beads加入到的0.5mL经PBS配制的MMP-9(0.1 g/mL)溶液中,37°C、5% CO2条件下孵育20分钟,使用SEM观察微球表面形貌,直观验证了微球表面的明胶纳米颗粒能被MMP-9酶溶液降解(如图10)。同时在X81显微镜下观察到肿瘤细胞从微球表面脱离下来,释放效率>90%。通过三色免疫化学荧光鉴定,计数释放下来的肿瘤细胞数量和白细胞的数量,实验结果总结如图11和图12所示,肿瘤细胞纯化效率极高为〜90%。
[0066] 微球表面包裹的明胶经过200仙0.lmg/mL的MMP-9酶降解20min后,MCF-7细胞从微球表面释放下来。将释放下来的细胞收集起来,使用含1% BSA的PBS溶液清洗,避免后续细胞染料非特异性吸附在细胞表面。离心去除PBS之后,加入50仙浓度为Syg/mL的CFSE和50yL的碘化丙碇(PI,Syg/mL)孵育1min;经过I3BS离心清洗去除多余的染色试剂,将细胞重新悬浮在在101IL的I3BS溶液中,使用流式细胞仪(Accuri C6, BD B1sciences)对细胞进行计数,同时将胰酶刚消化下来的细胞和未经过染色的细胞作为对照组。图13显示,经历捕获-释放过程的肿瘤细胞活性与刚被胰酶消化下来的细胞活性一样。
[0067]接着将释放下来的细胞收集起来放入96孔板内37°C、5% CO2条件下培养,每隔一段时间使用CFSE/PI染色进行活性鉴定同时观察释放后肿瘤细胞的生长状态。结果见图14,说明细胞捕获释放过程并未对细胞造成损伤,并且也未对细胞周期活动产出明显的影响。
[0068] 实施例7
在最优化条件下,对取自乳腺癌和结直肠癌患者的外周血开展了CTCs的捕获与检测实验。
[0069]从20例患者(其中乳腺癌和结直肠癌患者各10例)静脉血管处各抽取2mL的外周血,平均分为2份,一份加入1.5 X 15个经ant1-EpCAM修饰的S12OGel,另一份加入1.5 X 15个经 ant1-EpCAM 和 ant1-CD146 修饰的 S12OGel,共孵育 20min 后,先后经过 2mL 1.15g/mL?6代011细胞分离液40(^离心除去外周血细胞,2001^ 0.lmg/mL MMP-9酶溶液降解微球表面明胶使CTCs跟微球脱离。将释放后收集起来的使用四色免疫化学荧光鉴定CTCs。
[0070]四色荧光鉴定:首先用ImL 4%多聚甲醛(PFA)溶液进行固定,静置10分钟,用PBS冲洗;接着加入0.1% Triton-XlOO溶液ImL对细胞进行穿孔,静置10分钟,用I3BS冲洗,在加入3% BSA溶液0.5mL对非特异性位点进行包被,静置30分钟,用PBS冲洗;PE-ant1-CD146和APC-ant1-EpCAM,ant1-CD45-FITC和ant1-CK-PE荧光染料各0.1mL对细胞进行免疫荧光染色,并4°C下静置过夜;最后经DAPI染色后利用多通道荧光检测系统进行CTCs观测和计数。ant1-⑶45-FITC在蓝光激发下发绿色荧光用于识别白细胞,ant1-CK-PE在绿光激发下发橙红色荧光用于识别肿瘤细胞,DAPI在紫外光激发下呈蓝色用于染细胞核。其中所有DAPI+/CD45-/EpCAM+或者DAPI+/CD45-/CD146+的细胞均视为CTC;而所有DAPI+/CD45+的细胞视为白细胞。实验结果如图15所示,从乳腺癌患者和结直肠癌患者的ImL外周血样中,均捕获到了CTCs,并且经 ant1-EpCAM 和 ant1-CD146 修饰的 S12OGel 比单独修饰 ant1-EpCAM 的 S12OGel捕获和鉴定到的CTCs要多,说明了ant1-CD146能捕获到患者血样中低表达或者不表达EpCAM的CTCs,这些捕获到的CTCs对临床研究肿瘤迀移具有非常重要的研究价值。
[0071]上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法,其特征在于:包括如下步骤: (1)配制密度为1.15-1.20g/mL的细胞分离液;所述的细胞分离液包括Ficol I或Percol I细胞分离液; (2)在粒径为30-100μπι、密度为1.16-3g/mL的羟基微球表面化学键合上一层20-100nm厚的明胶,得到包裹明胶的羟基微球;所述的羟基微球包括二氧化硅微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球; (3)在包裹明胶的轻基微球表面修饰上抗体ant1-EpCAM和ant1-CD 146,得到双抗体修饰的羟基微球; (4)将病人血样与双抗体修饰的羟基微球混匀孵育得混合样品,将混合样品滴加到1.15-1.20g/mL细胞分离液的上层,离心分离后,捕获住肿瘤细胞的微球沉积在细胞分离液底部; (5)将收集的捕获住肿瘤细胞的微球使用明胶酶降解微球表面明胶,释放肿瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法,其特征在于:步骤(I)中所述的细胞分离液为的密度为1.15g/mL的PercolI细胞分离液。
3.根据权利要求2所述的基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法,其特征在于:密度为1.15g/mL的Percoll细胞分离液通过使用1.316g/mL的蔗糖溶液以体积比1:9的比例浓缩密度为1.13g/mL的Percoll原液得到。
4.根据权利要求1所述的基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法,其特征在于:步骤(2)中所述的羟基微球是粒径为50μπι、密度为1.2g/mL的二氧化硅微球。
5.根据权利要求1所述的基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法,其特征在于:所述的羟基微球为二氧化硅微球时,步骤(2)包括如下步骤: 1)将二氧化硅微球加入到无水乙醇中,加热升温至60°C后滴入3-氨基丙基三乙氧基硅烷磁力搅拌2-4h,然后经过无水乙醇、去离子水离心冲洗后得到了氨基修饰的二氧化硅微球; 2)将氨基修饰的二氧化硅微球重新分散到去离子水中,加入戊二醛,室温下搅拌5 -20h,然后经过去离子水离心冲洗后得到了醛基修饰的二氧化硅微球; 3)将醛基修饰的二氧化硅微球再次分散到明胶溶液,室温下搅拌3-12h后用去离子水离心洗涤去除未反应完全的明胶溶液得到表面均匀包裹上一层明胶的二氧化硅微球。
6.根据权利要求1所述的基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法,其特征在于:步骤(3)包括如下步骤: 1)使用EDC/NHS对包裹明胶的羟基微球表面羧基进行活化30-120min,使用I3BS离心清洗3次; 2)将I)处理的微球浸入到链霉亲和素溶液中,反应40-120min在微球表面引入链霉亲和素,PBS离心清洗3次; 3)将2)处理的微球加入到生物素化的ant1-EpCAM和ant1-⑶146抗体溶液中,室温下反应l-3h,用PBS漂洗得到双抗体修饰的羟基微球。
7.根据权利要求1所述的基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法,其特征在于:步骤(4)混合样品中双抗体修饰的羟基微球的数量为1.5 X 105/mL。
8.根据权利要求1所述的基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法,其特征在于:步骤(4)中离心所用离心力为40-400g。
9.根据权利要求1所述的基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法,其特征在于:步骤(5)中所述的明胶酶为基质金属蛋白酶9。
10.根据权利要求1所述的基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法,其特征在于:包括对收集的肿瘤细胞进行活性鉴定步骤。
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