CN102260647A

CN102260647A - 乳腺癌干细胞分离纯化方法

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Publication number: CN102260647A
Application number: CN2010101831220A
Authority: CN
Inventors: 卢英
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-05-26
Filing date: 2010-05-26
Publication date: 2011-11-30

Abstract

本发明公开了一种应用免疫磁珠分选系统分离纯化乳腺癌干细胞的方法，其步骤包括：首先置备单细胞悬液，其次进行免疫磁珠阴性分选，分离去除乳腺癌细胞中的正常细胞，最后进行免疫磁珠阳性分选，纯化乳腺癌干细胞。本方法操作简便快速、无须昂贵的实验设备，分筛后的细胞存活率高，CD44++CD24-/+特异性高，在乳腺癌症干细胞研究中将有广阔的应用前景。

Description

乳腺癌干细胞分离纯化方法

技术领域

本发明涉及癌症干细胞的分离纯化方法，具体涉及一种采用免疫磁珠将乳腺癌干细胞从乳腺癌肿瘤组织中分离纯化的方法，属于生物医药领域。

背景技术

乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤。在其治疗过程中，复发是影响疗效的重要因素，而造成复发的原因，目前普遍认为是手术治疗中乳腺癌细胞的残留，化疗耐药和放疗、内分泌等治疗不敏感的乳腺癌细胞残存。

近年提出的癌干细胞(cancer stem cells，CSC)学说又为乳腺癌转移提供了新的理论依据。该学说认为在肿瘤组织中只有少部分细胞不断地增殖，而大部分肿瘤细胞处于不增殖或有限增殖的状态，只有CSC才是肿瘤产生和发展的主要因素。进一步研究认为，CSC是来自正常干细胞，也可能来自于分化了的后代细胞，CSC应当拥有自我更新能力和维持恶性生长的特性。最近的研究证实，在白血病、脑瘤、肺瘤和乳腺癌中只有极少一部分细胞具有发生肿瘤和维持肿瘤能力的CSC。最新白血病CSC研究显示，CSC比它们产生出来的快速生长后代细胞具有休眠性和更强的自我复制能力。因此，如能干预、阻止CSC的分化、增殖等病理生理过程，从而清除CSC，对提高恶性肿瘤的治疗效果和降低肿瘤的复发意义重大。

乳腺癌是由许多形态上和功能上相当不同的细胞组成，Michael Clarke实验室已经证明9个病人中有8个病人拥有ESA+CD44+CD24-lin-肿瘤干细胞，这些细胞可以在小鼠中产生肿瘤，而注射100倍的不表达同样抗原的其他乳腺癌细胞亚群并不能形成肿瘤，更为令人信服的是这些在小鼠上产生的肿瘤细胞可以在别的小鼠上继续传代产生肿瘤，这些肿瘤同他们的原发肿瘤一样，包含肿瘤干细胞和由他们产生的恶性乳腺癌细胞.这个研究从根本上证实了CSC在乳腺癌中存在并可发展成乳腺癌。2002年，Clarke等首次从乳腺癌组织中分离CSC，他们把乳腺癌乳房切除手术后的标本制成单细胞悬液，经流式细胞仪筛选出表达CD44、B38.1、ESA的细胞，扩增后注入NOD/SCID小鼠体内，小鼠长出了肿瘤，证明这部分细胞具有肿瘤源性；随后AL-Hajj等从乳腺癌患者体内分离出表达的细胞，这部分细胞具有正常干细胞的特征，能够无限增殖，并能分化成为多种组织类型的细胞，后者增殖能力有限，由此证实了乳腺癌干细胞存在的证据。

乳腺癌干细胞是一群CD44⁺、CD24^-的特异细胞群，经过研究表明乳腺癌干细胞大多存在于乳腺肿瘤组织及乳腺相关的癌细胞中。如何获取一定数量的乳腺癌干细胞进行检测是研究者面临的另一个技术瓶颈。乳腺癌干细胞在肿瘤组织中的比例只有约2-5％，不经过富集难以满足需要，因此CSC检测的临床应用主要存在以下问题：

首先，目前尚未发现乳腺癌CSC特异标志物，现在运用的检测标志尚存在某些缺陷，目前还难以在临床运用，寻找特异敏感的检测标志对于其临床应用至关重要；

其二，乳腺癌癌症干细胞的现有分离方法，非常复杂，需要昂贵的流式细胞仪和非常有经验的专业技术人员，且要经过动物实验验证后，才能确定，而且需耗时1-2年以上，约花费数十万元才能完成。

现有技术中，应用密度梯度离心法或流式细胞仪等方法富集肿瘤细胞均存在纯度不高、仪器设备昂贵、影响细胞活力等去缺陷，因此在实际工作中难以广泛应用。

免疫磁珠分选系统(Magnetic Cell Sorting，MACS)是一种新兴的细胞分离技术，被广泛用于细胞分离，蛋白质，核酸纯化等诸多领域，目前MACS已用于干细胞研究，免疫磁性分离法是基于细胞表面抗原以及某种蛋白与连有免疫磁珠的特异性单抗相结，在外加磁场的条件下，通过抗体与免疫磁珠相连的细胞和某种蛋白被吸附而滞留在磁场中，由于免疫磁珠表面的单抗只结合含有特异性抗原的细胞和蛋白，从而达到与其他种类的细胞和蛋白相分离的目的。应用免疫磁性分离技术分离细胞的方法有两种：直接从细胞混合液中分离出靶细胞的方法，称为阳性分离法；利用免疫磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以纯化的方法，称为阴性分离法。应用阴性分离法只能对肿瘤细胞进行3～4倍的富集，而阳性分离法对肿瘤细胞的富集率则高的多，可对肿瘤细胞进行10³～1.5×10⁴倍的富集。

目前尚未有如何分离特异的乳腺癌癌症干细胞的专有技术报道。本发明中，我们尝试利用免疫磁珠分选系统(MACS)快速分离出肿瘤组织中的癌症干细胞，并经流式细胞仪检测其准确率，以及经SCID鼠体内成瘤实验，验证分选的细胞为癌症干细胞，以从方法学上探讨纯化分离乳腺癌症干细胞，为进一步研究乳腺癌症干细胞建立标准，对乳腺癌恶性度诊断、复发转移的监控、指导术后辅助治疗等具有重大意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种操作简便、成本低、特异性强的乳腺癌干细胞分离纯化方法。

为实现上述目的，本发明提出用免疫磁珠分选系统(MACS)分离纯化乳腺肿瘤中的癌症干细胞的方法，包括以下三个步骤：

a.制备单细胞悬液；

b.免疫磁珠阴性分选，分离去除乳腺癌细胞中的正常细胞；

c.免疫磁珠阳性分选，纯化乳腺癌干细胞。

上述a步骤为：将肿瘤样品切成小块，移送到酶溶液中，37℃水浴培养30～40分钟，显微镜下检测，若成细胞团或单个细胞，即加血清终止消化，无血清培养液(SFM)清洗，离心除去上清，用MACS缓冲液重悬细胞，过45μm滤网得到悬浮单细胞，调整细胞密度至10⁷/ml。

上述b步骤为：将LINEAGE阳性抗体加入步骤a得到的细胞悬液，3～5℃孵育20～30分钟后，加入包被兔抗鼠的免疫磁珠，混匀，放置20分钟，用MACS缓冲液洗涤细胞两次，离心去除多余的免疫磁珠，再用MACS缓冲液重悬细胞；用MACS缓冲液预洗LD磁性分选柱，将细胞悬液过柱，收集通过分选柱的细胞液，收集到的洗液为去除癌症组织中正常细胞的肿瘤细胞。

上述LINEAGE阳性抗体包括CD2，CD3，CD10，CD16，CD18，CD24，CD31中的一种或几种。

上述加入LINEAGE阳性抗体的比例按每5μl抗体相对于2×10⁷个细胞/200μl细胞悬液。

上述c步骤为：将步骤b得到的细胞悬液离心，洗涤后重悬在MACS缓冲液中，将抗CD44抗体加入细胞悬液中，3～5℃孵育20～30分钟，用MACS缓冲液洗涤细胞，离心去除多余的抗体，用MACS缓冲液重悬细胞，加入包被兔抗鼠的免疫磁珠，4℃放置20分钟，加MACS缓冲液冲洗，离心去除游离的兔抗鼠免疫磁珠，弃除上清，再以MACS缓冲液重悬细胞；用MACS缓冲液预洗LD磁性分选柱，将细胞悬液过柱，用MACS缓冲液洗柱两次，去除非标记细胞，移柱出磁场，用MACS缓冲液洗柱，收集洗液，此为CD44阳性CD24阴性或弱阳性的乳腺癌肿瘤干细胞。

上述加入抗CD44抗体的比例按1.5μl抗体相对于2×10⁶/100μl细胞悬液。

上述免疫磁珠分离纯化乳腺癌干细胞成功的前提，是标记抗体与细胞表面标志物的作用浓度、作用温度以及作用时间，以保证获得最佳的筛选效果。出于有效性和保留细胞活性两点考虑，经过多次实验筛选，最终按以1.5μl的抗CD44抗体对应2×10⁶个肿瘤细胞/100UL的作用浓度，4℃作用时间30分钟为最佳筛选方式。

本发明具有以下特点：

(1)本发明首次将MACS阴性分选法和阳性分选法结合运用于乳腺癌肿瘤干细胞的纯化中，筛除LINEAGE+的抗体结合阳性的细胞，去除干扰，保留纯化后的阴性肿瘤细胞，为MACS用于肿瘤细胞的研究提供了新的领域。该磁珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺化微粒，载体微球与抗体结合不影响抗体原有生物学特性，并且由于抗体本身具有特异性强，敏感度高的特点，保证了分离纯化的功能和效果。

(2)本发明提供的方法替代了以往用流式细胞仪来进行分离，明显缩短了时间，降低了费用，而且流式细胞仪需要专业分选人士操作，纳米免疫磁珠的分选方法对操作人员的专业要求低。

(3)本方法操作简便快速、无须细胞流式仪等昂贵的实验设备，纯度较高，分筛后的细胞存活率高，CD44++CD24-/+特异性高，分离效果可得到细胞培养、流式细胞仪以及动物实验的确认。因此，本发明在乳腺癌症干细胞研究中将有广阔的应用前景，可用于开发针对乳腺癌症干细胞的单克隆抗体等。由该方法得到的启示，本发明不仅仅限于应用在乳腺癌治疗，还可以扩展到其他癌症干细胞的筛选，配合以抗癌药物的使用，对于癌症干细胞的特异诊断和生物靶向治疗的生物新药，具有重要意义。

具体实施方式

下述实例中使用的材料及来源

1.乳腺肿瘤组织来源：

病例均为病理诊断乳腺癌，接受乳腺癌根治手术。所有病例未接受术前放疗化疗等辅助治疗，术后病理判断肿瘤分期分型，腋窝淋巴结转移情况。术后肿瘤标本常规行免疫组化检测ER等乳腺癌相关受体表达情况。MACS和流式细胞仪分选标本均取自术中切除的乳腺癌病灶，无菌条件下切取肿瘤靠边缘的组织。

2.主要试剂及仪器：

流式细胞仪flow cytometer，FCM 美国FACSAnalysis

45微米孔径细胞筛网长沙博优生物公司

细胞计数板长沙博优生物公司

LINEAGE阳性抗体 INVITROGEN公司

CD44抗体 INVITROGEN公司

免疫磁珠分选系统(MACS) Militiney公司

包被兔抗鼠的免疫磁珠 Militiney公司

Matrigal凝胶 Biolegend公司

FITC结合抗小鼠IgM荧光二抗 Militiney公司

RPMI-1640无血清培养基：购自Hyclone公司，4℃保存，有效4周。

HBSS(Hank’s balanced salt solution)：含体积分数2％胎牛血清，10mmol/L HEPE，保存4周。

本实施例中，用免疫磁珠分离纯化癌症干细胞，包括如下步骤：

a.制备单细胞悬液：将得到的肿瘤样本，共计5例，术后病理检测，恶性度为II-III级。取术中切下的组织，切取未受血液污染的组织核心，置于盛有无血清细胞培养基的平皿中，用手术剪剪成中等大小的小块，后用刀片切成小块或尽可能小，操作应在无菌条件下并在冰上进行。然后用25ml的一次性移液管，移送到酶溶液中，拧紧管帽，将试管放在37℃水浴箱中，培育30～40分钟。然后，显微镜下检测，若成细胞团或单个细胞，为消化完成，加血清终止消化。SFM清洗，1000rpm离心5分钟去除上清，用MACS缓冲液重悬细胞，过45μm滤网，得到悬浮单细胞，去除死亡细胞，调整细胞密度至10⁷/ml。

b.MACS阴性分选分离，去除癌症细胞中的正常细胞：将包括抗CD2，CD3，CD10，CD16，CD18，CD24，CD31的LINIEASE阳性抗体，除2.5μl抗CD24抗体外，其他抗体按每5μl抗体相对于2×10⁷个细胞/200μl体积的比例，加入步骤a得到的细胞悬液中，4℃孵育20分钟，然后加入50μl包被兔抗鼠的免疫磁珠，混匀，放置20分钟，用500μl的MACS缓冲液，洗涤细胞两次，1000rpm离心5分钟，去除多余的抗体磁珠。500μl缓冲液重悬细胞；2ml缓冲液预洗LD磁性分选柱，将500μl细胞悬液过柱，收集通过分选柱的细胞液，此为MACS法磁珠去除癌症组织中正常细胞的肿瘤细胞。

c.MACS阳性分选分离纯化癌症干细胞：将b得到的细胞悬液，离心，洗涤一次，重悬在100μl的MACS缓冲液中，将抗CD44抗体，按1.5μl相对于2×10⁶/100微升体积的比例，加入细胞悬液中，4℃孵育30分钟，用500μl的MACS缓冲液洗涤细胞两次，离心去除多余的抗体，加入10μl包被兔抗鼠的免疫磁珠，4℃放置20分钟，500μl缓冲液重悬细胞；1000rpm离心5分钟，去除上清。2ml缓冲液预洗LD磁性分选柱，将500μl细胞悬液过柱，1ml缓冲液洗柱两次，去除非标记细胞；移柱出磁场，用MACS缓冲液洗柱，收集洗液，此为MACS法得到CD44阳性CD24阴性或弱阳性的乳腺癌肿瘤干细胞。

检测方法：

1、细胞分选后的流式细胞仪检测：

(1)将洗脱的分选出的CD44阳性CD24阴性或弱阳性的细胞用1∶100稀释的FITC结合抗小鼠IgM荧光二抗室温孵育1小时，PBS洗两遍，重悬在100μl的PBS缓冲液中，然后再加抗CD24-AEC的抗体孵育、冲洗，重悬在100微升的PBS中；

(2)将a步骤中分选前的细胞群离心，加CD44孵育30分钟，冲洗两次，再加1∶100稀释的FITC结合抗小鼠IgM荧光二抗室温孵育1小时，PBS洗两遍，重悬在100μl的PBS缓冲液中，然后再加抗CD24-AEC的抗体孵育，冲洗，重悬在100μl的PBS中。将(1)和(2)的细胞分别上流式细胞仪分析。

2、细胞活性检测：纯化前后分别取10μl细胞悬液与10μl 0.4％胎盘蓝溶液混合后，滴入细胞计数板置于显微镜下观察。不着色，发亮的为活细胞；着色，胞体膨大者为死细胞，计数细胞总数及活细胞百分比。

3、采用SPSS10.0软件对流式细胞仪分析结果进行两样本的t检验，分析纯化前后CD44阳性CD24阴性或弱阳性的乳腺癌肿瘤干细胞纯度及细胞活力的差别。

检测步骤1、2、3的检测结果为：

MACS纯化前细胞的存活率为(89.0+/-3)％，纯化后为(88.0+/-2.5)％，(p大于0.05)，无显著性差异。

纯化前CD44阳性CD24阴性的细胞为(10.0+/-1)％，纯化后为(92.0+/-2)％，(小于0.01)，差异显著。

4、动物模型的建立：取4-8周龄的NOD/SCID免疫缺陷小鼠，局部用碘酊消毒，经分选得到的CD24+/CD44-乳腺癌细胞和阴性对照细胞按照实验要求取一定数量溶于500μl无菌HBSS培养基中，同时加入等体积的Matrigal凝胶，维持体系的温度在4℃，用1毫升注射器分别注入小鼠右侧，左侧腋下脂肪组织，注射后Matrigal凝胶自然凝结，防止细胞从注射部位流出。再次给小鼠消毒，回笼饲养。每周观察两次，检查成瘤情况。

5.体内成瘤实验：将MACS和检测步骤1流式分选的癌症干细胞(1)，(2)各自稀释，取5000个细胞，溶于500μl培养基中，加入4℃，500μl马氏凝胶，共0.1ml(500个细胞)，注入SCID/NOD鼠右侧腋下。同时将10⁵个其他表型的肿瘤细胞与凝胶的混合物注入左侧腋下脂肪垫下，SPF条件下饲养，8-10周后，小鼠右侧腋下可触及较明显的新生物肿瘤，左侧腋下无肿物生成，说明乳腺癌中CD44+/CD24-细胞亚群与其他细胞相比，有更强大的成瘤能力，验证了分离出的细胞为癌症干细胞，同时说明MACS分选的乳腺癌症干细胞和流式分选的乳腺癌症干细胞相同。

Claims

1.一种乳腺癌干细胞分离纯化方法，其特征在于：所述分离纯化方法用免疫磁珠分选系统分离乳腺肿瘤中的癌症干细胞，包括以下三个步骤：

a.制备单细胞悬液；

b.免疫磁珠阴性分选，分离去除乳腺癌细胞中的正常细胞；

c.免疫磁珠阳性分选，纯化乳腺癌干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种乳腺癌干细胞分离纯化方法，其特征在于：a步骤为：将肿瘤样品切成小块，移送到酶溶液中，37℃水浴培养30～40分钟，显微镜下检测，若成细胞团或单个细胞，即加血清终止消化，无血清培养液清洗，离心除去上清，用MACS缓冲液重悬细胞，过45μm滤网得到悬浮单细胞，调整细胞密度至10⁷/ml。

3.根据权利要求1所述的一种乳腺癌干细胞分离纯化方法，其特征在于：b步骤为：将LINEAGE阳性抗体加入步骤a得到的细胞悬液，3～5℃孵育20～30分钟后，加入包被兔抗鼠的免疫磁珠，混匀，放置20分钟，用MACS缓冲液洗涤细胞两次，离心去除多余的免疫磁珠，再用MACS缓冲液重悬细胞；用MACS缓冲液预洗LD磁性分选柱，将细胞悬液过柱，收集通过分选柱的细胞液，收集到的洗液为去除癌症组织中正常细胞的肿瘤细胞。

4.根据权利要求3所述的一种乳腺癌干细胞分离纯化方法，其特征在于：所述LINEAGE阳性抗体包括CD2，CD3，CD10，CD16，CD18，CD24，CD31中的一种或几种。

5.根据权利要求4所述的一种乳腺癌干细胞分离纯化方法，其特征在于：加入LINEAGE阳性抗体的比例按每5μl抗体相对于2×10⁷个细胞/200μl细胞悬液。

6.根据权利要求1所述的一种乳腺癌干细胞分离纯化方法，其特征在于：c步骤为：将步骤b得到的细胞悬液离心，洗涤后重悬在MACS缓冲液中，将抗CD44抗体加入细胞悬液中，3～5℃孵育20～30分钟，用MACS缓冲液洗涤细胞，离心去除多余的抗体，用MACS缓冲液重悬细胞，加入包被兔抗鼠的免疫磁珠，4℃放置20分钟，加MACS缓冲液冲洗，离心去除游离的兔抗鼠免疫磁珠，弃除上清，再以MACS缓冲液重悬细胞；用MACS缓冲液预洗LD磁性分选柱，将细胞悬液过柱，用MACS缓冲液洗柱两次，去除非标记细胞，移柱出磁场，用MACS缓冲液洗柱，收集洗液，此为CD44阳性CD24阴性或弱阳性的乳腺癌肿瘤干细胞。

7.根据权利要求6所述的一种乳腺癌干细胞分离纯化方法，其特征在于：加入抗CD44抗体的比例按1.5μl抗体相对于2×10⁶/100μl细胞悬液。