CN102272595A - 鉴定、选择和分析肿瘤细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及诊断肿瘤状况和/或相应的肿瘤发展状况的方法，其中从患者获取有机液体样本富集在CTC或CTD群中，所述有机液体具有含至少一种循环肿瘤细胞(CTC)或扩散肿瘤细胞(CTD)或其部分的可能性高。根据本发明，CTC或CTD中至少一种类型是通过在微流体装置中逐个选择单个细胞分离的，以便形成纯度至少为90％的诊断样本。对这样获得的样本随后执行分子分析，以便突出其中适于能够进行诊断的特征。

Description

鉴定、选择和分析肿瘤细胞的方法
技术领域
本发明总体上涉及基于鉴定、分离、和后续分析循环或扩散的罕见细胞的诊断方法。尤其是，本发明涉及应用于肿瘤领域，并因此涉及鉴定和分离循环肿瘤细胞(CTC)或扩散的肿瘤细胞(DTC)的诊断方法。
背景技术
大量的病理状况，特别是肿瘤的诊断通常根据这样的方法进行的，这些方法的特征在于，一方面是具有不同程度的创伤性，另一方面是根据特异性、敏感性、和可靠性具有不同水平的性能。
一些筛选方法基于旨在检测外周血流中生物标记的存在(例如，CA-125、CEA、PSA)或其他生物液中生物标记的存在(例如，测试排泄物中的潜血或测试排泄物DNA)。然而，所述方法都是基于间接评价而非直接分析，该间接评价是生物标记(例如肿瘤组织)浓度的函数。因此，其敏感性和特异性不是很高。
在这种情况下，例如广泛采用基于血清学参数(PSA的剂量)筛查男性人群中最常见形式的癌症之一，前列腺癌(约占所有癌症病例中的四分之一，在欧洲每年新增约300,000例)时，敏感性和特异性较差。
创伤更大的过程，如直肠指检有时可完成临床影像(clinical picture)，但更经常的是，需要进行前列腺活检以实现更准确的诊断，这会使创伤性增加，从而导致患者的不适增加，并导致医疗系统发生不可忽略的成本。
类似情形也出现在其他情况中，如结肠-直肠癌，其常常要依赖于评价排泄物中的潜血，或通过结肠镜检查进行侵入性分析，而且有可能直接从结肠-直肠提取组织进行活检。
因为在这种情况下，早期诊断使得一般能够实现更有效的治疗，以高度敏感性和特异性的评价癌症早期发作显然是有意义的。
从这个意义上讲，最近对于循环肿瘤细胞(CTC)的研究(例如，Zieglschmid等人，Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.42，，155-196(2005))已经证明，在外周血流中发现了来自原发性肿瘤的细胞。即使它们的量非常少，鉴定和分离这些细胞的可能性也有可能成为上述侵入性方法的有意义替代方法，其中上述侵入性方法需获取随后要为诊断目进行表征的肿瘤组织样本。监管机构(如FDA)已经批准一些基于CTC的系统用于临床应用，以便对出现转移的患者进行评价。
对于大多数患有癌症的患者而言，实际上并不是主要肿瘤(maintumour)引起死亡，如果在足够早的阶段鉴定，就能够通过放射疗法、化学疗法、或所述方法的组合进行治疗从而避免外科手术。最经常引起死亡的是转移瘤，即，源自从主要肿瘤脱离并向身体的其他区域迁移，甚至是迁移到距离主肿瘤位置相当远的区域的恶性细胞的肿瘤群落(tumouralcolony)。由于转移瘤难于鉴定和消除，因此常常不能成功治疗所有的转移瘤。因此，从临床的角度来看，转移瘤的形成可被看作是癌症自然发展过程中的结论性事件。
因此，由于已经证明在乳腺癌、结肠癌、和前列腺癌的情形中CTC数目和疾病不利结果风险增加之间存在关联，因此利用分子分析将其分离并由此获得具有临床重要性的完整信息影像(informative picture)的可能性显然具有非常重要的诊断影响(repercussion)。
而且，已经证明扩散的肿瘤细胞(DTC)的分析(即能够在骨髓或在淋巴结中发现的肿瘤细胞的分析)在某些情形中甚至比原发性肿瘤的分析更重要。例如，一些研究组已指出(Klein等人，Tumour cell.13(5)，441-53(2008))，HER2的过表达被证明是极高死亡风险的预兆，其中HER2的过表达可在单个DTC而不是原发性肿瘤中检测到。
而且，从例如专利No.EP1109938中已知，与一组细胞的分析相比，单一多细胞分析更能够提供有益的信息。尤其是，已经发现(Klein等人，Proc.Natnl.Acad.Sci.USA 96，4494-4499(1999))同一个患者的不同DTC具有不同的染色体变异(在不同的位置出现缺失和扩增)。
在现有技术中，为了分离循环肿瘤细胞和扩散肿瘤细胞，存在具有主要分析特性的可用方法，这些方法非常复杂和费力，然而产率却有限并且产生低纯度的样本。因此，所述CTC或DTC样本与一些最精确和可靠的诊断程序(如测序)不兼容。实际上，有限的纯度决定了由于序列碱基中错误响应引起的高风险的假阳性和假阴性。
人们已尝试了(Nagrath等人，Nature，450，1235-1241(2007))利用具有涂覆有抗-EpCAM抗体(在上皮细胞中表达而不是在白细胞中表达)的内表面的微流体装置来分离CTC，其中该抗-EpCAM抗体能够处理毫升量级的血液，而不必依赖于要求具有损失部分感兴趣细胞的高风险操作(例如，离心、冲洗和孵育)的预处理。然而所述方法导致平均为50％-60％的纯度水平，这不足以进行下游分析，样本纯度对于该分析是非常关键的，例如，拷贝数变化、微卫星不稳定性、杂合性缺失(LoH)、基因表达的评价，其中较好的信噪比(S/N)对于诊断应用、或新药物的鉴定、或对癌症启动细胞研究是很重要的。
类似考虑可延及其他方法，其已显现出巨大的诊断潜力，然而因为如果不完成繁重、复杂且高成本的分析工作，生物样本富集和分离其中的罕见细胞群的已知过程就不能获得足够水平的纯度，因此这些方法并不能具体执行，从而在医疗实践不能得到应用。例如(Bonci等人，“ThemiR-15a-miR-16-1 cluster controls prostate cancer by targeting multipleoncogenic activities”，2008年10月19日；doi：10.1038/nm.1880)，最近已证明一些microRNA(miRNA)，即，含有约22个核苷酸的短单链非编码RNA片段与癌症的发展和进展直接相关，该文献仅作为相关部分结合于本文作为参考。从利用定量PCR研究原发性肿瘤(前列腺癌)细胞中miR-15a和miR-16表达的研究来看，已经注意到与相应到健康组织相比，这两种miRNA都有相当程度的下调(under-regulation)。所述数据已经通过原位杂交(ISH)的方式得到证实。而且，尽管在一些情形中在癌症发展的初期就已经记录了这些miRNA的下调，但已经证明miR-15a-miR-16簇的缺失通常与疾病的晚期相关联。因此，从诊断的角度看，分离肿瘤细胞和评价它们是否存在这些miRNA的下调的可能性可提供疾病发展状态的准确指征，这对内科医生和选择最适当治疗形式是有用的。
进一步考虑治疗性质，应该考虑肿瘤领域基于使用单克隆抗体的某些治疗方法，该单克隆抗体能够对肿瘤细胞的存活、剥夺(deprive)细胞外增殖的重要信号(essential signal)，如生长因子通过细胞受体调控(mediate)的信号具有直接影响。例如，这方面一个感兴趣靶标是表皮生长因子受体(EGFr)。在表皮生长因子(EGF)和相应受体EGFr直接结合触发一连串细胞生化事件(包括EGFr的自体磷酸化和内化)后，内化会在细胞增殖中达到顶峰。
已经证明EGF和转化生长因子-α(TGF-α)结合于EGFr并导致细胞增殖和肿瘤生长。在许多情形中，增加的EGFr表达伴随有肿瘤细胞产生TGF-α或EGF，因此表明涉及癌症发展中自分泌生长控制(autocrine growthcontrol)。因此，这些已经建议在肿瘤治疗中使用抗体抑制所表达或过表达的EGF、TGF-α和EGFr。近来证明，如国际专利申请公开号No.WO28112274所述，肿瘤细胞的K-RAS基因或B-RAF基因中EGF、TGF-α和EGFr突变的存在构成肿瘤对以设计来结合EGFr多肽的药剂治疗没有响应的指示。
应该理解，利用非创伤性过程从患者提取肿瘤细胞的样本开始检测这类变异的存在可为内科医生提供这样的工具，其在评价是否进行基于使用anti-EGFr单克隆抗体治疗，或事先知道该治疗将是无效而摒弃治疗方面具有重要性。而且这方面，富集、鉴定和分离血液中罕见细胞的方法，或在某些生物液体中，这些方法不能事先获得足够纯度从而保证后续分析可靠(排除假阳性、假阴性等)，且在某些情形中，其实际可执行(例如对于因为纯度低，因此信噪比太低而不能获得有效读数的情形)。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种鉴定、分离、和后续分析循环或扩散的罕见细胞的方法，该罕见细胞是利用非侵入性采样获得的，该方法可克服前述现有技术的缺点。
因此，本发明提供了用于诊断目的的对感兴趣细胞样本实施的程序，该样本获自从患者提取的有机液体，然后根据权利要求1中限定的方法操作而获得定，其中鉴定该感兴趣细胞并随后进行分离直到获得至少90％的纯度。
优选地，进行从循环肿瘤细胞或扩散肿瘤细胞中的至少一种类型或其部分分离至少一个细胞的步骤，从而获得纯度至少为95％的肿瘤细胞样本或其部分。甚至更优选地，进行从循环肿瘤细胞或扩散肿瘤细胞中的至少一种类型或其部分分离至少一个细胞的步骤，从而获得纯度为100％的肿瘤细胞样本或其部分。
具体地，根据本发明的一种优选实施方式，分离罕见细胞的步骤是根据本申请人开发的技术并基于硅微芯片的使用来进行的，其中该硅微芯片通过操纵各个细胞而集成了成百上千个微米尺寸的电极，以便以单一的纯度分离感兴趣的细胞，以使得这些细胞可用于分子分析。以这种方式，根据本发明的方法提供了高纯度的细胞，对于该过程的最灵敏(delicate)部分是高度自动化的(分离单独的细胞)，并使得能够实施具有高度诊断和预测可靠性的分析技术。根据前文中所说明的，可在诊断和治疗水平上清楚地显现出本发明的创新范围，这使得能够在疾病过程的不同阶段中改进肿瘤治疗，使得能够实现具有可比得上活检水平的可靠性的无创早期诊断，以及在治疗过程和/或手术后阶段中在转移阶段和在辅助治疗阶段随着疾病的发展和对临床治疗响应的质量用特异性癌症药物进行灵敏且准确的跟踪治疗。
根据本发明，在第一种情况下，以无创方式从患者提取有机液体是这样进行的，即通过本领域已知的一种或多种方法制造一个或多个富集感兴趣细胞的通道(如Ficoll)、选择性溶解红细胞、基于细胞尺寸用过滤器进行过滤，该过滤器是通过光刻微加工或其他技术获得的，如核孔膜(track-etched membrane)、消减(depletion)或磁力富集(magneticenrichment)。然后以特异性抗体标记所富集的细胞以便鉴定感兴趣细胞和/或污染细胞(contaminating cell)、等等。
在本文中，术语“有机液体”或“身体液体(corporeal fluid)”表示从发现感兴趣细胞的可能性较高的身体样本获得的液体。有机液体可获自身体样本，包括直接获得如获自外周血流、骨髓、尿液，或间接获得如通过淋巴结组织的胰蛋白酶消化获得。
在本文中，术语“感兴趣的细胞”表示其可利用适当分析技术检测的特征能够提供关于患者的病理状况诊断或治疗性质的指征的细胞。
例如，该身体液体是外周血，其可根据常用的方法以基本上无创方式从患者获取，并且感兴趣的细胞是循环肿瘤细胞(CTC)。
作为另一个实例，有机液体是来自骨髓的血液，并且感兴趣的细胞是扩散肿瘤系统(DTC)。
本发明的方法则利用微流体系统表征，该微流体系统能够从富集的样本中逐个选择单个细胞(单一细胞)并以自动或半自动非手动方式将其分离。
本文中为了简便起见，使用术语“单个细胞(单一细胞)”或“单独的细胞”，但该术语必须理解为包括单个细胞或细胞的单个集合体，一般而言，可以存在这样的情况，即感兴趣细胞不是作为分离的细胞存在的，而是以结合于一个或多个其他细胞(肿瘤细胞或非肿瘤细胞)的形式存在。而且，必须理解分析细胞的部分的可能性，例如分离的细胞核。
通过在微流体系统中进行细胞的所述分离，可获得仅含感兴趣细胞的集合，即，纯度等于100％的样本，因此这适合用于经历多个分子分析过程。
有利地，在前述用于逐个选择单一细胞的微流体系统中，选择是基于细胞自身的图像进行的。
有利地，所述细胞图像是在细胞自身的悬浮介质中无流动时获得的。
有利地，所述图像包括在荧光中获得的图像。
“微流体装置”在本文中应理解为设计成以层流方式管理液体的装置，其中在分析过程中容纳液体的空间的至少一个维度小于1mm。
“能够逐个选择单细胞的装置”在本文中应理解为能够基于对每个细胞单独评价的参数对一个或多个单个细胞进行选择的装置，一次选择一个或同时选择。
“非手动分离”在本文中应理解为不要求操作人员动手而使细胞移动，例如利用移动介电电泳笼(双向电泳笼，dielectrophoretic cage)移动的情形。
“自动分离”这本文中应理解为不要求操作人员的干预而使细胞移动，例如利用由程序管理的介电电泳笼移动的情形，该程序以基本非交互方式通过微处理器来执行。
“半自动分离”在本文中应理解为与操作人员的交互使得能够对操纵进行间接控制而使细胞运动，例如利用介电电泳笼运动的情形，其中该介电电泳笼由微处理器执行的交互程序管理。
有利地，前述选择是以自动或半自动方式进行的。
“自动选择”在本文中应理解为细胞选择，其中不需要操作人员判断的干预，例如用自动分类器(classifier)自动确定哪些细胞对应于感兴趣的肿瘤细胞的情形。例如，这可以利用具有图像的分类器来进行，该分类器处理获取的细胞图像，从其提取有差别的特征，并基于一种算法将细胞分类。
“半自动选择”子本文中应理解为这样的细胞选择，其中需要操作人员判断的干预。例如，这可利用获取细胞图像、提取有差别的特征、并将其提供给操作人员以供最终判断是否是要选择的细胞的系统来执行。
然后，可以通过不同的技术对回收的细胞的进行分子分析，这得益于回收的高纯度样本，这些技术的非限制性实例为：
-测序(例如，用于鉴定突变)；
-微卫星分析(例如，定量荧光PCR，即，QF-PCR)；
-比较基因组杂交(CGH)；
-阵列CGH；
-端点PCR；
-实时PCR；
-甲基化分析：
○以焦磷酸测序(pyrosequencing)进行定量甲基化分析；
○亚硫酸氢盐基因组测序PCR(BSP)；
○甲基化特异性PCR(MSP)；
○结合重亚硫酸盐限制性内切酶的DNA分析(COBRA)；
○甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(MS-SNuPE)；
-基因表达的分析；
○RT-PCR；
○单细胞基因表达；
○数字PCR。
可参考附图，从下面实施方式的一些非限制性实施例的说明中显现出本发明其他的特征和优点。
附图说明
图1示出了概述根据本发明的无创诊断方法的实施方式的流程图；
图2是用于执行根据本发明方法的装置(或主要及其表征部件)的实例的示意图；
图3A、图3B和图3D示出了在根据本发明方法扫描循环肿瘤细胞的过程中获得的图像；
图4A、图4B、图4C和图4D示出了在根据本发明方法鉴定和分离的循环肿瘤细胞的基因分析过程中获得的一系列电泳图谱；
图5示出了在扫描根据本发明方法从受到mCRC侵袭的患者的外周血流中选择和分离循环肿瘤细胞的过程中获得的图像；
图6和图7分别示出了关于根据本发明方法从受到mCRC侵袭的患者外周血流分离的CTC的K-RAS上Gly3Val突变检测谱；
图8、图9和图10均示出了在扫描富集的样本过程中获得的5幅图像，所述图像关于DEPArrayTM芯片上5个介电电泳笼的内容物。每幅图中的细胞是彼此在一起回收的并与其他图中的细胞分开回收。图10示出了根据本发明方法的循环肿瘤细胞，而图8和图9是相应的阴性对照(正常白细胞)。
具体实施方式
本发明的目的是鉴定、分离、和后续分析罕见细胞的方法，尤其是优选通过无创采样获得的循环肿瘤细胞或扩散肿瘤细胞。
采样
样本可通过本领域已知的不同技术从患者的外周循环获得，或从骨髓获得。
预富集
所获得的样本中肿瘤细胞的比例可用不同方法富集，例如：密度梯度离心，由诸如Ficoll或Percoll的溶液构成；机械富集，如不同类型的过滤器；利用专门提供的设备(介电电泳激活的细胞分选器(DACS))通过介电电泳进行分离而富集；选择性溶解，例如选择性溶解不感兴趣的红细胞；免疫磁分离，阳性选择的免疫磁珠(利用结合于针对待回收细胞的特异性抗体的磁珠)或阴性选择的免疫磁珠(消减不感兴趣的细胞群)，且其中两种类型的选择可结合以便增加过程的特异性；在以特异性荧光抗体标记的细胞上的FACS；固相免疫分离，有利地利用提供以用于上皮受体(如EpCAM)的特异性抗体涂覆表面的微流体系统。
大多数这些过程能够自动进行，并且所有分选过程能够通过密度梯度离心分离进行或可替换地能够应用于全血。
一般地，该过程从稀释开始，但这不是对所有技术都是必须的。
其他富集技术
本领域技术人员已知的另一种技术是由Miltenyi Biotech开发的MACS，或Stem-Cell technologies开发的Easy-sep。
可替换地，可以使用较大尺寸的顺磁珠而不需要使用专用柱，但在与测试孔或试管一起使用时也可使用专用柱(例如，anti-EpCAMDynabeads)。
总之，在包括至少一种类型肿瘤细胞的细胞群中富集样本的步骤可通过由连续步骤组成的方法进行，该通过基于选自由以下的组中选择的至少一个参数的细胞的方式来进行：
a.质量密度；
b.形态学；
c.电特性；
d.化学特性；
e.机械特性；
f.表面抗原的表达；
g.细胞质内(intracytosolic)抗原的表达；
h.介电特性；
i.磁性；
l.几何特性(尺寸，等等)；以及
m.光学特性；
或它们的组合。
有利地，然后利用第二步进一步获得肿瘤细胞的富集，其中细胞的阳性或阴性选择是对在第一步中回收的单核细胞进行的。显然，第二富集步骤可包括基于表达或不表达特异性抗原的能力进行的选择，并用以下技术中的一种进行评价：
a.MACS，即，磁性激活细胞分选器；
b.DACS，即，介电电泳激活细胞分选器；
c.FACS，即，荧光激活细胞分选器。
单个肿瘤细胞的分离
接着，将含肿瘤细胞的样本插入微流体装置中，该微流体装置能够以自动或半自动非手动方式逐个选择单个细胞并分离这些细胞。为此目的，可以使用介电电泳分离(DEPArray，例如使用PCT/IB2007/000963或PCT/IB2007/000751中公开的技术，或Manaresi等人在IEEE J.Solid StateCircuits，38，2297-2305(2003)，以及Romani等人在Proceedings of theInternational Solid State Circuit Conference，1，224-225(2004)中描述的技术)，或光电阱(opto-electronic trap)或光电分离，或激光钳(laser tweezer)(参见，例如Reichle等人，Electrophoresis，22，272-82(2002)或Fiedler等人，Anal.Chem.，70，1909-15(1998))。
所述文献的内容结合于本文作为相关部分的仅供参考。
感兴趣细胞的鉴定可经例如传感器进行：
-外部传感器；
-光学传感器，如荧光显微镜；
或
-内部传感器；
-光学传感器，如专利WO2007049103和WO2007010367中公开的传感器，这两个专利描述了鉴定荧光细胞的集成方法；
-阻抗电势传感器(impedentiometric sensor)，如专利WO2007049103和WO2007010367中公开的传感器，其用于检测细胞的阻抗电势特性。
选择细胞的信号也可以是间接的，例如存在与抗体结合的微珠，而该微珠又进一步与细胞结合。与细胞结合的一个或多个微珠的存在可如前文所述那样利用阻抗电势传感器或光学传感器来检测(亮场或荧光中)。
根据本发明，通过利用微流体装置逐个操纵单个肿瘤细胞，优选以自动方式，包含在所提取的预富集样本中的肿瘤细胞被分离从而构成纯度至少为90％的待分析样本。
优选地，肿瘤细胞被分离从而构成纯度高于95％的待分析样本。甚至更优选地，肿瘤细胞被分离从而构成纯度为100％的待分析样本。
基因分析
关于根据本发明回收的肿瘤细胞，根据前面的说明，可进行各种类型的分析，使得能够实现不同分辨率和灵敏度水平且根据本研究诊断目的的基因表征或其染色体表征。
例如，可以对从出现转移的患者提取的CTC测序，以便检测K-RAS基因变异的存在。
在前列腺癌情形中，可以利用单细胞全基因组扩增来评价CTC是否存在缺失。
另外，在不明原发灶(unknown primary origin(CUP))癌症的情形中，可以经基因谱(genetic profile)和/或CTC的表达谱来鉴定原始组织，从而获得对选择最适当治疗十分重要的信息。
在扩散肿瘤细胞的情形中，可以执行对单个CTC和/或DTC的基因表达的分析，以便鉴定预后性指征和潜在的治疗靶标。
本发明实施方式的优选实施例
下文中描述的非限制性实施例是根据本发明的优选实施例，下面参考图1中给出的流程图进行说明。
起始样本(starting specimen)
在从健康男性供体提取的17ml的全血样本中掺加(spike)而引入2000个属于乳腺癌细胞系MCF7的细胞。
初步富集
本发明优选实施方式考虑了由连续步骤组成的方法。
(a)FICOLL。样本以抗凝剂(如EDTA)处理并优选在8h内转移到聚丙烯制成的50-ml消毒试管中。从其中取50μl，利用库尔特计数器(Coulter counter)对白细胞(WBC)和红细胞(RBC)进行计数。
然后用pH为7.2的PBS和EDTA(2mM)以1∶4稀释样本。
一定体积(≤30ml)的稀释血液在15ml的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)(密度＝1.077g/ml)上精确分层。
然后，样本在(无制动)斜转子离心机中以654g在22℃离心30min。
用移液管(巴斯德型)除去血浆-但也可使用自动移液管(automaticpipettator)-注意不要扰动界面处的淋巴细胞层。以滴定计数器小心收集该层并转移到50-ml的聚丙烯消毒锥形试管中。
该试管中注入PBS和EDTA(2mM)，振荡并在10℃以300g离心10min。
弃上清部分。
试管中注入PBS和EDTA(2mM)，再次振荡并在10℃以300g离心10min。弃除上清部分。
从样本中提取细胞沉淀物(即，外周血流单核细胞PBMNC的复合体)，将其再悬浮在5ml缓冲液中。从其中提取50μl等分试样以库尔特计数器进行WBC计数。
向试管注入缓冲液，振荡并在10℃以200g离心10min。弃上清部分。
作为Ficoll的替换，消除红细胞的预富集的第一步可通过选择性溶解红细胞来表示，这利用了细胞的化学特性。
(b)CD45MACS消减
将细胞沉淀物再悬浮于80μl的缓冲液中，总共107个细胞。
对于107个细胞，加入20μl的anti-CD45微珠。下面的步骤是振荡和在4℃孵育15min。
将缓冲液注入试管来洗涤细胞，并在10℃以300g离心10min。
弃去上清部分，并将细胞沉淀物再悬浮于500μl缓冲液中，总共108个细胞。
根据制造商提供的说明书，将LS型(Miltenyi)的MACS柱放置在合适的MACS分离器的磁场中。
在每个柱子上设置预过滤器。
分别用3ml缓冲液冲洗预过滤器和柱子。
将细胞悬浮液施加于柱子(或预过滤器)。
将含细胞悬浮液的试管清空，注入9ml缓冲液。
收集无标记细胞，并且重复三次加入3ml缓冲液洗涤柱子，每次加入都在前一步注入试管时进行。
从分离器取出柱子并将其设置在试管上。
利用移液管将5ml缓冲液引入到柱子中。
含有磁标记细胞的部分随后通过操作活塞(plunger)被立即排出。
为了进一步减少污染细胞的数目，可以使用带有由识别选择性存在于待消减细胞上的抗原的抗体功能化的磁微珠的消减混合物(depletioncocktail)，如anti-GPA微珠(从而从Ficoll消除残余的红细胞)。
为了更进一步减少污染细胞的数目，可以在磁性柱中执行第二次通过。
(c)固定和标记
MCAS后细胞以300g离心10min；将沉淀物再悬浮于40μl缓冲液中。
将样本转移到1.5-ml试管中。向其中加入760μl刚制备的4％的低聚甲醛，然后在室温下孵育20min。
在微量离心机中以0.2r.c.f.r.p.m.离心5min后，除去上清部分。
然后用1ml的PBS洗涤，在微量离心机中以0.2r.c.f.r.p.m.离心5min，并再次吸出上清液部分。
向其中加入100μl 3％的PBS/BSA(封闭缓冲液(blocking buffer))。
样本在室温下孵育10min。
在微量离心机中以0.2r.c.f.r.p.m.再离心5min后，然后吸出上清部分，用EpCAM-FITC和CD45-PE(根据制造商推荐的实验程序，Miltenyi)进行染色。
为了完成该过程，用1000μl超级缓冲液(Super Buffer)(Hepes 400mM，1％BSA)和以水稀释的1μl Hoechst 33324(100μg/ml)进行最后一次洗涤，且涡旋(vortex)样本。
样本经质量控制从而验证标记的荧光强度和总细胞浓度。将一部分标记的样本再悬浮于最小体积的用于介电电泳操作的特定缓冲液中，并加载到用于控制样本质量的装置上，并在荧光显微镜下控制：在不同通道中指出细胞的荧光强度，并在Hoechst 33324中对标记的细胞(总有核细胞)进行计数。如果细胞浓度高于适当操作分离单个细胞的装置的最优细胞浓度，则下一步是稀释样本从而获得所需浓度。
分离
然后将这样获得的细胞插入到芯片
Figure BDA0000073617530000141
CONV600K(由Silicon BioSystems公司制造，参见文献WO0069525)中以便进行介电电泳操作和肿瘤细胞分离。该装置整体在图2中示出。
样本经筛选、鉴定、和选择、分选、和回收肿瘤细胞。
以自动或手动方式在显微镜上以3个不同荧光通道(即，在3个不同波长)筛选被笼锁的细胞。DAPI通道(其中“DAPI通道”是指在蓝光中UV激发和发射，因此其也用于Hoechst 33324的可视化)中的观察能够鉴定(阳性)有核细胞，而在EpCAM和CD45通道中的观察能够区分肿瘤细胞(具有相容形态的DAPI+、EpCAM+和CD45-)、淋巴细胞(DAPI+、EpCAM-、CD45+)和乱真信号(具有与肿瘤细胞不相容的形态的DAPI+、EpCAM+和CD45+，或DAPI-、EpCAM+和CD45+，或DAPI+、EpCAM+和CD45-)。
图3A-图3B-图3C示出了在扫描CONV600K内的样本细胞的过程中获得的图像。更具体地，图3A示出了在所考虑的三个通道中的三个肿瘤细胞的图像。图3B示出了所考虑的三个通道的中假性细胞(spurious cell)的图像。图3C示出了所考虑的三个通道中的两个淋巴细胞的图像。
然后通过选择含有对DAPI(有核细胞)呈阳性、对EpCAM呈阳性、并且对CD45呈阴性的细胞的笼执行细胞选择。在芯片上鉴定16个细胞，其中某些是双重的(双份的，double)。在0.2-ml PCR管中的几微升(＜40μl)内最终回收15个细胞(其中某些是双重的)。
用Applied Biosystems Minifiler Kit试剂盒进行最终分析。
图4A-图4B-图4C-图4D中给出了用Minifiler Kit试剂盒进行的片段分析结果(QF-PCR)。在所考虑的四个荧光通道中，分析了不同的微卫星。应注意如何使得没有来自男性对象的等位基因污染的痕迹，其中肿瘤细胞是通过掺加而引入其全血的。
作为anti-EpCAM抗体的替换，可以使用不同类型的抗体，如识别一种或多种类型是细胞角蛋白的抗体，该抗体不在血液细胞中表达。
可替换地，可以使用对癌症更具特征的抗体(肿瘤特异性)，例如：
-对于前列腺，使用前列腺特异性抗原(PSA)；
-对于肺，使用甲状腺转录因子1(TTF-1)；
-对于乳房，使用人表皮生长因子受体2(HER2/neu).
应用的可能性
获得纯度为100％的CTC样本，然后是自动选择和分离过程，为多种状况提供可行诊断途径，否则不能准确、可靠、和精确地进行分析。
实施例1-癌症患者体内变异(例如，在K-RAS基因中)的无创性评价。
下面说明的是从受转移结肠-直肠癌(mCRC)侵袭的患者外周血流分离CTC的情形。
从患者抽取7.5ml的外周血的样本到具有EDTA抗凝血剂(BecktonDickinson)的Vacutainer管中。用库尔特计数器(Beckman Coulter)分析样本，具有42×106个白细胞(WBC)和43.95×109个红细胞(RBC)。然后经离心分离PBMC(在Ficoll 1077中)。用BSA和EDTA(RunningBuffer，Miltenyi)在PBS中洗涤回收的PBMC(基于库尔特计数器的计数为16.5×106)，并根据制造商的说明，用结合于anti-CD45和anti-GPA抗体(Miltenyi)的磁性微珠经消减来进行选择。在室温(RT)下以2％的PFA降得到的细胞(CD45和GPA的阴性部分)固定在PBS中20min。然后在PBS中洗涤，并在室温下在3％的PBS/BSA(封闭液)中孵育10min。在PBS中冲洗之后，在100μl的Miltenyi Running Buffer(电泳缓冲液，RB)中，以10μl结合于PE的anti-CD45抗体(Miltenyi)在4℃执行CD45标记10min。通过加入1ml的RB阻断反应，离心并抽取上清液部分。然后用90μl的InsidePerm(Miltenyi)对细胞进行可渗透化处理，同时以10μl结合于FITC的anti-CK抗体在室温下标记10min。加入1ml的InsidePerm终止反应，离心并除去上清液部分。将沉淀物再悬浮在为操纵以介电电泳固定和可渗透化处理的细胞优化的缓冲液中-Hepes(400mM)+在水中BSA(2％)(SB)-和DAPI(1mg/ml)，并且最后在SB中洗涤并再悬浮以便注入到芯片DEPArrayTM CONV600K(100,000个介电笼)中。芯片上出现近16,000个细胞。在DAPI/FITC/PE中筛选后，鉴定CTC。图5含利用本发明方法选择和分离的CTC图像(白色箭头指示)，适当处理所述图像以便突出显示三个通道中的荧光：绿色通道中结合于FITC的anti-CK MoAb(Miltenyi)；红色通道中结合于PE的anti-CD45MoAb(Miltenyi)；以及蓝色通道中用于细胞核的鉴定的DNA的DAPI标记。
应该注意到有多少可能性从处理的图像的分析明确区分不同类型的可能事件，而在不是基于图像而是基于整体荧光强度的较低精细度的分析中，图像可作为假阳性被丢弃。
例如，ID 382笼含有一对CTC。这些CTC显然在开始时就已经结合，因为三个CTC中的两个在同一个笼中终止(死亡，end up)的可能性可忽略。没有进行图像分析就可将该事件丢弃，因为如果抗体(例如，anti-CK)是以非特异性方式捕获的，则细胞簇一般能够产生假荧光信号。因此两个ID 382细胞的回收纯度为100％(并且其与大多数分析是分析相容的)。
ID 11439笼表示DAPI+/CK+/CD45+事件。没有进行图像分析就已将所述事件作为假性事件丢弃，但是，因为图像使得能够检测事件中的荧光分布，可以参考与三个其他CK-有核细胞(其中两个为CD45+)一起被笼锁的DAPI+/CK+/CD45-CTC(白色箭头指示)解读数据。所述笼的内容物可被分别回收。使用基于移动介电电泳笼的系统，可通过应用适当笼图案使最初共用同一个笼的细胞在单个笼内发生离析(分离，segregation)。如果不能从笼中其他污染细胞中离析CTC，则可在任何情形中回收笼中的内容物，污染物存在的信息与所述回收有关。这是根据本发明技术的进一步优点。注意到回收的细胞纯度下降，且这可在下游分析中加以考虑。因此在所讨论的情形中，细胞可与其他三个一起回收(纯度为25％)，或单独分离和回收从而获得纯度为100％的回收(如果单独分离的话)，或者如果与污染物一起分离，则纯度为50％，或如果将污染物和另外九个CTC一起分离，则纯度为90％，污染物不可能出现在其他笼中(不在该情形中)。
笼ID 5007表明这样的事件，基于总荧光，其表现为类似于ID 11439的事件，因为该事件是DAPI+/CK+/CD45+事件。然而，基于图像，可以就其连接于具有捕获的anti-CK抗体的簇来确定其如何为假性事件。
笼ID 13103表明这样的事件，基于总荧光，其表现为类似于ID 11439的事件，因为该事件是DAPI+/CK+/CD45+事件。然而，基于图像，可以就其连接于具有CD45+(非CTC)信号的单阳性双重细胞确定其如何为假性事件。
笼ID 8614示出了事件CK+/CD45-而不是DAPI-，没有分类为CTC。笼ID 7796示出了包括两个没有分类为CTC的细胞的对照事件(两个白血细胞)，因为它们是CK-并且其中一个也是CD45+。
因此，可根据该实验目的，按照样本纯度并根据从该细胞包括在其中的细胞团块(agglomerate)分离的容易程度分离感兴趣的细胞。在这个意义上，基于图像的选择对排除假阳性和假阴性是特别有效的。
作为Ficoll的替换，可以使用基于选择性溶解红血细胞(RBC)的技术。在该情形中，样本中也保持初始的粒细胞。在所述RBC除去后，可经阳性免疫磁选(如利用结合于anti-EpCAM抗体的磁性微珠)、或阴性免疫磁选(如利用结合于anti-CD45抗体或具有CD45和CTC中没有出现抗原的其他抗体混合物的磁性微珠)来进一步富集肿瘤细胞。在任何情形中，少数出现的CTC是在含几万或几十万白血细胞的样本中获得的。
从外周血流分离CTC类似地可与FDA批准的富集和标记程序(如Veridex CellSearchTM系统)相容。在该情形中，CellSearch系统也可用于以自动方式进行标记和富集(借助AutoPrep机)。借助于该系统，在典型的仅具有数千个污染白细胞(典型值为1000-5000)的样本中获得少数出现的CTC(最优产率约90％)。CellSearch AutoPrep代表了优异的富集系统，其主要限制在于该系统基于EpCAM-阳性免疫磁选。因此，在一些类型的肿瘤中，其中CTC没有过表达EpCAM，可以仅发现少数CTC。在这样的情形中，阴性选择更多指示CD45+细胞的消减。
K-RAS基因的突变状态检测具有相当的临床重要性，因为其已经证明K-RAS的某些突变与基于针对EGFr受体的单克隆抗体的疗法无治疗关联。实际上，尽管上游EGFr抑制，所述突变激活下游细胞增殖机制。用西妥昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗(Panitumumab)的治疗以表明仅适用于野生型K-RAS的患者。鉴定CTC中突变的可能性赋予了不必求助于活组织检查的可能性，特别是在不可进行活组织检查或执行非常复杂的所有情形中。即使在有手术切除的组织可用时，分析CTC的可能性在任何情形中都会引起关注。肿瘤从基因角度看本质上是不稳定的，并且转移可源自位于与原发肿瘤不同位置处的细胞；因此，CTC能够更好地反映经历转移的细胞的分子分布(molecular profile)。
为了验证从CTC检测K-RAS变异的可能性，分析可来自患有结肠-直肠转移癌症的患者外周血的CTC(mCRC)。在上述富集过程之后，在DEPArrayTM上标示并分离CTC。100％的纯度使得能够在预先扩增(例如利用巢式PCR扩增)起始拷贝后，经测序检测可能存在的突变，测序是用已知技术进行的。
在所讨论的情形中，下游分析是用DOP-PCR技术用Sigma公司出产的Omniplex试剂盒进行的。扩增后，用Applied Biosystems公司制造的毛细管-电泳测序仪来分析产物。
图6示出了检测一个所分析样本中突变的实例，其相应于密码子12中甘氨酸到缬氨酸的突变(图7中示出了相应阴性对照)。
实施例2-对经单细胞全基因组扩增和CGH阵列分析具有缺失的CTC(例如，在前列腺癌症中)的评价。在该情形中，在不同孔中进行待回收的单细胞的分离是有利的。以这种方式，分析考虑到了细胞群异质性，并且不仅提供了平均信号，而且还提供了关于每个细胞的多重信号(multiple signals)，从而更易于鉴定仅存在于某些肿瘤细胞中的突变。
实施例3-经基因谱和/或CTC的表达谱，无创性鉴定CUP肿瘤中原始组织。
实施例4-单个扩散肿瘤细胞(DTC)上基因表达的分析，以便鉴定预后性指征和潜在的治疗靶点。在该情形中，在不同孔中进行待回收的单细胞的分离也是有利的。以这种方式，分析考虑到了细胞群异质性，并且不仅提供了平均信号，而且提供了每个细胞的多重信号，从而更易于鉴定仅存在于某些肿瘤细胞中的突变。
实施例5-如上文中提到的，一般而言，上文中关于“细胞分离”所述的应理解为也可应用于“细胞各部分的分离”，如，细胞核。实际上，这使得在任何情形中，对于某些类型生物分子信息，都能获得重要信息(例如，通过评价包含在细胞核中的基因组DNA)。
在细胞核分离的实施例中，细胞的选择可经以可区别方式从非肿瘤细胞中标记肿瘤细胞(CTC或DTC)的细胞核的技术来进行，如FISH。在该情形中，多重信号的存在揭示了存在基因组DNA复本(肿瘤细胞的特征，一般不出现在正常细胞中)。
具体地，在乳腺癌的例子中，在评价关于HER2基因的基因组区(genomic region)时，人们通常对位于染色体17的复本感兴趣。因此，应用两种类型的探针，一类用于染色体17的着丝点，另一类用于HER2基因。如果基因/染色体之比高于2，则该细胞常规上被认为是测试阳性的。所述信息在使用诸如曲妥珠单抗(赫塞汀)的药物的情况下具有隐含意义(implication)，该药物仅在相应的HER2受体过表达的情况下是有效的。不仅进行计数，而且还鉴定和分离纯化形式的所述细胞，以使得能够获得关于肿瘤基因特征的进一步信息。
实施例6
DNA中拷贝数变化(CNV)的存在构成肿瘤的典型特征。对于新药物的评价，能够评价CNV以便将其与疾病过程关联具有相当意义，并且可能与CNV对疾病过程有显著影响的基因组区域(area)相关联(包括在有利的预后的情形和不利的预后情形中)。该信息可有助于鉴定可作为药理作用靶点的基因。而且，在癌症诊断阶段，可以最小创伤方式确定患者CTC的CNV分布，以便基于获得的经验来调整治疗。
为了证明确定具有CTC的CNV小样本可能性，且相应地，小阴性对照样本被分开和分离。
从患有转移乳腺癌(mBrCa)的患者取7.5ml外周血样本，并置于CellSave管(Veridex)中。根据标准程序，以CellSearch AutoPrep富集样本并以荧光抗体(结合于PE的anti-CK、结合于APC的anti-CD45)和DAPI标记。富集的细胞是从Veridex柱(cartridge)提取的，并再悬浮于减小的体积中。所述样本注入到具有307,200个电极和大量可编程笼的芯片DEPArrayTM A300K(Silicon Biosystems公司)中，笼数量通常在19,200和76,800之间。在筛选后，存在分离的具有五个细胞的两个阴性对照组、具有五个CTC的两个样本、具有单个CTC的一个样本[？CONTROLLARE-L’ITALIANO NON E’COMPRENSIBILE]。
图8和图9分别示出了在第一次和第二次回收中回收的细胞，以五个白细胞的每一个(DAPI+/CD45+/CK-)作为CNV检测的阴性对照。图10示出了独立回收的作为CNV分析对象的五个CTC。
在用根据本发明方法进行选择和分离后，假定现在可用样本的纯度高于90％(在所讨论的情形中，图10示出了100％回收CTC)，根据文献EP1109938中示出的方法，可成功进行基于全基因组扩增的分析，连接介导PCR，然后是中期比较基因组杂交(CGH)或CGH阵列，对于较低纯度的样本，这将是不可能的或本质上不可靠的，因为在非肿瘤细胞出现的情形中，检测的信号太弱或模糊。

Claims (29)

1.一种用于诊断肿瘤状况和/或相应的肿瘤发展状况的方法，包括以下步骤：
a.从患者获取有机液体样本，所述有机液体含有至少一种循环肿瘤细胞或扩散肿瘤细胞或其部分的可能性高；
b.在至少一个细胞群中富集所述有机液体的所述样本，所述细胞群包括至少一种类型的循环肿瘤细胞或扩散肿瘤细胞或其部分；
c.从所述至少一种类型的循环肿瘤细胞或扩散肿瘤细胞或其部分中分离至少一种细胞，获得纯化的样本；
d.以这样的方式对所述纯化的样本进行分子分析，以便突出所述至少一个适于使所述诊断得以进行的所述至少一个细胞的至少一个特征；
所述方法的特征在于，从至少一种类型的循环肿瘤细胞或扩散肿瘤细胞或其部分中分离至少一个细胞或部分细胞的所述步骤是通过在微流体装置中逐个选择单个细胞或细胞部分来进行的，以获得纯度至少为90％的纯化的样本。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，实施从至少一种类型的循环肿瘤细胞或扩散肿瘤细胞或其部分中分离至少一个细胞或部分细胞的所述步骤，以获得纯度至少为95％的诊断样本。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，实施从至少一种类型的循环肿瘤细胞或扩散肿瘤细胞或其部分中分离至少一个细胞或部分细胞的所述步骤，以获得纯度至少为100％的诊断样本。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述微流体系统以非手动方式分离所述细胞。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述微流体系统以自动或半自动方式分离所述细胞。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述逐个选择所述细胞是基于在所述有机液体不流动时评价的参数进行的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述逐个选择所述细胞是基于图像进行的。
8.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述图像包括荧光图像。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述逐个选择所述细胞是基于阻抗电势特性进行的。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括用至少一种类型的示踪物标记所述循环肿瘤细胞或扩散肿瘤细胞或其部分的步骤。
11.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述至少一种类型的示踪物是FISH探针。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述至少一种类型的示踪物是与选自下组的标记物结合的抗体：
-荧光体
-色原体
-(荧光或非荧光)微珠。
13.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述至少一种类型的抗体识别选自以下组中的抗原：
·EpCAM
·细胞角蛋白8
·细胞角蛋白18
·细胞角蛋白19
·细胞角蛋白20
·CD45
·EGFR
·IFGR
·PSA
·TTF1
·HER2/neu
·MUC-1。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，分离循环肿瘤细胞或扩散肿瘤细胞或其部分中的至少一个细胞或部分的所述步骤是通过逐个选择在所述微流体装置中出现的、以所述至少一种示踪物事先标记的单个细胞来进行的。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，从至少一种类型的循环肿瘤细胞或扩散肿瘤细胞或其部分中分离至少一个细胞或细胞部分的所述步骤是这样进行的，即捕获单个细胞，优选每个单个细胞在所述微流体装置的多个部位的特定部位，所述多个位点是根据阵列设置在微流体装置中的，接着基于至少一个可利用所述微流体装置内部或外部传感器检测的参数，通过从捕获的细胞中选择单个细胞。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，富集所述有机液体样本的所述步骤包括基于从下组中选择的至少一个参数来选择细胞：
a.质量密度；
b.形态学；
c.电学特性；
d.化学特性；
e.机械特性；
f.表面抗原的表达；
g.细胞质内抗原的表达；
h.介电特性；
i.磁特性；
l.光学特性；
m.几何特性；
或它们的组合。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在包含至少一种类型的循环肿瘤细胞或扩散肿瘤细胞或其部分的至少一个细胞群中富集所述有机液体样本的步骤包括处理所述有机液体的所述样本以使得所述有核细胞分开并随后在有核细胞中将其富集的步骤。
18.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，在包含至少一种类型的循环肿瘤细胞或扩散肿瘤细胞或其部分的至少一个细胞群中富集所述有机液体的所述样本的步骤至少包括以密度梯度离心所述有机液体的所述样本的步骤。
19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，在包含至少一种类型的循环肿瘤细胞或扩散肿瘤细胞或其部分的至少一个细胞群中富集所述有机液体的所述样本的步骤至少包括进行红细胞选择性溶解的步骤。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在包含至少一种类型的循环肿瘤细胞或扩散肿瘤细胞或其部分的至少一个细胞群中富集所述有机液体的所述样本的步骤至少包括根据至少一项下列形式，经由结合于抗体的磁珠来进行阳性和/或阴性选择的步骤：
a)CD45阴性
b)CD45和GPA阴性
c)CD45和CD14阴性
d)CD45、CD14和GPA阴性
e)EpCAM阳性
f)CK阳性。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一个富集步骤是结合所述分离步骤在用于进行所述分离步骤的同一微流体装置内执行的。
22.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于，所用微流体装置装配有彼此分开并液压连接的多个不同腔室，并且在至少一面上由单个芯片或多个分开的芯片划界。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述分子分析的步骤是利用选自以下的程序进行的：
-测序
-微卫星分析
-比较基因组杂化(CGH)
-阵列CGH
-端点PCR
-实时PCR
-甲基化分析：
○利用焦磷酸测序法进行定量甲基化分析
○亚硫酸氢盐基因组测序PCR(BSP)；
○甲基化特异性PCR(MSP)；
○结合重亚硫酸盐限制性内切酶法分析DNA(COBRA)；
○甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(MS-SNuPE)；
-基因表达分析
○RT-PCR；
○单细胞基因表达；
○数字PCR。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述分子分析的步骤旨在评价点(单-核苷酸)突变的存在。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述点(单-核苷酸)突变与K-RAS和/或B-RAF基因有关，并且其存在是患者对预定治疗无响应的指标。
26.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其特征在于，所述分子分析的步骤旨在评价肿瘤抑制基因的超甲基化的存在。
27.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其特征在于，所述分子分析的步骤旨在评价是否存在缺失和/或复本。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述分子分析的步骤旨在评价疑似前列腺癌症患者体内肿瘤细胞的染色体区13q14中是否存在缺失。
29.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其特征在于，所述分子分析的步骤旨在评价疑似前列腺癌症患者体内肿瘤细胞的BCL2、CCND1和WNT3A中至少一个基因的过表达。
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