CN115896028B - 分离循环肿瘤细胞用的试剂组合及其用途 - Google Patents
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Abstract
本公开提供一种分离循环肿瘤细胞用的试剂组合及其用途。本公开的试剂组合可以用于捕获活的肿瘤细胞。该方法能用非固定的方式从待测样本中富集分离活的目标循环肿瘤细胞，分离富集到的肿瘤细胞具有高细胞活性，且可再培养。
Description
技术领域
本公开涉及微流控分离技术领域，具体涉及一种分离循环肿瘤细胞用的试剂组合及其用途。
背景技术
癌症是威胁人类生命健康重大的疾病之一，而转移是导致癌症死亡最主要的原因。预防或减少转移并因此提高生存率是实体肿瘤治疗最重要的目标之一。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是指从原发肿瘤脱落，在血液和淋巴管中循环到远处器官定植的肿瘤细胞，负责转移的开始和将癌症传播到远处。CTCs可用于癌症诊断和癌症状态的监测，是追踪肿瘤细胞转移的关键。早期肿瘤患者采用手术切除后虽然对局部确诊的疾病看似具有“治愈性”，但是在5年内超过50％的患者会发生复发与转移，主要原因在于患者外周血中已经存在CTCs，而这部分CTCs不能被影像学检测到。临床研究证明，CTCs与多种癌症如乳腺癌、结直肠癌、肺癌和前列腺癌等的疾病进展相关。因此，在实体瘤患者的复发和生存上CTCs是有用的预后和预测标志物。CTCs的分离和培养对癌症的早期诊断和临床治疗具有很重要的临床研究价值，检测患者外周血等中的循环肿瘤细胞数目可用于实体瘤患者的预后及预测化疗的有效性，患者CTCs的体外培养可用于临床上筛选确定药物的有效性。
但是，CTCs的富集分离和培养方面面临诸多困难与挑战。首先，外周血中的CTCs数目极为稀少(每毫升血约含有1～100个CTCs，成年男性红细胞4.0～5.5×109/ml，白细胞为4.0～10.0×106/ml)，这要求所用分离方法能高效准确地从大量非目标细胞中检测出极少的目标细胞。其次，由于外周循环的剪切力、免疫系统攻击以及细胞附着和细胞-基质连接丧失，导致血液中的大部分CTCs处于凋亡状态，仅有一小部分具有高度活性与转移潜能的CTCs能够在血液循环中生存并发生远端器官的转移。这一部分极可能是真正具有临床意义、对治疗具有重要价值的CTCs。目前的CTC多基于固定细胞的富集分离，分离后的细胞不能用于后续培养分析。另外，目前关于体外培养CTCs的文献报道非常有限，其原因可能在于细胞难以富集，培养条件不当等。常见的CTCs培养基多用于二维(2D)细胞培养，然而，二维的细胞培养模型比较简单，并且这种模型不能准确描述和模拟在体内观察到的丰富的环境和复杂的过程，如细胞信号转导、化学梯度或空间结构变化等。因此，用2D细胞培养方法收集的数据可能对其体内应用预测具有误导性。三维(3D)细胞培养技术能够更好地模拟生物体内细胞存活的自然环境，其自然条件可保持细胞间相互作用和更逼真的生化和生理反应。在3D环境中，细胞对内源性和外源性刺激(如温度、pH、营养吸收、转运和分化等方面的改变)应答更接近于它们在体内的反应。
目前CTCs的富集分离方法主要分为物理法和生物化学法两大类。物理法基于肿瘤细胞与正常细胞的物理区别，如大小、变形性、密度、介电性等，利用外力场如磁场、电场等的作用进行分离捕获。生物化学法通常依赖于细胞膜表面的抗原与偶联在分离介质上的抗体相结合，以达到分离捕获的目的。目前主要包括基于细胞目睹的离心法，基于细胞体积大小的滤膜过滤法，基于肿瘤标记物的免疫磁珠法、基于微流控芯片法等CTCs富集技术。
LiquidBiopsy是利用免疫磁珠法以及癌种特异的混合抗体对外周血中的CTC进行分离富集的系统，CTCs可以在磁场作用下吸附在微流控芯片上。但该系统目前的细胞富集条件基于固定细胞处理，分离富集的循环肿瘤细胞不能再进行培养，影响了下游的进一步研究。
因此，综上所述，急需探究发展一种基于LiquidBiopsy系统的新的循环肿瘤细胞分离和培养技术，从待测样本中富集高细胞活性的循环肿瘤细胞，保证细胞特异性的同时，有效实现CTCs的体外快速扩增。这将更有利于提高检测结果的参考评估价值，辅助临床获取更为客观的检测结果，从而优化患者的治疗方案，有效提升治疗效率。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本公开的目的在于提供一种基于鞘流装置的分离和培养循环肿瘤细胞的方法及层流试剂组合，富集活性循环肿瘤细胞的同时，保持细胞特异性，减少肿瘤细胞的损伤，还可以用于后续细胞增殖培养。
为了实现上述目的，本公开采用以下具体方案：
在一方面，本公开提供了一种分离循环肿瘤细胞用的层流试剂组合，其包括顶部缓冲液、样本缓冲液和底部缓冲液，任选地，所述试剂组合还包含清洗液，其中：
所述顶部缓冲液为含BSA或FBS的缓冲溶液；
所述样本缓冲液为含稀释的Ficoll缓冲液的缓冲溶液；
所述底部缓冲液为Ficoll缓冲液；
所述清洗液为含BSA或FBS的缓冲溶液；优选地，所述清洗液还包含EDTA；
所述缓冲溶液为PBS溶液、hepes缓冲液、Hanks’平衡盐溶液中的任一种；优选地，所述缓冲溶液为PBS溶液。
在另一方面，本公开提供了一种分离循环肿瘤细胞用的试剂盒，其包含前述的试剂组合。
在另一方面，本公开提供了一种基于上述的试剂组合或试剂盒分离和培养循环肿瘤细胞的方法，其中，包括以下步骤：
(1)从受试者获得待测样本，用红细胞裂解液对待测样本进行前处理；
(2)利用细胞的物理性质或表面蛋白直接或间接富集循环肿瘤细胞，收集分离后的细胞；
(3)对步骤(2)分离到的细胞进行体外培养。
在另一方面，本公开提供了一种基于前述试剂组合、前述试剂盒或前述的方法在筛选抗癌药物或确定抗癌药物有效性中的应用。
本公开所取得的有效效果至少如下：
1.本公开提供一种新的试剂组合，该组合物与LiquidBiopsy系统结合可以捕获活的肿瘤细胞，富集到的肿瘤细胞可再培养。采用该方法能采用非固定的方式从待测样本中富集分离到活的目标循环肿瘤细胞，且富集到的肿瘤细胞可再培养，有利于后续循环肿瘤细胞的体外快速扩增。
2.为了减少样本前处理过程中红细胞裂解液对循环肿瘤细胞的伤害作用，本公开对红细胞裂解的条件进行摸索，并筛选了具有抗凋亡作用的活性因子添加剂，有效减少样本前处理过程中目标细胞的损耗。
3.本公开提供了一种新的分离和培养循环肿瘤细胞的方法，该方法基于前述的试剂组合，并在磁力分离装置设置灭菌隔膜，在有效避免细菌污染的基础上，实现分离肿瘤细胞的再培养。
附图说明
图1：不同配比配置的分层液流组合物的分层情况。
图2：不同浓度Ficoll配置的样本缓冲液在Liquidbiopsy系统中的肿瘤细胞回收率。
图3：不同浓度Ficoll配置的样本缓冲液在Liquidbiopsy系统中富集循环肿瘤细胞后的白细胞残留量。
图4：富集分离的肿瘤细胞的Calcein-AM/PI荧光显微图片。
图5：富集分离的肿瘤细胞与对照组中凋亡细胞的定量示意图。
图6：改变样本缓冲液和清洗液配比后的循环肿瘤细胞回收率和白细胞残留量。
图7：清洗液增加EDTA后的循环肿瘤细胞回收率和白细胞残留量
图8：芯片隔膜放置示意图。
图9：分离的肿瘤细胞再培养5天后的荧光显微形态图。
图10：不同裂解液比例和时间处理的肿瘤细胞凋亡比例。
图11：红细胞裂解液中添加不同活性因子的肿瘤细胞凋亡变化。
图12：目的肿瘤细胞的捕获和培养流程图。
图13：富集分离的肿瘤细胞3D培养14天后细胞形态图。
图14：小细胞肺癌病人外周血样本循环肿瘤细胞捕获培养1天，14天，28天的细胞显微形态图。
图15：乳腺癌病人外周血样本循环肿瘤细胞捕获培养1天，14天，28天的细胞显微形态图。
图16：健康人外周血样本培养14天后细胞形态图。
具体实施方式
在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
除非另有定义，本公开所使用的所有的技术和科学术语与属于本公开的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本公开的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本公开。
本公开的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本公开中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语地定义和解释。
密度梯度离心介质：指具有特定密度物理特性的介质，包括聚蔗糖、泛影葡胺、葡聚糖胺、氯化铷、溴化铯、碘克沙醇等类型，一般通过不同比例混合或其他介质稀释得到具有特定密度的溶液或颗粒悬浮液。常见的密度梯度离心介质包括Ficoll、Percoll、Histopaque、Optiprep、Nycodenz、Polymorphprep缓冲液等，其中Ficoll缓冲液的密度为1.07g/mL。
磁珠：指具有磁性的微小颗粒，免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。
LiquidBiopsy系统：指备案号为粤珠械备20170142号的自动化细胞富集分离系统，生产厂家为珠海圣美生物诊断技术有限公司。
Rock抑制剂：Rock是一个特殊的信号通路，它对细胞集落形成和干细胞间相互作用等方面有重要作用。
V4-4捕获抗体是一种抗体混合物，其中抗EGFR抗体：抗TROP2抗体：抗HER2抗体：抗EpCAM抗体的质量比分别为2:1:1:1。
在一方面，本公开提供了一种分离循环肿瘤细胞用的试剂组合，其包括顶部缓冲液、样本缓冲液和底部缓冲液，任选地，所述试剂组合还包含清洗液，其中：
所述顶部缓冲液为含BSA或FBS的缓冲溶液；
所述样本缓冲液为含稀释的Ficoll缓冲液的缓冲溶液；
所述底部缓冲液为Ficoll缓冲液；
所述清洗液为含BSA或FBS的缓冲溶液；优选地，所述清洗液还包含EDTA；
所述缓冲溶液为PBS溶液、hepes缓冲液、Hanks’平衡盐溶液中的任一种。
在本公开的一些实施方案中，所述缓冲溶液为PBS溶液。
在本公开的一些实施方案中，所述试剂组合用于鞘流装置。
在本公开的一些实施方案中，所述鞘流装置为微流控芯片装置。
在本公开的一些实施方案中，所述顶部缓冲液为含0.1％-0.5％BSA的PBS溶液或含1.0％-5.0％FBS的PBS溶液。
在本公开的一些实施方案中，所述顶部缓冲液中中含0.2％BSA的PBS溶液或2％FBS的PBS溶液。
在本公开的一些实施方案中，所述样本缓冲液为含体积百分比为10％-40％的Ficoll、体积百分比为60％-90％的2％-10％FBS的PBS溶液。
在本公开的一些实施方案中，所述样本缓冲液为含体积百分比为20％的Ficoll、体积百分比为80％的5％FBS的PBS溶液。
在本公开的一些实施方案中，所述样本缓冲液为含体积百分比为10％-40％的Ficoll、体积百分比为60％-90％的0.2％-1.0％BSA的PBS溶液。
在本公开的一些实施方案中，所述样本缓冲液为含体积百分比为20％的Ficoll、体积百分比为80％的0.5％BSA的PBS溶液。
在本公开的一些实施方案中，所述底部缓冲液为Ficoll原液。
在本公开的一些实施方案中，所述清洗液中含0.2％-1.0％的BSA。
在本公开的一些实施方案中，所述清洗液中含0.5％的BSA。
在本公开的一些实施方案中，所述清洗液中EDTA的摩尔质量浓度为0.2-2mM。
在本公开的一些实施方案中，所述清洗液中EDTA的摩尔质量浓度为1mM。
在另一方面，本公开提供了一种分离循环肿瘤细胞用的试剂盒，其包含前述的试剂组合。
在另一方面，本公开提供了一种基于前述的试剂组合或前述的试剂盒分离和培养循环肿瘤细胞的方法，其中，包括以下步骤：
(1)从受试者获得待测样本，用红细胞裂解液对待测样本进行前处理；
(2)利用细胞的物理性质或表面蛋白直接或间接富集循环肿瘤细胞，收集分离后的细胞；
(3)对步骤(2)分离到的细胞进行体外培养。
在本公开的一些实施方案中，所述步骤(1)中红细胞裂解液和待测样本的体积比为3-6:1。
在本公开的一些实施方案中，所述步骤(1)中红细胞裂解液和待测样本的体积比为5:1。
在本公开的一些实施方案中，所述步骤(1)中细胞裂解的时间为8-15min。
在本公开的一些实施方案中，所述待测样本选自患有癌症个体的血液、胸腔积液、腹腔积液、唾液、尿液、脑脊液或心包积液中的一种或多种。
在本公开的一些实施方案中，所述癌症选自脑星形胶质母细胞瘤、咽头癌、肾上腺肿瘤、AIDS-相关癌症、腺泡状软组织肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、肾嫌色细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜细胞瘤、尤文肿瘤、骨外黏液样软骨肉瘤、骨纤维发育不全、骨纤维性发育不良、胆囊或胆管癌、胃癌、妊娠滋养细胞病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤性肿瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺瘤、小儿癌症、外周神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、黑色素瘤、肾转移性癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌或子宫癌；优选为卵巢癌、肝癌、肺癌、乳腺癌中的一种或多种。
在本公开的一些实施方案中，所述肿瘤细胞为人肿瘤细胞。
在本公开的一些实施方案中，所述红细胞裂解液包括Rock抑制剂和抗氧化物。
在本公开的一些实施方案中，Rock抑制剂为Y-27632，所述抗氧化物选自还原性谷胱甘肽、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、硒、铜或茶多酚。
在本公开的一些实施方案中，所述抗氧化物为还原型谷胱甘肽。
在本公开的一些实施方案中，所述所述Rock抑制剂Y-27632浓度为5-15μM，还原型谷胱甘肽地浓度为1-10mM。
在本公开的一些实施方案中，所述Y-27632浓度为10μM，还原型谷胱甘肽地浓度为5mM。
在本公开的一些实施方案中，所述利用细胞表面蛋白直接或间接富集循环肿瘤细胞的方法为正向磁珠富集法、负向磁珠富集法或微流控芯片法，其中，具体步骤包括：加入捕获抗体孵育后离心，用磁珠孵育待用，通过磁力分离装置吸引磁珠富集循环肿瘤细胞，
所述捕获抗体为生物素标记的捕获抗体，所述磁珠为亲和素标记的磁珠。
在本公开的一些实施方案中，所述亲和素为链霉亲和素或中性亲和素。
在本公开的一些实施方案中，所述亲和素为链霉亲和素。
在本公开的一些实施方案中，所述磁力分离装置为磁力分离架或LiquidBiopsy装置。
在本公开的一些实施方案中，所述磁力分离装置的芯片设有灭菌隔膜。
在本公开的一些实施方案中，所述灭菌隔膜为经过灭菌或经过消毒的膜。
在本公开的一些实施方案中，所述膜为塑料或纸张。
在本公开的一些实施方案中，所述捕获抗体包括正向捕获抗体和负向捕获抗体。
在本公开的一些实施方案中所述正向捕获抗体选自抗EpCAM抗体、抗HER2抗体、抗TROP2抗体、抗EGFR抗体、抗CK抗体、抗CEA抗体、抗MUC1抗体、抗ALK抗体、抗C-MET抗体、抗TAG-12抗体、抗IGF1R抗体、抗TACSTD2抗体、抗CD318抗体、抗CD104抗体、抗GP75抗体、抗GP100抗体、抗MelanA/MART1抗体、抗Trp2抗体、抗MAGE-A1抗体、抗MAGE-A4抗体、抗BAGE抗体、抗GAGE抗体、抗PSMA抗体、抗PSCA抗体、抗PCSA抗体、抗CD310抗体、抗CK18抗体、抗CK19抗体、抗TCEA抗体、抗CD34抗体、抗CD146抗体、抗CD62抗体、抗CD105抗体、抗CD106抗体、抗6B5抗体、抗N-钙粘着蛋白抗体中的一种或多种。
在本公开的一些实施方案中，所述负向捕获抗体选自抗CD45抗体、抗CD14抗体、抗CD55抗体、抗CD66b抗体，抗CD19抗体，抗CD33抗体的一种或多种。
在本公开的一些实施方案中，所述捕获抗体为混合抗体。
在本公开的一些实施方案中，所述混合抗体中抗EGFR抗体：抗TROP2抗体：抗HER2抗体：抗EpCAM抗体的质量比分别为2:1:1:1。
在另一方面，本公开提供了一种前述试剂组合、前述试剂盒、前述方法在筛选抗癌药物或确定抗癌药物有效性中的应用。
实施例
下面通过具体实施的方式来进一步说明本公开的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本公开，不应视为对本公开的具体限制。
实施例中Ficoll或FBS浓度为体积百分比浓度，BSA浓度为质量体积百分比浓度。
实施例1基于Liquidbiopsy系统的分离方法改良
LiquidBiopsy是可以利用免疫磁珠以及癌种特异的混合抗体对外周血中的CTC进行分离富集的系统，CTC可以在磁场作用下吸附在微流控芯片上。该系统目前的循环肿瘤细胞富集体系适用于固定细胞的富集分离及后续分析，但该体系分离富集的循环肿瘤细胞不能进行培养，存在一定的局限性。因此，为了在该体系下分离到能够进行后续培养的活细胞，适配后续的分离细胞培养过程，发明人对Liquidbiopsy系统分离方法进行改良探究。本实施例中使用的密度梯度离心介质为Ficoll缓冲液(P8900，索莱宝(Solarbio))，密度为1.077±0.001g/mL，作为用于稀释成含不同浓度Ficoll的稀释液的原液。
1.1层流试剂组合组分改良探究
1.1.1缓冲液溶液配制
顶部缓冲液：配制含2％FBS的PBS溶液，并添加食用色素测试液A套(阿拉丁，货号：F406284-1Set)中绿色染料；
样本层缓冲液：用含5％FBS的PBS溶液将Ficoll缓冲液分别稀释成按体积百分比计的10％、20％、40％和60％的浓度，得到含10％Ficoll的溶液、含20％Ficoll的溶液、含40％Ficoll的溶液和含60％Ficoll的溶液，在上述稀释后的溶液中加入食用色素测试液A套中红色染料；
底部缓冲液：添加食用色素测试液A套中蓝色染料的Ficoll缓冲液。
1.1.2分层性能探究
上层和样本层分层性能探究实验组：分别取400μL配制好的含不同浓度Ficoll溶液的样本层缓冲液加入1.5mL的EP管中，再缓慢加入400μL的顶部缓冲液。室温静置观察。
上层、样本层和底层分层性能探究实验组：取400μL的Ficoll缓冲液加入1.5mL的EP管中，再缓慢加入200μL的不同浓度Ficoll的样本缓冲液，最上层加入200μL的顶部缓冲液。室温静置观察。
1.1.3结果
由图1可见，不同浓度Ficoll的样本缓冲液中，10-40％浓度的样本缓冲液室温静置4h后均可与顶部缓冲液形成明显分界，同时以20％浓度为例，该浓度下的样本缓冲液与顶部和底部缓冲液分隔明显，可形成分层液流。
1.2层流试剂组合用于LiquidBiopsy系统捕获活细胞
1.2.1样本制备
(1)取8mL新鲜全血，加入新鲜配置的40mL 1×红细胞裂解液，速度25rpm下室温旋转7min；500g离心5分钟，吸去上清，用20mL PBS重悬，500g离心5min，重复两次，将沉淀用1mL含有10％FBS的PBS重悬，备用；
(2)胰酶消化收集MDA-MB-231-GFP细胞(购自中国科学院细胞库，货号SCSP-503)，用含有10％FBS的PBS清洗细胞，计数，取1000个细胞加入1.2.1(1)制备的细胞悬液中混匀，加入18μL的捕获抗体V4-4抗体混合物(抗EGFR抗体：抗Trop2抗体：抗HER2抗体：抗EpCAM抗体的质量比分别为2:1:1:1)，置于4℃旋转孵育1小时，转速15rpm。
1.2.2层流试剂组合准备及脱气
将顶部缓冲液(含2％FBS的PBS)、底部缓冲液(Ficoll缓冲液，密度1.077±0.001g/mL)、样本缓冲液与清洗液分别制备好，其中样本缓冲液与清洗液的不同组别设置如表1所示，备好后脱气60min。
清洗液同样为中间的层流，用于清洗盛有样本的瓶子或器具。本公开中的清洗液具有两个效果，一是减少盛器中细胞的残留，二是冲刷粘附在芯片壁上的白细胞。
表1不同配比的样本缓冲液及清洗液
样本缓冲液配制方法(示例)：
芯片2中使用的样本缓冲液的配制方法：将1份体积的Ficoll缓冲液与9份体积的含5％FBS的PBS溶液混合，得到含体积百分比为10％的Ficoll、体积百分比为90％的5％FBS的PBS。
1.2.3磁珠孵育
将孵育好捕获抗体的样本500g离心3min，弃上清，用1mL各自对应的样本缓冲液重悬细胞。加入20μL链霉亲和素标记的磁珠(50-400nm)，于4℃旋转孵育30分钟，速度15rpm。将磁珠免疫标记过的样本500g离心3min，弃去上清，用对应的样本缓冲液重悬细胞。
1.2.4上机检测
(1)按照生产厂家说明书，对LiquidBiopsy机器进行预处理。
(2)将芯片放入脱气完成的40ml含2％FBS的PBS，100g离心1分钟后将芯片安装在芯片支架上。将样本管、样本缓冲液管、清洗液管依次放入LiquidBiopsy机器中，开始细胞分离。
(3)将芯片架取出机器，用灭菌纸吸去芯片表面多余液体，放置在显微镜载物架上静置30分钟。选择芯片自动扫描程序扫描、成像细胞。扫描结束后分别统计肿瘤细胞数及白细胞数量。
1.2.5实验结果
Ficoll缓冲液可形成稳定层流，用于Liquidbiopsy系统中捕获肿瘤细胞，由图2可见，样本缓冲液中添加Ficoll可增加肿瘤细胞回收率，其中Ficoll体积百分比为20％时，肿瘤细胞回收率最高。
由图3可见，样本缓冲液中Ficoll体积百分比为10％-40％时可有效降低富集肿瘤细胞中白细胞的残留数量，其中Ficoll体积百分比为20％，白细胞残留量最低。
此外，顶部缓冲液采用含1.0％FBS的PBS溶液、样本缓冲液采用含体积百分比为10％的Ficoll、体积百分比为90％的2％FBS的PBS和底部缓冲液采用Ficoll缓冲液，或者顶部缓冲液采用含5.0％FBS的PBS溶液、样本缓冲液采用含体积百分比为40％的Ficoll、体积百分比为60％的10％ FBS的PBS和底部缓冲液采用Ficoll缓冲液，均可捕获肿瘤细胞，增加肿瘤细胞回收率，并有效降低富集肿瘤细胞中白细胞的残留数量(数据未示出)。
1.3层流试剂组合用于LiquidBiopsy系统捕获高活力细胞
1.3.1样本制备
(1)胰酶消化收集MDA-MB-231-GFP细胞，用含有10％FBS的PBS清洗细胞，计数，取2.8×105个细胞加入100μL含有10％FBS的PBS溶液中混匀，加入18μL的捕获抗体V4-4抗体混合物，置于4℃旋转孵育1小时，转速15rpm。重复4次。
(2)取2.8×105个细胞加入100μL含有10％FBS的PBS溶液中混匀，作为对照组，置于4℃备用。
1.3.2层流试剂组合准备及脱气
将顶部缓冲液(含2％FBS的PBS)、底部缓冲液(Ficoll缓冲液)、样本缓冲液(含体积百分比为20％的Ficoll、体积百分比为80％的5％FBS的PBS)与清洗液(含5％FBS的PBS)分别制备好，备好后脱气60min。
1.3.3磁珠孵育
将孵育好捕获抗体的样本500g离心3分钟，弃上清，用100μL样本缓冲液重悬细胞。加入20μL磁珠，4℃旋转孵育30min，速度15rpm。将磁珠免疫标记过的样本500g离心3min，弃上清，对应样本缓冲液1mL重悬细胞。
1.3.4上机检测
(1)按照生产厂家说明书，对LiquidBiopsy机器进行预处理。
(2)将芯片放入脱气完成的40mL含2％FBS的PBS，100g离心1分钟后将芯片安装在芯片支架上。将样本管、样本缓冲液管、清洗液管依次放入LiquidBiopsy机器中，开始细胞分离。
(3)将芯片架取出机器，用灭菌纸吸去芯片表面多余液体，将芯片放入在连接有1.5EP管的细胞回收管中，500g离心3min，收集芯片中的细胞。
(4)将离心得到的细胞沉淀和未进行富集过程的对照组细胞分别用500μL的1×Assay Buffer重悬，加入1μL的Calcein-AM原液，充分混合，37℃避光孵育20-25min。取3μLPI原液加入上述染色细胞中，室温避光染色5min后，500g离心3min，离心去除染色液。用1×的PBS重悬细胞，取10μL滴在洁净的载玻片上，用干净的盖玻片压片后，荧光镜检，分别统计活细胞和死细胞的数量。
1.3.5实验结果
由图4的荧光图像可见，实验组分离得到的肿瘤细胞中活细胞占多数，对其中的荧光进行定量分析，结果由图5可见，凋亡细胞只占全部细胞中的10％，与不富集的对照组相比，仅相差5％，这说明本公开的层流试剂组合与LiquidBiopsy系统结合可以捕获高活力细胞，分离富集的肿瘤细胞保持在90％的细胞活性，富集过程对细胞的损伤较小。
1.4BSA缓冲液增加细胞回收率
1.4.1样本制备
(1)取8mL新鲜全血，加入新鲜配置的40mL 1×红细胞裂解液，速度25rpm下室温旋转7min；500g离心5分钟，吸去上清，用20mL PBS重悬，500g离心5min，重复两次，将沉淀用5mL含有10％FBS的PBS重悬，得到白细胞悬液，备用；
(2)胰酶消化收集MDA-MB-231-GFP细胞，用含有10％FBS的PBS清洗细胞，计数，取1000个细胞加入2×107个白细胞悬液中混匀，加入18μL的捕获V4-4抗体混合物，置于4℃旋转孵育1小时，转速15rpm。
1.4.2层流试剂组合准备及脱气
将顶部缓冲液(含2％FBS的PBS)、底部缓冲液(Ficoll缓冲液)、样本缓冲液与清洗液分别制备好，样本缓冲液及清洗液的不同配比如表2所示，备好后脱气60min。
表2不同配比的样本缓冲液及清洗液
1.4.3磁珠孵育
将孵育好捕获抗体的样本500g离心3分钟，弃上清，用1mL样本缓冲液重悬细胞。加入20μL磁珠，4℃旋转孵育30min，速度15rpm。将磁珠免疫标记过的样本500g离心3min，弃上清，对应样本缓冲液重悬细胞。
1.4.4上机检测
(1)按照生产厂家说明书，对LiquidBiopsy机器进行预处理。
(2)将芯片放入脱气完成的40mL含2％FBS的PBS，100g离心1分钟后将芯片安装在芯片支架上。将样本管、样本缓冲液管、清洗液管依次放入LiquidBiopsy机器中开始细胞分离。
(3)将芯片架取出机器，用灭菌纸吸去芯片表面多余液体，将芯片放置在显微镜载物架上静置30分钟。选择芯片自动扫描程序扫描、成像细胞。扫描结束后分别统计肿瘤细胞数及白细胞数量。
1.4.5实验结果
由图6可见，将样本缓冲液和清洗液中含5％的FBS的PBS替换为含0.5％BSA的PBS可以提高富集肿瘤细胞的回收率，同时又不会增加肿瘤细胞中白细胞的残留量。
此外，顶部缓冲液采用含0.1％BSA的PBS溶液、样本缓冲液采用含体积百分比为10％的Ficoll、体积百分比为90％的0.2％BSA的PBS和底部缓冲液采用Ficoll缓冲液，或者顶部缓冲液采用含0.5％BSA的PBS溶液、样本缓冲液采用含体积百分比为40％的Ficoll、体积百分比为60％的1.0％BSA的PBS和底部缓冲液采用Ficoll缓冲液，均可捕获肿瘤细胞，增加肿瘤细胞回收率，并有效降低富集肿瘤细胞中白细胞的残留数量(数据未示出)。
1.5EDTA缓冲液降低白细胞残留
本实验的目的是为了研究含有EDTA的清洗液对白细胞残留的影响。
1.5.1样本制备
(1)取8mL新鲜全血，加入新鲜配置的40mL 1×红细胞裂解液，速度25rpm下室温旋转7min；500g离心5分钟，吸去上清，用20mL PBS重悬，500g离心5min，重复两次，将沉淀用1mL含有0.5％BSA的PBS重悬，备用；
(2)胰酶消化收集MDA-MB-231-GFP细胞，用含有0.5％BSA的PBS清洗细胞，计数，取1000个细胞加入2×107个白细胞悬液中混匀，加入18μL的捕获抗体V4-4抗体混合物，置于4℃旋转孵育1小时，转速15rpm。
1.5.2层流试剂组合准备及脱气
将顶部缓冲液(含0.2％ BSA的PBS)、底部缓冲液(Ficoll缓冲液)、样本缓冲液与清洗液分别制备好，样本缓冲液及清洗液的不同配比如表3所示，备好后脱气60min。
表3不同配比的样本缓冲液及清洗液
1.5.3磁珠孵育
将孵育好捕获抗体的样本500g离心3分钟，弃上清，用1mL样本缓冲液重悬细胞。加入20μL磁珠，4℃旋转孵育30min，速度15rpm。将磁珠免疫标记过的样本500g离心3min，弃上清，对应样本缓冲液重悬细胞。
1.5.4上机检测
(1)按照生产厂家说明书，对LiquidBiopsy机器进行预处理。
(2)将芯片放入脱气完成的40mL含0.5％ BSA的PBS，100g离心1min，将芯片安装在芯片支架上。将样本管、样本缓冲液管、清洗液管依次放入LiquidBiopsy机器中，开始细胞分离。
(3)将芯片架取出机器，用灭菌纸吸去芯片表面多余液体，盖上芯片封口膜，将芯片放置在显微镜载物架上静置30分钟。选择芯片自动扫描程序扫描、成像细胞。扫描结束后分别统计肿瘤细胞数及白细胞数量。
1.5.5实验结果
由图7可见，清洗液中包含1mM EDTA可降低LiquidBiopsy分离富集肿瘤细胞时白细胞残留数量，同时不影响肿瘤细胞的富集效果。
1.6芯片隔膜消除细菌污染
为了保持富集环境的无菌条件，通过在芯片上放置隔膜来尽量消除细胞污染。将硅油纸裁剪成芯片大小，打出对应的孔。置于121℃高温湿热灭菌15min，如图8所示分别在芯片上下放置芯片隔膜。依上述实验过程分离肿瘤细胞后，对细胞进行培养，验证污染情况，实验结果如表4所示，增加芯片隔膜可显著降低细菌或真菌污染。
表4有无芯片隔膜时培养物污染情况
| 无芯片隔膜 | 芯片隔膜 | |
| 培养物污染情况 | 5(8) | 0(20) |
实施例2分离富集的肿瘤细胞再培养验证
1样本制备
(1)取8mL新鲜全血，加入新鲜配置的40mL 1×红细胞裂解液，速度25rpm下室温旋转7min；500g离心5分钟，吸去上清，用20mL PBS重悬，500g离心5min，重复两次，将沉淀用1mL含有0.5％BSA的PBS重悬，备用。
(2)胰酶消化收集MDA-MB-231-GFP细胞，用含有0.5％BSA的PBS清洗细胞，计数，取1000个细胞加入2×107个白细胞悬液中混匀，加入18μL的捕获抗体V4-4抗体混合物，置于4℃旋转孵育1小时，转速15rpm。
2层流试剂组合准备及脱气
将顶部缓冲液(含0.2％ BSA的PBS)、底部缓冲液(Ficoll缓冲液)、样本缓冲液(含体积百分比为20％的Ficoll、体积百分比为80％的0.5％BSA的PBS)与清洗液(含0.5％BSA、1mM EDTA的PBS)分别制备好，设置4个芯片对照，备好后脱气60min。
3磁珠孵育
将孵育好捕获抗体的样本500g离心3分钟，弃上清，用1mL样本缓冲液重悬细胞。加入20μL磁珠，4℃旋转孵育30min，速度15rpm。将磁珠免疫标记过的样本500g离心3min，弃上清，对应样本缓冲液重悬细胞。
4上机检测
(1)按照生产厂家说明书，对LiquidBiopsy机器进行预处理。
(2)将芯片放入脱气完成的40mL含0.5％ BSA的PBS，100g离心1min，将芯片安装在芯片支架上。将样本管、样本缓冲液管、清洗液管依次放入LiquidBiopsy机器中开始细胞分离。
(3)将芯片架取出机器，用灭菌纸吸去芯片表面多余液体，盖上芯片封口膜，将芯片放置在连接有1.5EP管的细胞回收管中，500g离心3min，收集芯片中的细胞。
(4)弃去细胞上清液，用1mL细胞培养基清洗细胞，500g离心3min。弃去细胞上清液，用培养基重悬细胞，铺于细胞培养孔板，置于37℃5％ CO2培养箱。细胞正常培养1天和5天后，在荧光显微镜下观察。
5实验结果
由图9可见，收集细胞正常培养5天后可见细胞增殖生长。
实施例3红细胞裂解条件的探究
当循环肿瘤细胞提取样本为全血时，需要去除样本中的红细胞，目前去除红细胞的一种方法为使用红细胞裂解液裂解红细胞。但是该方法存在的不足是裂解液处理时对血液中的肿瘤细胞也有损伤，所以发明人对红细胞裂解条件进行筛选，以减少肿瘤细胞的损伤。
1.1体积比及裂解时间条件探究
(1)体积比条件探究
每组取含5×104个LoVo细胞(购自中国科学院细胞库，货号SCSP-514)的100μL细胞悬液，根据表5-1分别加入不同体积的1×红细胞裂解液，并模拟裂解5min。得到的溶液在600g的条件下离心3min，去除上清。用含2％FBS的PBS缓冲液清洗细胞沉淀两次，再用400μL含2％FBS的PBS缓冲液重悬细胞，之后用Calcein-AM/PI Double Stain Kit荧光染料进行死活细胞染色。制片，置于荧光显微镜下观察拍照，使用显微镜自带软件统计红色标记细胞(凋亡细胞)和绿色标记细胞(活细胞)。
表5-1不同裂解液体积实验组设计
| 样本编号 | 样本体积 | 裂解液体积 | 裂解时间 |
| V0 | 100μL | —— | 5min |
| V3 | 100μL | 300μL | 5min |
| V5 | 100μL | 500μL | 5min |
| V7 | 100μL | 700μL | 5min |
| V9 | 100μL | 900μL | 5min |
实验结果：
由图10(a)可见，随着裂解液体积的增加，样本中细胞凋亡比例基本无变化，因此，裂解液体积比的增加不影响凋亡细胞的比例。
(2)裂解时间条件探究
每组取含5×104个LoVo细胞的100μL细胞悬液，根据表5-2分别加入500μL的1×红细胞裂解液，并模拟裂解对应时间。得到的溶液在600g的条件下离心3min，去除上清。用含2％FBS的PBS缓冲液清洗细胞沉淀两次，再用400μL含2％FBS的PBS缓冲液重悬细胞，之后用Calcein-AM/PI Double Stain Kit荧光染料进行死活细胞染色。制片，置于荧光显微镜下观察拍照，使用显微镜自带软件统计红色标记细胞(凋亡细胞)和绿色标记细胞(活细胞)。
表5-2不同裂解时间实验组设计
| 样本编号 | 样本体积 | 裂解液体积 | 裂解时间 |
| T1 | 100μL | —— | 0min |
| T2 | 100μL | 500μL | 5min |
| T3 | 100μL | 500μL | 10min |
| T4 | 100μL | 500μL | 15min |
实验结果：
由图10(b)可见，随着裂解时间增加，凋亡细胞比例逐渐增加，当裂解时间为15min时，凋亡细胞百分比最高，达到15％。为了探究何种活性因子能有效降低凋亡细胞百分比，故选择15min作为本实施例的裂解时间。
1.2活性因子的选择
为了探究何种活性因子能有效降低凋亡细胞百分比，选择Y-27632、GSH、SB202190、NCLA及其组合物作为筛选的因子，从中筛选合适的活性因子。
每组取含5×104个LoVo细胞的100μL细胞悬液，加入500μL的1×红细胞裂解液，根据表6的反应条件分别加入对应的因子，室温裂解15分钟。得到的溶液在600g的条件下离心3min，去除上清。用含2％FBS的PBS缓冲液清洗细胞沉淀两次，再用400μL含2％FBS的PBS缓冲液重悬细胞，之后用Calcein-AM/PI Double Stain Kit荧光染料进行死活细胞染色。制片，置于荧光显微镜下观察拍照，使用显微镜自带软件统计红色标记细胞(凋亡细胞)和绿色标记细胞(活细胞)。
由图11可见，在裂解15min且不单独添加任何因子的T2阳性组中，肿瘤细胞凋亡比例最高。实验组中，Y-27632组T3、GSH组T6、以及Y-27632和GSH组合组T9中凋亡细胞比例相比T2阳性组显著降低，其中T9组合的抗凋亡效果最明显，且与阴性对照组T1相比无显著差异，可以作为活性因子保护肿瘤细胞活性。而SB202190组T4中凋亡细胞比例较高，与阳性组T2相当，故对于肿瘤细胞活性无保护作用。
表6不同活性因子的实验组设计
实施例4样本肿瘤细胞捕获和3D培养
样本肿瘤细胞的捕获和培养流程见图12。
1试剂准备
缓冲液配制灭菌：10×红细胞裂解液、ddH2O、1×PBS、含0.5％BSA的PBS、顶部缓冲液(含0.2％BSA的PBS)过滤灭菌后备用；
耗材灭菌：上样漏斗、胶圈、回收管、EP管(1.5ml,0.5ml)、芯片隔膜高压蒸汽灭菌后备用；芯片75％酒精浸泡30分钟，无菌水漂洗(芯片无菌40ml离心管中100g离心3min)，备用。
2红细胞裂解
配置红细胞裂解液。10X红细胞裂解液用无菌水稀释至1×，并加入Y-27632(10μM)、谷胱甘肽5mM。将8ml血液(或待裂解胸水样本)转移到50mL离心管中，加入40mL上述配制好的1×红细胞裂解液，室温静置裂解8min。500g离心5min，去除上清，用30mLPBS重悬细胞。500g离心5min，去除上清，重复漂洗细胞2次，用1mL含0.5％BSA的PBS溶液重悬细胞。
3试剂脱气
将顶部缓冲液(含0.2％BSA的PBS)，底部缓冲液(Ficoll缓冲液)，样本缓冲液，脱气60分钟。
4孵育一抗
在上述1mL细胞悬液中加入捕获抗体混合物18μl，4℃旋转孵育1小时，速度15rpm。
5磁珠孵育
将孵育好捕获抗体的样本500g离心3min，弃上清，用1mL样本缓冲液重悬细胞。加入20μL磁珠，4℃旋转孵育30分钟，速度15rpm。将磁珠免疫标记过的样本500g离心3min，弃上清，对应样本缓冲液重悬细胞。
6上机前准备
样本磁珠孵育时，按照生产厂家说明书，对LiquidBiopsy机器进行预处理。
7上机分离富集肿瘤细胞
将芯片放入脱气完成的含0.5％BSA的PBS的40mL溶液中，100g离心1min，加速9减速9。将芯片安装在芯片支架上。将样本管、样本缓冲液管、清洗液管依次放入LiquidBiopsy机器中，开始分离。
8下机回收细胞
将芯片架取出机器，用灭菌纸吸去芯片表面多余液体，盖上芯片封口膜，将芯片放置在连接有1.5EP管的细胞回收管中，500g离心3分钟，收集芯片中的细胞。
9肿瘤细胞培养
弃去细胞上清液，用1mL细胞培养基清洗细胞，500g离心3min。将回收的细胞用3D培养基重悬，加入96孔板中(50μL没孔)，放置于37℃培养箱中30min。待Matrigel成胶后，再加入50μL不含Matrigel的3D培养基。置于二氧化碳培养箱中培养细胞。每3天更换液体培养基。在连续培养第14天和第28天时在奥林巴斯(CKX53)10X物镜下进行观察、拍照。
结果如图13所示，捕获的肿瘤细胞在3D培养下，细胞不断增殖，从单个细胞逐渐形成致密的细胞团。残留的白细胞逐渐凋亡。
后续实施例中培养所采用的培养基组分如表7所示：
表7 3D培养基组分
实施例5肿瘤病人外周血循环肿瘤细胞的富集及培养(3D培养)
1.外周血样本肿瘤细胞的富集
通过上述LiquidBiopsy捕获肿瘤细胞的步骤捕获小细胞肺癌病人外周血样本和乳腺癌病人外周血样本中的肿瘤细胞。
2.肿瘤病人外周血样本中肿瘤细胞的培养
将小细胞肺癌和乳腺癌病人外周血样本中分离富集的肿瘤细胞用上述培养基重悬，加入96孔板中(50μL每孔)，放置于37℃培养箱中孵育30min。待Matrigel成胶后，再加入50μL不含Matrigel的3D培养基。置于二氧化碳细胞培养箱中培养细胞。每3天更换液体培养基。在连续培养第1天、第14天和第28天时在奥林巴斯(CKX53)10X物镜下进行观察、拍照。
结果如图14和15所示，捕获的肿瘤细胞在3D培养下，细胞不断增殖，从单个细胞逐渐形成致密的细胞团。
对比例1健康人外周血循环肿瘤细胞的富集及培养(3D培养，阴性对照)
1.外周血样本肿瘤细胞的富集
通过上述LiquidBiopsy捕获肿瘤细胞的步骤捕获健康个体外周血中的细胞。
2.健康人外周血样本中肿瘤细胞的培养
将健康人外周血样本富集到的细胞用上述培养基重悬，加入96孔板中(50μL/孔)，放置于37℃培养箱中孵育30min。待Matrigel成胶后，再加入50μL不含Matrigel的3D培养基。置于二氧化碳细胞培养箱中培养细胞。每3天更换液体培养基。在连续培养第14天和第28天时在奥林巴斯(CKX53)10X物镜下进行观察、拍照。
结果如图16所示，捕获的细胞在3D培养下，未见增殖的细胞，且细胞逐渐凋亡，即健康人外周血中未见肿瘤细胞。虽然健康个体中不存在循环肿瘤细胞，但是富集过程部分血液细胞的残留在所难免，在后续3D培养基的培养过程中，这些细胞的增殖生长被抑制，这也侧面说明本申请公开的循环肿瘤细胞分离和培养方法能区分肿瘤患者和健康人样本。
以上所述实施例仅表达了本公开的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本公开构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本公开的保护范围。因此，本公开专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (113)
1.一种基于鞘流装置的分离循环肿瘤细胞用的试剂组合，其包括顶部缓冲液、样本缓冲液和底部缓冲液，其中：
所述顶部缓冲液为含1.0%-5.0%FBS的PBS溶液；所述样本缓冲液为含体积百分比为10%-40%的Ficoll、体积百分比为60%-90%的2%-10%FBS的PBS溶液；所述底部缓冲液为Ficoll原液；或
所述顶部缓冲液为含0.1%-0.5%BSA的PBS溶液；所述样本缓冲液为含体积百分比为10%-40%的Ficoll、体积百分比为60%-90%的0.2%-1.0%BSA的PBS溶液；所述底部缓冲液为Ficoll原液。
2.根据权利要求1所述的试剂组合，其中，所述顶部缓冲液中含0.2%BSA的PBS溶液或2%FBS的PBS溶液。
3.根据权利要求1所述的试剂组合，其中，所述样本缓冲液为含体积百分比为20%的Ficoll、体积百分比为80%的5%FBS的PBS溶液。
4.根据权利要求1所述的试剂组合，其中，所述样本缓冲液为含体积百分比为20%的Ficoll、体积百分比为80%的0.5%BSA的PBS溶液。
5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂组合，其中，所述试剂组合还包含清洗液和/或捕获抗体，所述清洗液中含0.2%-1.0%的BSA。
6.根据权利要求5所述的试剂组合，其中，所述清洗液中含0.5%的BSA。
7.根据权利要求1-4任一项所述的试剂组合，其中，所述试剂组合还包含清洗液和/或捕获抗体，所述清洗液中还含有摩尔质量浓度为0.2-2mM的EDTA。
8.根据权利要求5所述的试剂组合，其中，所述清洗液中还含有摩尔质量浓度为0.2-2mM的EDTA。
9.根据权利要求6所述的试剂组合，其中，所述清洗液中还含有摩尔质量浓度为0.2-2mM的EDTA。
10.根据权利要求7所述的试剂组合，其中，所述清洗液中EDTA的摩尔质量浓度为1mM。
11.根据权利要求8所述的试剂组合，其中，所述清洗液中EDTA的摩尔质量浓度为1mM。
12.根据权利要求9所述的试剂组合，其中，所述清洗液中EDTA的摩尔质量浓度为1mM。
13.一种分离循环肿瘤细胞用的试剂盒，其包含权利要求1-12任一项所述的试剂组合。
14.一种基于权利要求1-12任一项所述的试剂组合或权利要求13所述的试剂盒分离和培养循环肿瘤细胞的方法，其中，包括以下步骤：
（1）从受试者获得待测样本，用红细胞裂解液对待测样本进行前处理；
（2）利用细胞的物理性质或表面蛋白直接或间接富集循环肿瘤细胞，收集分离后的细胞；
（3）对步骤（2）分离到的细胞进行体外培养。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述步骤（1）中红细胞裂解液和待测样本的体积比为3-6:1。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述步骤（1）中红细胞裂解液和待测样本的体积比为5:1。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述步骤（1）中细胞裂解的时间为8-15min。
18.根据权利要求14-16任一项所述的方法，其中，所述待测样本选自患有癌症个体的血液、胸腔积液、腹腔积液、唾液、尿液、脑脊液或心包积液中的一种或多种。
19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述待测样本选自患有癌症个体的血液、胸腔积液、腹腔积液、唾液、尿液、脑脊液或心包积液中的一种或多种。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述癌症选自脑星形胶质母细胞瘤、咽头癌、肾上腺肿瘤、腺泡状软组织肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、肾嫌色细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜细胞瘤、尤文肿瘤、骨外黏液样软骨肉瘤、骨纤维发育不全、骨纤维性发育不良、胆囊或胆管癌、胃癌、妊娠滋养细胞病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤性肿瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺瘤、小儿癌症、外周神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、肾转移性癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌或子宫癌中的一种或多种。
21.根据权利要求19所述的方法，其中，所述癌症选自脑星形胶质母细胞瘤、咽头癌、肾上腺肿瘤、腺泡状软组织肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、肾嫌色细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜细胞瘤、尤文肿瘤、骨外黏液样软骨肉瘤、骨纤维发育不全、骨纤维性发育不良、胆囊或胆管癌、胃癌、妊娠滋养细胞病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤性肿瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺瘤、小儿癌症、外周神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、肾转移性癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌或子宫癌中的一种或多种。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述癌症选自卵巢癌、肝癌、肺癌、乳腺癌中的一种或多种。
23.根据权利要求14-16任一项所述的方法，其中，所述肿瘤细胞为人肿瘤细胞。
24.根据权利要求17所述的方法，其中，所述肿瘤细胞为人肿瘤细胞。
25.根据权利要求18所述的方法，其中，所述肿瘤细胞为人肿瘤细胞。
26.根据权利要求19所述的方法，其中，所述肿瘤细胞为人肿瘤细胞。
27.根据权利要求20所述的方法，其中，所述肿瘤细胞为人肿瘤细胞。
28.根据权利要求21所述的方法，其中，所述肿瘤细胞为人肿瘤细胞。
29.根据权利要求22所述的方法，其中，所述肿瘤细胞为人肿瘤细胞。
30.根据权利要求14-16任一项所述的方法，其中，所述红细胞裂解液包括Rock抑制剂和抗氧化物。
31.根据权利要求17所述的方法，其中，所述红细胞裂解液包括Rock抑制剂和抗氧化物。
32.根据权利要求18所述的方法，其中，所述红细胞裂解液包括Rock抑制剂和抗氧化物。
33.根据权利要求19所述的方法，其中，所述红细胞裂解液包括Rock抑制剂和抗氧化物。
34.根据权利要求20所述的方法，其中，所述红细胞裂解液包括Rock抑制剂和抗氧化物。
35.根据权利要求21所述的方法，其中，所述红细胞裂解液包括Rock抑制剂和抗氧化物。
36.根据权利要求22所述的方法，其中，所述红细胞裂解液包括Rock抑制剂和抗氧化物。
37.根据权利要求23所述的方法，其中，所述红细胞裂解液包括Rock抑制剂和抗氧化物。
38.根据权利要求24所述的方法，其中，所述红细胞裂解液包括Rock抑制剂和抗氧化物。
39.根据权利要求25所述的方法，其中，所述红细胞裂解液包括Rock抑制剂和抗氧化物。
40.根据权利要求26所述的方法，其中，所述红细胞裂解液包括Rock抑制剂和抗氧化物。
41.根据权利要求27所述的方法，其中，所述红细胞裂解液包括Rock抑制剂和抗氧化物。
42.根据权利要求28所述的方法，其中，所述红细胞裂解液包括Rock抑制剂和抗氧化物。
43.根据权利要求29所述的方法，其中，所述红细胞裂解液包括Rock抑制剂和抗氧化物。
44.根据权利要求30所述的方法，其中，所述Rock抑制剂为Y-27632，所述抗氧化物选自还原性谷胱甘肽、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、硒、铜或茶多酚。
45.根据权利要求31所述的方法，其中，所述Rock抑制剂为Y-27632，所述抗氧化物选自还原性谷胱甘肽、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、硒、铜或茶多酚。
46.根据权利要求32所述的方法，其中，所述Rock抑制剂为Y-27632，所述抗氧化物选自还原性谷胱甘肽、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、硒、铜或茶多酚。
47.根据权利要求33所述的方法，其中，所述Rock抑制剂为Y-27632，所述抗氧化物选自还原性谷胱甘肽、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、硒、铜或茶多酚。
48.根据权利要求34所述的方法，其中，所述Rock抑制剂为Y-27632，所述抗氧化物选自还原性谷胱甘肽、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、硒、铜或茶多酚。
49.根据权利要求35所述的方法，其中，所述Rock抑制剂为Y-27632，所述抗氧化物选自还原性谷胱甘肽、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、硒、铜或茶多酚。
50.根据权利要求36所述的方法，其中，所述Rock抑制剂为Y-27632，所述抗氧化物选自还原性谷胱甘肽、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、硒、铜或茶多酚。
51.根据权利要求37所述的方法，其中，所述Rock抑制剂为Y-27632，所述抗氧化物选自还原性谷胱甘肽、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、硒、铜或茶多酚。
52.根据权利要求38所述的方法，其中，所述Rock抑制剂为Y-27632，所述抗氧化物选自还原性谷胱甘肽、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、硒、铜或茶多酚。
53.根据权利要求39所述的方法，其中，所述Rock抑制剂为Y-27632，所述抗氧化物选自还原性谷胱甘肽、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、硒、铜或茶多酚。
54.根据权利要求40所述的方法，其中，所述Rock抑制剂为Y-27632，所述抗氧化物选自还原性谷胱甘肽、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、硒、铜或茶多酚。
55.根据权利要求41所述的方法，其中，所述Rock抑制剂为Y-27632，所述抗氧化物选自还原性谷胱甘肽、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、硒、铜或茶多酚。
56.根据权利要求42所述的方法，其中，所述Rock抑制剂为Y-27632，所述抗氧化物选自还原性谷胱甘肽、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、硒、铜或茶多酚。
57.根据权利要求43所述的方法，其中，所述Rock抑制剂为Y-27632，所述抗氧化物选自还原性谷胱甘肽、维生素C、维生素E、类胡萝卜素、硒、铜或茶多酚。
58.根据权利要求44所述的方法，其中，所述抗氧化物为还原型谷胱甘肽。
59.根据权利要求45所述的方法，其中，所述抗氧化物为还原性谷胱甘肽。
60.根据权利要求46所述的方法，其中，所述抗氧化物为还原性谷胱甘肽。
61.根据权利要求47所述的方法，其中，所述抗氧化物为还原性谷胱甘肽。
62.根据权利要求48所述的方法，其中，所述抗氧化物为还原性谷胱甘肽。
63.根据权利要求49所述的方法，其中，所述抗氧化物为还原性谷胱甘肽。
64.根据权利要求50所述的方法，其中，所述抗氧化物为还原性谷胱甘肽。
65.根据权利要求51所述的方法，其中，所述抗氧化物为还原性谷胱甘肽。
66.根据权利要求52所述的方法，其中，所述抗氧化物为还原性谷胱甘肽。
67.根据权利要求53所述的方法，其中，所述抗氧化物为还原性谷胱甘肽。
68.根据权利要求54所述的方法，其中，所述抗氧化物为还原性谷胱甘肽。
69.根据权利要求55所述的方法，其中，所述抗氧化物为还原性谷胱甘肽。
70.根据权利要求56所述的方法，其中，所述抗氧化物为还原性谷胱甘肽。
71.根据权利要求57所述的方法，其中，所述抗氧化物为还原性谷胱甘肽。
72.根据权利要求44所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为5-15 μM，还原型谷胱甘肽地浓度为1-10mM。
73.根据权利要求45所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为5-15 μM，还原型谷胱甘肽地浓度为1-10mM。
74.根据权利要求46所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为5-15 μM，还原型谷胱甘肽地浓度为1-10mM。
75.根据权利要求47所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为5-15 μM，还原型谷胱甘肽地浓度为1-10mM。
76.根据权利要求48所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为5-15 μM，还原型谷胱甘肽地浓度为1-10mM。
77.根据权利要求49所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为5-15 μM，还原型谷胱甘肽地浓度为1-10mM。
78.根据权利要求50所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为5-15 μM，还原型谷胱甘肽地浓度为1-10mM。
79.根据权利要求51所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为5-15 μM，还原型谷胱甘肽地浓度为1-10mM。
80.根据权利要求52所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为5-15 μM，还原型谷胱甘肽地浓度为1-10mM。
81.根据权利要求53所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为5-15 μM，还原型谷胱甘肽地浓度为1-10mM。
82.根据权利要求54所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为5-15 μM，还原型谷胱甘肽地浓度为1-10mM。
83.根据权利要求55所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为5-15 μM，还原型谷胱甘肽地浓度为1-10mM。
84.根据权利要求56所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为5-15 μM，还原型谷胱甘肽地浓度为1-10mM。
85.根据权利要求57所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为5-15 μM，还原型谷胱甘肽地浓度为1-10mM。
86.根据权利要求44所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为10 μM，还原型谷胱甘肽的浓度为5 mM。
87.根据权利要求45所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为10 μM，还原型谷胱甘肽的浓度为5 mM。
88.根据权利要求46所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为10 μM，还原型谷胱甘肽的浓度为5 mM。
89.根据权利要求47所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为10 μM，还原型谷胱甘肽的浓度为5 mM。
90.根据权利要求48所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为10 μM，还原型谷胱甘肽的浓度为5 mM。
91.根据权利要求49所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为10 μM，还原型谷胱甘肽的浓度为5 mM。
92.根据权利要求50所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为10 μM，还原型谷胱甘肽的浓度为5 mM。
93.根据权利要求51所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为10 μM，还原型谷胱甘肽的浓度为5 mM。
94.根据权利要求52所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为10 μM，还原型谷胱甘肽的浓度为5 mM。
95.根据权利要求53所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为10 μM，还原型谷胱甘肽的浓度为5 mM。
96.根据权利要求54所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为10 μM，还原型谷胱甘肽的浓度为5 mM。
97.根据权利要求55所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为10 μM，还原型谷胱甘肽的浓度为5 mM。
98.根据权利要求56所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为10 μM，还原型谷胱甘肽的浓度为5 mM。
99.根据权利要求57所述的方法，其中，所述Rock抑制剂Y-27632浓度为10 μM，还原型谷胱甘肽的浓度为5 mM。
100.根据权利要求14-16、30任一项所述的方法，其中，所述利用细胞表面蛋白直接或间接富集循环肿瘤细胞的方法为正向磁珠富集法、负向磁珠富集法或微流控芯片法。
101.根据权利要求100所述的方法，其中，所述方法包括：加入捕获抗体孵育后离心，用磁珠孵育待用，通过磁力分离装置吸引磁珠富集循环肿瘤细胞。
102.根据权利要求101所述的方法，其中，所述捕获抗体为生物素标记的捕获抗体，所述磁珠为亲和素标记的磁珠。
103.根据权利要求102所述的方法，其中，所述亲和素为链霉亲和素或中性亲和素。
104.根据权利要求103所述的方法，其中，所述亲和素为链霉亲和素。
105.根据权利要求101所述的方法，其中，所述磁力分离装置的芯片设有灭菌隔膜。
106.根据权利要求105所述的方法，其中，所述灭菌隔膜为经过灭菌或经过消毒的膜。
107.根据权利要求106所述的方法，其中，所述膜为塑料或纸张。
108.根据权利要求14-16、30任一项所述的方法，其中，所述捕获抗体包括正向捕获抗体和负向捕获抗体。
109.根据权利要求108所述的方法，其中，所述正向捕获抗体选自抗EpCAM抗体、抗HER2抗体、抗TROP2抗体、抗EGFR抗体、抗CEA抗体、抗MUC1抗体、抗ALK抗体、抗C-MET抗体、抗TAG-12抗体、抗IGF1R抗体、抗TACSTD2抗体、抗CD318抗体、抗CD104抗体、抗GP75抗体、抗GP100抗体、抗MelanA/MART1抗体、抗Trp2抗体、抗MAGE-A1抗体、抗MAGE-A4抗体、抗BAGE抗体、抗GAGE抗体、抗PSMA抗体、抗PSCA抗体、抗PCSA抗体、抗CD310抗体、抗CK18抗体、抗CK19抗体、抗CD34抗体、抗CD146抗体、抗CD62抗体、抗CD105抗体、抗CD106抗体、抗6B5抗体、抗N-钙粘着蛋白抗体中的一种或多种。
110.根据权利要求108所述的方法，其中，所述负向捕获抗体选自抗CD45抗体、抗CD14抗体、抗CD55抗体、抗CD66b抗体，抗CD19抗体，抗CD33抗体的一种或多种。
111.根据权利要求14-16、30任一项所述的方法，其中，所述捕获抗体为混合抗体。
112.根据权利要求111所述的方法，其中，所述混合抗体中抗EGFR抗体：抗TROP2抗体：抗HER2抗体：抗EpCAM抗体的质量比分别为2:1:1:1。
113.权利要求1-12任一项所述的试剂组合、权利要求13所述的试剂盒在制备筛选抗癌药物或确定抗癌药物有效性的试剂中的应用。
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