CN106282117A - 肿瘤干细胞的富集和筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供肿瘤干细胞的富集和筛选方法，所述方法是将成球培养和免疫磁珠分离法联合用于肿瘤干细胞的富集和筛选，具体如下：将肿瘤细胞在无血清的成球培养基中进行连续成球培养，并采用QPCR法同步检测肿瘤干细胞标志物的相对表达水平，当其特异性标志物表达量处于相对最高时，辅以免疫磁珠阳性单选或双选筛选肿瘤干细胞。将两种筛选方法相结合，可显著改善肿瘤干细胞分选得率低，纯度低以及后续应用不便等实际问题。

Description

肿瘤干细胞的富集和筛选方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，具体地说，涉及肿瘤干细胞的富集和筛选方法。
背景技术
传统观念认为，肿瘤是由体细胞突变而成，每个肿瘤细胞都可以无限制地生长,肿瘤的发生、发展是全部肿瘤细胞共同增殖的结果。但这无法解释并非所有肿瘤细胞都能无限制生长的现象。肿瘤细胞生长、转移和复发的特点与干细胞的基本特性十分相似，因此，有学者提出肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)的理论。这一理论为人们重新认识肿瘤的起源和本质，以及临床肿瘤治疗提供了新的方向和视角。
近年的研究证实，在肿瘤组织中存在着少数具有干细胞性质的细胞群体，这些细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，被称为肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)；CSCs可能是导致恶性肿瘤复发和转移的根本原因。绝大部分的实体肿瘤被认为起源于肿瘤干细胞CSCs可能是导致肿瘤临床治疗原发性和获得性耐药的重要原因之一，因此，近年来对于肿瘤干细胞的研究吸引了国内外肿瘤基础科研的广泛关注。迄今为止，已经在脑肿瘤、肺腺癌、前列腺癌和结肠癌等多种肿瘤中发现了CSCs，进一步证实了CSCs理论。CSCs的生物学特性主要表现在以下方面：①具有自我更新能力，能够在体内外无限分裂增殖；②多向分化潜能，CSCs能够产生不同分化类型的子代细胞；③多处于细胞生长周期的G0期，长期保持休眠状态，因此常规化疗药物无法杀死数量极少且增殖不活跃的CSCs；④抗凋亡，CSCs高度表达抗凋亡基因Bcl-2；⑤具有端粒酶活性；⑥其生长发育受Wnt、Notch等信号通路转导调控；⑦耐药性，CSCs膜表面表达多种ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter)，可以利用ATP水解提供的能量把药物泵出细胞外，使细胞免受药物的伤害。由此可见，对肿瘤干细胞展开深入研究确实对于推进肿瘤防治有至关重要的意义。
虽然目前有越来越多的证据支持CSCs理论，但仍然存在着制约对其进行深入研究的问题。其中最凸显的就是CSCs的分离技术仍不完善。目前，用于分离肿瘤细胞群体中干细胞亚群的方法主要有如下三种：
1、侧群细胞分离法。侧群细胞(Side population cells)首次发现于1996年，Margaret A.Goodell使用荧光染料Hoechst 33342活染骨髓细胞后进行流式分析，得到一群游离于主群之外的双阴性的细胞群。后续实验证明这群细胞具有可外排细胞染料Hoechst 33342的特点，且具有干细胞的特性。肿瘤侧群细胞具有肿瘤干细胞的特性，尤其具备肿瘤的始发潜能，同时对化疗药物有较强的抵抗能力。因此采用侧群细胞外排Hoechst33342的特性，可以用来分离和富集肿瘤细胞群体中的肿瘤干细胞。
2、成球培养法。成球培养法的原理是肿瘤干细胞被发现在无血清但富含一定细胞因子的培养条件下，可以成团生长繁殖，形成如葡萄串样的克隆肿瘤球，而普通肿瘤细胞在这个过程中无法良好增殖的这一特点，在成球培养过程中使干细胞得到占绝对优势的增殖，从而起到筛选和富集的作用。
3、免疫磁珠分离法。免疫磁珠分离法的原理是基于抗原抗体间的特异性结合。不同类型的肿瘤干细胞往往具有特异高表达的表面标志物，而利用对应的标志物抗体包被的磁珠(免疫磁珠)可以在磁场作用下，从细胞群体中筛选吸附出这类表面标志物高表达的细胞群体，从而达到筛选某类肿瘤干细胞的目的，如CD133/CD24免疫磁珠双阳筛选用来富集肾癌干细胞，CD133+/CD49f+免疫磁珠双阳筛选用来富集宫颈癌干细胞，CD133+免疫磁珠单选用来富集前列腺癌肿瘤干细胞等。
目前，上述三种主流的用于肿瘤干细胞筛选的方法都有不容忽视的弱点，而这些弱点的存在使得对肿瘤干细胞的深入研究都一定程度地陷入了窘境。
针对侧群细胞分离法，侧群分离法的原理是基于侧群细胞能外排Hoechst 33342细胞染料，从而可以利用流式细胞仪将其分选出来。而利用这种方法的主要缺陷有两个：1、分选出来的是侧群细胞，研究证实侧群细胞确实具有例如超强增殖性和抗药性的特点，也有较高表达的干细胞表面标志物，但是，这仅仅说明侧群细胞中或有一定比例的干细胞，因此具有一定的干性特征，但不能认为侧群细胞就是肿瘤干细胞，两者仍然是两个概念，不能混为一谈，因此，这种筛选方法并不是严格的干细胞筛选法；2、细胞经过染料处理和流式细胞仪上机分选，已经受到了一定程度的破坏和污染，因此，收集到的为数不多的细胞无法再有效进行长时间的回归性细胞培养，因此导致后续实验无法有效实施，可执行性较差。
针对免疫磁珠分离法，免疫磁珠法的原理是利用CSCs表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗结合而进行分选。该方法对细胞损伤小，不会影响细胞的功能和活力，而且成本较低，是目前国内应用较为广泛的CSCs分离技术。但是因为肿瘤干细胞比例仅占肿瘤细胞中低于1％的比例，而且，分选过程中需要反复淘洗，一来损失比较大，得率很低，这样给后续实验带来操作难度，就算此时介入成球富集，也往往因为起始细胞量太少，而无法在无血清的成球培养条件下顺利成球；二来非特异性吸附无可避免，而由于后续实验需要恢复正常有血清培养条件，因此，非特异性吸附的细胞同时也在增殖，使得研究背景不纯。
针对成球培养法，成球培养法的原理是肿瘤干细胞被发现在无血清但富含一定细胞因子的培养条件下，可以成团生长繁殖，形成如葡萄串样的克隆肿瘤球，而普通肿瘤细胞在这方面能力次之，从而起到筛选和富集的作用。成球筛选因为只是通过生长趋势来富集成球能力强的细胞群体，所以首先纯度上存在欠缺；其次若想通过多代成球培养来获得肿瘤干细胞，很多前期研究都发现不同类型的肿瘤细胞在经过多代成球培养后，干性会在达到相对顶峰后有不同程度的降低，而即使干性相对顶峰，纯度依然不高。
综上所述，目前用于肿瘤干细胞分选的三种方法，对于肿瘤干细胞的后续深入研究，效果都不尽人意：首先，侧群分选存在概念不可等同；后续实验可执行性差的缺点；其次，免疫磁珠分选存在得率太低；富集后易造成群体纯度更低的缺点；最后，成球分选存在纯度低；多代成球可导致干性降低的缺点。
因此，想要深入研究肿瘤干细胞，必须从实际出发解决干细胞分选的难题，才有可能使癌干细胞的研究在更真实纯净的背景下得以开展，从而辅助肿瘤相关研究和治疗效果实现质的飞跃。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的复合式肿瘤干细胞筛选方法，以解决肿瘤干细胞难以有效分选和富集的问题。
为了实现本发明目的，本发明提供的肿瘤干细胞的富集和筛选方法，将成球培养和免疫磁珠分离法联合用于肿瘤干细胞的富集和筛选，具体方法如下：将肿瘤细胞在无血清的成球培养基中进行连续成球培养，并采用QPCR法同步检测肿瘤干细胞标志物的相对表达水平，当其特异性标志物表达量处于相对最高时，辅以免疫磁珠阳性单选或双选筛选肿瘤干细胞。
其中，成球培养包括以下步骤：
S11、培养肿瘤细胞至80～90％满瓶，消化收集细胞，单细胞悬液接种到6孔超低吸附细胞培养板中，接种密度为5×104-8×104个/孔，每孔加入2-2.5mL SFMD培养液，在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48h-96h，得到P1代成球细胞；
S12、于37℃、5％CO2细胞培养箱中，向培养液中加入0.05％的胰酶消化液消化细胞5-8min，待肿瘤球松散后，每孔加2-2.5mL SFMD培养液终止消化，吹打均匀，按5×104-8×104个/孔的细胞密度接种到新的6孔超低吸附细胞培养板中在37℃、5％CO2条件下进行P2代成球培养，培养48h-96h，得到P2代成球细胞；
S13、重复上述步骤S12，培养下一代成球细胞；
S14、对于得到的每一代肿瘤成球细胞，采用QPCR法检测肿瘤干细胞标志物的相对表达量，同时设置亲本肿瘤细胞为对照；
S15、根据肿瘤干细胞标志物的相对表达含量，确定干性最强的Pn代成球细胞，并将细胞成球扩大培养至Pn代成球细胞满足磁珠筛选的起始数目要求。
本发明中所述的肿瘤干细胞标志物为肿瘤干细胞通用标志物CD133、KLF4、ABCG2、OCT4、Nango、c-Myc等干性标志物。
其中，免疫磁珠分离法使用的免疫磁珠为表面分别包被有CD133、CD44或CD24等不同类型肿瘤干细胞标志物单克隆抗体的生物性免疫磁珠。本发明所用MicroBeads均为美天旎公司提供的预包被磁珠，商品编号分别为CD44：130-095-194，CD133：130-050-801；CD24：130-095-951。
免疫磁珠分离法中使用的缓冲液为试剂盒MiniMACS Strating Kit(美天旎公司，货号：130-042-312)自带。
所用分离柱、分离器和多道立架均购自美天旎公司，分别为MiniMACS Separator，货号：130-042-102；MACS MultiStand，货号：130-042-303；MS Columns，货号：130-042-201。
利用免疫磁珠阳性单选筛选肿瘤干细胞的方法如下：
S21、将成球细胞消化成约107个/mL单细胞悬液，1300-1350r/min离心5-6min，弃上清；
S22、向细胞沉淀中加适量预冷的缓冲液重悬细胞；1300-1350r/min离心5-6min，弃上清；向每108个细胞中加入300μL缓冲液重悬细胞，并向其中加入100μL FcR BlockingReagent，混匀，然后加入100μL被特定肿瘤干细胞标志物抗体预包被的MicroBeads；混匀，2～8℃孵育30min；然后向其中加入1mL缓冲液，1300-1350r/min离心5-6min，弃上清；向每108个细胞中加入500μL缓冲液重悬细胞，得细胞悬液；
S23、过柱前，用缓冲液冲洗分离柱，然后将上述细胞悬液加样至分离柱，用缓冲液洗柱3～5次，并加压将抗体阳性细胞冲洗至离心管中；
S24、将收集得到的抗体阳性细胞于1300-1350r/min离心5-6min，向其中加入相应的荧光标记抗体，混匀，2～8℃孵育10-12min，并于1h内上流式细胞仪进行流式检测；流式检测结果为阳性后，用SFMD培养液扩大培养分选获得的抗体阳性细胞，即得肿瘤干细胞。
利用免疫磁珠阳性双选筛选肿瘤干细胞的方法如下：
S31、将成球细胞消化成约108个/mL单细胞悬液，1300-1350r/min离心5-6min，弃上清；
S32、向细胞沉淀中加适量预冷的缓冲液重悬细胞；1300-1350r/min离心5-6min，弃上清；向每108个细胞中加入300μL缓冲液重悬细胞，并向其中加入100μL FcR BlockingReagent，混匀，然后加入100μL被特定肿瘤干细胞标志物I抗体预包被的MicroBeads；混匀，2～8℃孵育30min；然后向其中加入1mL缓冲液，1300-1350r/min离心5-6min，弃上清；向每108个细胞中加入500μL缓冲液重悬细胞，得细胞悬液；
S33、过柱前，用缓冲液冲洗分离柱，然后将上述细胞悬液加样至分离柱，用缓冲液洗柱3～5次，并加压将I抗体阳性细胞冲洗至离心管中；
S34、将收集得到的抗体阳性细胞于1300-1350r/min离心5-6min，向其中加入相应的荧光标记抗体，混匀，2～8℃孵育10-12min，并于1h内上流式细胞仪进行流式检测；流式检测结果为阳性后，用SFMD培养液扩大培养分选获得的I抗体阳性细胞；
S35、将上述扩大培养得到的I抗体阳性细胞于1300-1350r/min离心5-6min，弃上清；
S36、向细胞沉淀中加适量预冷的缓冲液重悬细胞，得到约107个/mL细胞悬液；1300-1350r/min离心5-6min，弃上清；向每约107个细胞中加入300μL缓冲液重悬细胞，并向其中加入100μL FcR Blocking Reagent，混匀，然后加入100μL被特定肿瘤干细胞标志物II抗体预包被的MicroBeads；混匀，2～8℃孵育30min；然后向其中加入1mL缓冲液，1300-1350r/min离心5-6min，弃上清；向每约107个细胞中加入500μL缓冲液重悬细胞，得细胞悬液；
S37、过柱前，用缓冲液冲洗分离柱，然后将上述细胞悬液加样至分离柱，用缓冲液洗柱3～5次，并加压将II抗体阳性细胞冲洗至离心管中；
S38、将收集得到的抗体阳性细胞于1300-1350r/min离心5-6min，向其中加入相应的荧光标记抗体，混匀，2～8℃孵育10-12min，并于1h内上流式细胞仪进行流式检测；流式检测结果为阳性后，用SFMD培养液扩大培养分选获得的II抗体阳性细胞，即得肿瘤干细胞。
前述方法中所用SFMD培养液的配方如下：DMEM-F12 50mL、50×B27 1mL、100ng/mL表皮生长因子10μL、100ng/mL人碱性成纤维生长因子10μL、20％BSA1mL、1mg/mL胰岛素20μL、青链霉素500μL、100mM左旋谷氨酰胺1mL。其中，所述青链霉素为10000U/mL青霉素和10mg/mL链霉素的混合液。
本发明进一步提供一种用于成球培养富集肿瘤干细胞的培养液，所述培养液的配方如下：DMEM-F12 50mL、50×B27 1mL、100ng/mL表皮生长因子10μL、100ng/mL人碱性成纤维生长因子10μL、20％BSA 1mL、1mg/mL胰岛素20μL、青链霉素500μL、100mM左旋谷氨酰胺1mL。其中，所述青链霉素为10000U/mL青霉素和10mg/mL链霉素的混合液。
本发明将肿瘤干细胞分选的成球分选和免疫磁珠分选两种经典方法结合使用，首先将肿瘤细胞在无血清的成球培养基中进行连续成球培养，并采用QPCR法，同步检测干细胞标志物的相对表达水平，当发现其特异性标志物表达量处于相对最高时，辅以免疫磁珠阳性单选或双选，两种筛选方法结合起来，从而显著改善肿瘤干细胞分选得率低，纯度低以及后续应用不便等实际问题。具体优点如下：
(一)筛选前的连续多代成球培养，有利于一定程度上提高肿瘤干细胞原始比例；由于肿瘤干细胞数目只占待分选细胞的1/10000-1/1000，因此起始量低，是困扰肿瘤干细胞分选的难题之一。成球分选法利用了肿瘤干细胞在成球培养基中拥有更强劲的肿瘤球生长能力这一特点，使肿瘤干细胞可以在成球培养条件下有效富集。
(二)通过QPCR法，实现干细胞标志物实时表达水平的检测，可有效掌握多代成球培养时相对干性最强的时机；根据不同种类的肿瘤细胞，查找相关文献以确定其常用的干性标志物，并设计引物，对不同代数(passage)的成球细胞进行这些标志物的相对表达水平检测，以确定干性相对最强的代数，作为后续免疫磁珠分选的细胞原料。
(三)利用干细胞标志物预包被的免疫磁珠阳性双选分选多代成球细胞中的干细胞，获得干细胞纯度较高，得率也远远高于直接免疫磁珠筛选，且磁珠可自行消化，不影响后续实验的正常进行。
附图说明
图1为本发明实施例1中普通分选法获得的CD133+/CD24+阳性细胞检测结果；其中，A为流式鉴定ACHN亲本细胞和连续成球培养至P3代的细胞系；B为流式鉴定ACHN亲本细胞和CD133/CD24免疫磁珠双阳细胞系。
图2为本发明实施例1中ACHN肾癌干细胞联合分选获得的CD133+/CD24+阳性细胞检测结果；其中，A为联续多代成球培养后QPCR检测肾癌干细胞经典标志物相对表达含量；B为P3代成球细胞进行CD133/CD24免疫磁珠双阳性筛选并进行流式检测。
图3为本发明实施例1中联合筛选ACHN肾癌干细胞干性验证结果；其中，A为QPCR对肾癌干细胞标志物的相对表达含量的检测；B图示裸鼠成瘤瘤体大小反应出联合筛选的肾癌干细胞比单纯P3代成球筛选以及单纯免疫磁珠双阳选所获得的干细胞在相同注射细胞浓度下具有更强的致瘤能力；C图示联合筛选的肾癌干细胞比单纯P3代成球筛选以及单纯免疫磁珠双阳选所获得的干细胞在相同成球培养条件下具有更强的自我更新(克隆形成)能力。
图4为本发明实施例2中普通分选法获得的CD133+/CD24+阳性细胞检测结果；其中，A为流式鉴定5637亲本细胞和连续成球培养至P4代的细胞系；B为流式鉴定5637亲本细胞和CD133/CD44免疫磁珠双阳细胞系。
图5为本发明实施例2中5637膀胱癌干细胞联合分选获得的CD133+/CD24+阳性细胞检测结果；其中，A为联续多代成球培养后QPCR检测膀胱癌干细胞经典标志物相对表达含量；B为P4代成球细胞进行CD133/CD44免疫磁珠双阳性筛选并进行流式检测。
图6为本发明实施例2中联合筛选ACHN肾癌干细胞干性验证结果；其中，A为QPCR对膀胱癌干细胞标志物的相对表达含量的检测；B图示裸鼠成瘤瘤体大小反应出联合筛选的膀胱癌干细胞比单纯P4代成球筛选以及单纯免疫磁珠双阳选所获得的干细胞在相同注射细胞浓度下具有更强的致瘤能力；C图示联合筛选的膀胱癌干细胞比单纯P4代成球筛选以及单纯免疫磁珠双阳选所获得的干细胞在相同成球培养条件下具有更强的自我更新(克隆形成)能力。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1肾癌细胞系ACHN肿瘤干细胞联合分选(CD133/CD24阳性双选)
1、多代成球培养
1)培养ACHN肿瘤细胞至80～90％满瓶，消化收集细胞，单细胞悬液按5×104个/ml接种到6孔超低吸附细胞培养板中，每孔用2mL SFMD培养液进行培养；
2)37℃、5％CO2培养96h,每隔一天加1mL培养液；
3)96h后于37℃、5％CO2细胞培养箱中用0.05％的胰酶消化液消化5min，肿瘤球变松散，加2mLSFMD培养基终止消化，吹打均匀，取均匀的细胞悬液10μL进行细胞计数，继续按5×104个/ml细胞密度种到新的6孔超低吸附细胞培养板中开始P2代成球培养；
4)重复上述步骤1)～3)，培养至P4代成球细胞；
5)收集四代肿瘤成球细胞，采用QPCR法，利用肿瘤干细胞通用标志物CD133/CD24/ABCG2/OCT4的相对含量检测，同时设置亲本肿瘤细胞为对照组(Con)；QPCR法所用引物序列见表1。
表1
6)根据干性标志物CD133/CD24/ABCG2/OCT4的相对表达含量，确定干性最强的P3代成球细胞，并将细胞成球扩大培养至P3代以满足磁珠筛选的起始数目要求。
2、免疫磁珠阳性单选筛选肿瘤干细胞
准备工作：通过查阅文献，CD133和CD24是肾癌干细胞标志物，故本实施例中采用CD133和CD24阳性双选。
(1)CD133阳性分选
①样品的制备
a)将ACHN细胞消化成单细胞悬液，并收集至离心管中；
b)细胞计数后调整细胞浓度至108个/mL；
c)离心细胞，1300r/min，离心5min；
②磁性标记
a)弃上清，加1mL预冷的缓冲液重悬细胞；
b)离心细胞，1300r/min，离心5min；
c)弃上清，每108细胞中加入300μL缓冲液重悬，如果超过108，用相应倍数体积；
d)用手中指轻轻的拍打，混匀；
e)每108细胞中加入100μL FcR Blocking Reagent；
f)每108细胞中加入100μL CD133MicroBeads(美天旎公司，货号：130-050-801)；
g)轻轻混匀，2～8℃冰箱中孵育30min，中间不断轻轻拍打混匀；
h)每108细胞中加入1mL缓冲液，1300r/min离心5min，弃上清；
i)每108细胞中加入500μL缓冲液重悬细胞；
③磁性分选
a)根据总细胞数目选择合适的柱子和分离器(108个细胞或者不足108个细胞用MS柱，大于108个细胞用LS柱)，将分离柱装入分离器中；
b)用缓冲液冲洗磁珠柱一遍(MS柱：500μL；LS柱：3mL)；
c)将细胞悬液用手轻轻的晃动混匀，用移液枪吸入磁珠柱中，同时收集未被标记的细胞，此为CD133阴性细胞；
d)用下列体积的缓冲液冲洗柱3次；(MS柱：100μL；LS柱：3mL)
e)将分离柱从分离器中拿出，置于新灭菌的离心管上方；
f)用下列体积的缓冲液洗脱标记的细胞；(MS柱：1mL；LS柱：5mL)
g)并加压将CD133阳性细胞冲下收集至离心管中；
④流式单染鉴定分选结果
a)将收集下来的ACHN/CD133+细胞1300r/min离心5min；
b)细胞计数后调整细胞浓度至107个/ml；
c)加入10ul CD133-PE，混匀；
d)2～8℃冰箱中孵育10min；
e)在1h内进行流式检测；
f)流式检测结果为阳性后，用干细胞培养基扩大培养培养剩余CD133+细胞备用；
对分选获得的CD133+细胞进行了后续干性验证，理论上判定为ACHN中具有干性的肿瘤干细胞。
(2)CD24阳性细胞分选
①样品的制备
将第一次分选后得到的CD133阳性细胞计数，调整细胞浓度至107个/mL；
②磁性标记
a)每107细胞中加入40μL缓冲液重悬；
b)每107细胞中加入10μL CD24-Biotin(美天旎公司，货号:130-095-951.)；
c)充分混匀，2～8℃冰箱中孵育15min；
d)每107细胞中加入0.5-1mL缓冲液，1300r/min离心5min，弃上清；
e)每107细胞中加入80μL缓冲液重悬；
f)每107细胞中加入20μL Anti-Biotin MicroBeads；
g)充分混匀，在2～8℃冰箱中孵育15min；
h)每107细胞中加入1-2mL缓冲液，1300r/min离心10min，弃上清；
i)每107细胞中加入500μL缓冲液重悬细胞；
③磁性分选
a)根据总细胞数目选择合适的柱子和分离器，将分离柱装入分离器中；
b)用缓冲液冲洗磁珠柱一遍(MS柱：500μL；LS柱：3mL)；
c)将细胞悬液用手轻轻的晃动混匀，用移液枪吸入磁珠柱中，同时收集未被标记的细胞，此为CD24阴性细胞；
d)用下列体积的缓冲液冲洗柱3次；(MS柱：100μL；LS柱：3mL)
e)将分离柱从分离器中拿出，置于新灭菌的离心管上方；
f)用下列体积的缓冲液洗脱标记的细胞；(MS柱：1mL；LS柱：5mL)
g)并加压将CD24阳性细胞冲下收集至离心管中；
④流式单染鉴定分选结果
a)将收集下来的CD24+细胞1300r/min离心5min；
b)细胞计数后调整细胞浓度至107个/ml；
c)加入10ul CD24-FITC，混匀；
d)2～8℃冰箱中孵育10min；
e)在1h内进行流式检测；
f)流式检测结果为阳性后，用干细胞培养基扩大培养培养剩余CD133+细胞备用。
对经双选获得的CD133+/CD24+阳性细胞进行了后续干性验证，理论上判定为ACHN中具有干性的肿瘤干细胞。
流式鉴定ACHN亲本细胞和连续成球培养至P3代的细胞系，结果见图1A，流式鉴定ACHN亲本细胞和CD133/CD24免疫磁珠双阳细胞系，结果见图1B。
由图1A可知，CD133/CD24双阳性细胞约占亲本ACHN细胞的4-5％左右，而经过连续三代成球培养后，其比率大约上升至27％，说明连续成球分选，可以从一定程度上富集肿瘤干细胞，但纯度不足30％。由图1B可知，经过直接对亲本细胞进行CD133/CD24双阳免疫磁珠分选，流式检测出的CD133+/CD24+的干细胞比率上升到81.56％，但分选后得率非常低，不足1/10000。
采用ACHN肾癌干细胞联合分选法获得的CD133+/CD24+阳性细胞，检测结果见图2。图2A为联续多代成球培养后QPCR检测肾癌干细胞经典标志物相对表达含量，可见P3代其干性已经达到相对高点，各干性标志物的表达水平都处于较高水平，故即用P3代ACHN细胞进行后续实验；图2B为P3代成球细胞进行CD133/CD24免疫磁珠双阳性筛选并进行流式检测，发现联合筛选后CD133+/CD24+干细胞比例达到了96.33％，得率约为1.6/1000。相对于图1B，其筛选到的肿瘤干细胞无论在纯度(96.33％/81.56％)和得率(0.016/0.0001)方面都有显著提高。
联合分选ACHN肾癌干细胞干性验证结果见图3。图3A为QPCR对肾癌干细胞标志物的相对表达含量的检测。可见联合筛选后各标志物含量均有大幅提升，而且均明显高于图2中连续成球培养时P3代的相对表达量，可见联合筛选比单纯成球筛选的效果好。图3B图示裸鼠成瘤瘤体大小反应出联合筛选的肾癌干细胞比单纯P3代成球筛选以及单纯免疫磁珠双阳选所获得的干细胞在相同注射细胞浓度下具有更强的致瘤能力。图3C图示联合筛选的肾癌干细胞比单纯P3代成球筛选以及单纯免疫磁珠双阳选所获得的干细胞在相同成球培养条件下具有更强的自我更新(克隆形成)能力。
实施例2膀胱癌细胞系5637肿瘤干细胞联合分选(CD133/CD44阳性双选)
1、多代成球培养
1)培养5637肿瘤细胞至80～90％满瓶，消化收集细胞，单细胞悬液按5×104个/ml接种到6孔超低吸附细胞培养板中，每孔用2mL SFMD培养液进行培养；
2)37℃、5％CO2培养96h,每隔一天加1mL培养液；
3)96h后于37℃、5％CO2细胞培养箱中用0.05％的胰酶消化液消化5min，肿瘤球变松散，加2mLSFMD培养基终止消化，吹打均匀，取均匀的细胞悬液10μL进行细胞计数，继续按5×104个/ml细胞密度种到新的6孔超低吸附细胞培养板中开始P2代成球培养；
4)重复上述步骤1)～3)，培养至P4代成球细胞；
5)收集四代肿瘤成球细胞，采用QPCR法，利用肿瘤干细胞通用标志物CD133/CD44/ABCG2/OCT4的相对含量检测，同时设置亲本肿瘤细胞为对照组(Con)；QPCR法所用引物序列见表2。
表2
6)根据干性标志物CD133/CD44/ABCG2/OCT4的相对表达含量，确定干性最强的P4代成球细胞，并将细胞成球扩大培养至P4代以满足磁珠筛选的起始数目要求。
2、免疫磁珠阳性单选筛选肿瘤干细胞
准备工作：通过查阅文献，CD133和CD44是肾癌干细胞标志物，故本实施例中采用CD133和CD44阳性双选。
2、免疫磁珠阳性双选筛选肿瘤干细胞
本实施例中采用CD133和CD44阳性双选。
(1)CD133阳性分选
①样品的制备
d)将5637细胞消化成单细胞悬液，并收集至离心管中；
e)细胞计数后调整细胞浓度至108个/mL；
f)离心细胞，1300r/min，离心5min；
②磁性标记
j)弃上清，加1mL预冷的缓冲液重悬细胞；
k)离心细胞，1300r/min，离心5min；
l)弃上清，每108细胞中加入300μL缓冲液重悬，如果超过108，用相应倍数体积；
m)用手中指轻轻的拍打，混匀；
n)每108细胞中加入100μL FcR Blocking Reagent；
o)每108细胞中加入100μL CD133MicroBeads；
p)轻轻混匀，2～8℃冰箱中孵育30min，中间不断轻轻拍打混匀；
q)每108细胞中加入1mL缓冲液，1300r/min离心5min，弃上清；
r)每108细胞中加入500μL缓冲液重悬细胞；
③磁性分选
h)根据总细胞数目选择合适的柱子和分离器(108个细胞或者不足108个细胞用MS柱，大于108个细胞用LS柱)，将分离柱装入分离器中；
i)用缓冲液冲洗磁珠柱一遍(MS柱：500μL；LS柱：3mL)；
j)将细胞悬液用手轻轻的晃动混匀，用移液枪吸入磁珠柱中，同时收集未被标记的细胞，此为CD133阴性细胞；
k)用下列体积的缓冲液冲洗柱3次；(MS柱：100μL；LS柱：3mL)
l)将分离柱从分离器中拿出，置于新灭菌的离心管上方；
m)用下列体积的缓冲液洗脱标记的细胞；(MS柱：1mL；LS柱：5mL)
n)并加压将CD133阳性细胞冲下收集至离心管中；
④流式单染鉴定分选结果
g)将收集下来的5637/CD133+细胞1300r/min离心5min；
h)细胞计数后调整细胞浓度至107个/ml；
i)加入10ul CD133-PE，混匀；
j)2～8℃冰箱中孵育10min；
k)在1h内进行流式检测；
l)流式检测结果为阳性后，用干细胞培养基扩大培养培养剩余CD133+细胞备用；
对分选获得的CD133+细胞进行了后续干性验证，理论上判定为ACHN中具有干性的肿瘤干细胞。
(2)CD44阳性细胞分选
①样品的制备
将第一次分选后得到的CD133阳性细胞计数，调整细胞浓度至107个/mL；
②磁性标记
j)每107细胞中加入40μL缓冲液重悬；
k)每107细胞中加入10μL CD44-Biotin(美天旎公司，货号：130-095-194)；
l)充分混匀，2～8℃冰箱中孵育15min；
m)每107细胞中加入0.5-1mL缓冲液，1300r/min离心5min，弃上清；
n)每107细胞中加入80μL缓冲液重悬；
o)每107细胞中加入20μL Anti-Biotin MicroBeads；
p)充分混匀，在2～8℃冰箱中孵育15min；
q)每107细胞中加入1-2mL缓冲液，1300r/min离心10min，弃上清；
r)每107细胞中加入500μL缓冲液重悬细胞；
③磁性分选
h)根据总细胞数目选择合适的柱子和分离器，将分离柱装入分离器中；
i)用缓冲液冲洗磁珠柱一遍(MS柱：500μL；LS柱：3mL)；
j)将细胞悬液用手轻轻的晃动混匀，用移液枪吸入磁珠柱中，同时收集未被标记的细胞，此为CD44阴性细胞；
k)用下列体积的缓冲液冲洗柱3次；(MS柱：100μL；LS柱：3mL)
l)将分离柱从分离器中拿出，置于新灭菌的离心管上方；
m)用下列体积的缓冲液洗脱标记的细胞；(MS柱：1mL；LS柱：5mL)
n)并加压将CD44阳性细胞冲下收集至离心管中；
④流式单染鉴定分选结果
g)将收集下来的CD44+细胞1300r/min离心5min；
h)细胞计数后调整细胞浓度至107个/ml；
i)加入10ul CD44-FITC，混匀；
j)2～8℃冰箱中孵育10min；
k)在1h内进行流式检测；
l)流式检测结果为阳性后，用干细胞培养基扩大培养培养剩余CD133+细胞备用。
对经双选获得的CD133+/CD44+阳性细胞进行了后续干性验证，理论上判定为5637中具有干性的肿瘤干细胞。
流式鉴定5637亲本细胞和连续成球培养至P4代的细胞系，结果见图4A，流式鉴定5637亲本细胞和CD133/CD44免疫磁珠双阳细胞系，结果见图4B。
由图4A可知，CD133/CD44双阳性细胞约占亲本5637细胞的4-5％左右，而经过连续四代成球培养后，其比率大约上升至22％，说明连续成球分选，可以从一定程度上富集肿瘤干细胞，但纯度不足30％。而通过图4B可知，经过直接对亲本细胞进行CD133/CD44双阳免疫磁珠分选，流式检测出的CD133+/CD44+的干细胞比率上升到84.3％，但分选后得率非常低，不足1/10000。
采用5637膀胱癌联合分选法获得的CD133+/CD44+阳性细胞，检测结果见图5。图5A为联续多代成球培养后QPCR检测膀胱癌干细胞经典标志物相对表达含量，可见P4代其干性已经达到相对高点，各干性标志物的表达水平都处于较高水平，故即用P4代5637细胞进行后续实验；图5B为P4代成球细胞进行CD133/CD44免疫磁珠双阳性筛选并进行流式检测，发现联合筛选后CD133+/CD44+干细胞比例达到了95.88％，得率约为1.43/1000。相对于图1B，其筛选到的肿瘤干细胞无论在纯度(95.88％/84.3％)和得率(0.0143/＜0.0001)方面都有显著提高。
联合分选5637膀胱癌干细胞干性验证结果见图6。图6A为QPCR对膀胱癌干细胞标志物的相对表达含量的检测。可见联合筛选后各标志物含量均有大幅提升，而且均明显高于图5中连续成球培养时P4代的相对表达量，可见联合筛选比单纯成球筛选的效果好。图6B图示裸鼠成瘤瘤体大小反应出联合筛选的膀胱癌干细胞比单纯P4代成球筛选以及单纯免疫磁珠双阳选所获得的干细胞在相同注射细胞浓度下具有更强的致瘤能力。图6C图示联合筛选的膀胱癌干细胞比单纯P4代成球筛选以及单纯免疫磁珠双阳选所获得的干细胞在相同成球培养条件下具有更强的自我更新(克隆形成)能力。

Claims (8)

1.肿瘤干细胞的富集和筛选方法，其特征在于，将成球培养和免疫磁珠分离法联合用于肿瘤干细胞的富集和筛选，具体方法如下：将肿瘤细胞在无血清的成球培养基中进行连续成球培养，并采用QPCR法同步检测肿瘤干细胞标志物的相对表达水平，当其特异性标志物表达量处于相对最高时，辅以免疫磁珠阳性单选或双选筛选肿瘤干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，成球培养包括以下步骤：
S11、培养肿瘤细胞至80～90％满瓶，消化收集细胞，单细胞悬液接种到6孔超低吸附细胞培养板中，接种密度为5×104-8×104个/孔，每孔加入2-2.5mL SFMD培养液，在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48h-96h，得到P1代成球细胞；
S12、于37℃、5％CO2细胞培养箱中，向培养液中加入0.05％的胰酶消化液消化细胞5-8min，待肿瘤球松散后，每孔加2-2.5mLSFMD培养液终止消化，吹打均匀，按5×104-8×104个/孔的细胞密度接种到新的6孔超低吸附细胞培养板中在37℃、5％CO2条件下进行P2代成球培养，培养48h-96h，得到P2代成球细胞；
S13、重复上述步骤S12，培养下一代成球细胞；
S14、对于得到的每一代肿瘤成球细胞，采用QPCR法检测肿瘤干细胞标志物的相对表达量，同时设置亲本肿瘤细胞为对照；
S15、根据肿瘤干细胞标志物的相对表达含量，确定干性最强的Pn代成球细胞，并将细胞成球扩大培养至Pn代成球细胞满足磁珠筛选的起始数目要求。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S14中所述的肿瘤干细胞标志物包括肿瘤干细胞通用标志物CD133、KLF4、ABCG2、OCT4、Nango、c-Myc。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，免疫磁珠分离法使用的免疫磁珠为表面分别包被有不同类型肿瘤干细胞标志物单克隆抗体的生物性免疫磁珠。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，利用免疫磁珠阳性单选筛选肿瘤干细胞的方法如下：
S21、将成球细胞消化成107个/mL单细胞悬液，1300-1350r/min离心5-6min，弃上清；
S22、向细胞沉淀中加适量预冷的缓冲液重悬细胞；1300-1350r/min离心5-6min，弃上清；向每108个细胞中加入300μL缓冲液重悬细胞，并向其中加入100μL FcR BlockingReagent，混匀，然后加入100μL被特定肿瘤干细胞标志物抗体预包被的MicroBeads；混匀，2～8℃孵育30min；然后向其中加入1mL缓冲液，1300-1350r/min离心5-6min，弃上清；向每108个细胞中加入500μL缓冲液重悬细胞，得细胞悬液；
S23、过柱前，用缓冲液冲洗分离柱，然后将上述细胞悬液加样至分离柱，用缓冲液洗柱3～5次，并加压将抗体阳性细胞冲洗至离心管中；
S24、将收集得到的抗体阳性细胞于1300-1350r/min离心5-6min，向其中加入相应的荧光标记抗体，混匀，2～8℃孵育10-12min，并于1h内上流式细胞仪进行流式检测；流式检测结果为阳性后，用SFMD培养液扩大培养分选获得的抗体阳性细胞，即得肿瘤干细胞。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，利用免疫磁珠阳性双选筛选肿瘤干细胞的方法如下：
S31、将成球细胞消化成约108个/mL单细胞悬液，1300-1350r/min离心5-6min，弃上清；
S32、向细胞沉淀中加适量预冷的缓冲液重悬细胞；1300-1350r/min离心5-6min，弃上清；向每108个细胞中加入300μL缓冲液重悬细胞，并向其中加入100μL FcR BlockingReagent，混匀，然后加入100μL被特定肿瘤干细胞标志物I抗体预包被的MicroBeads；混匀，2～8℃孵育30min；然后向其中加入1mL缓冲液，1300-1350r/min离心5-6min，弃上清；向每108个细胞中加入500μL缓冲液重悬细胞，得细胞悬液；
S33、过柱前，用缓冲液冲洗分离柱，然后将上述细胞悬液加样至分离柱，用缓冲液洗柱3～5次，并加压将I抗体阳性细胞冲洗至离心管中；
S34、将收集得到的抗体阳性细胞于1300-1350r/min离心5-6min，向其中加入相应的荧光标记抗体，混匀，2～8℃孵育10-12min，并于1h内上流式细胞仪进行流式检测；流式检测结果为阳性后，用SFMD培养液扩大培养分选获得的I抗体阳性细胞；
S35、将上述扩大培养得到的I抗体阳性细胞于1300-1350r/min离心5-6min，弃上清；
S36、向细胞沉淀中加适量预冷的缓冲液重悬细胞，得到107个/mL细胞悬液；1300-1350r/min离心5-6min，弃上清；向每107个细胞中加入300μL缓冲液重悬细胞，并向其中加入100μL FcR Blocking Reagent，混匀，然后加入100μL被特定肿瘤干细胞标志物II抗体预包被的MicroBeads；混匀，2～8℃孵育30min；然后向其中加入1mL缓冲液，1300-1350r/min离心5-6min，弃上清；向每107个细胞中加入500μL缓冲液重悬细胞，得细胞悬液；
S37、过柱前，用缓冲液冲洗分离柱，然后将上述细胞悬液加样至分离柱，用缓冲液洗柱3～5次，并加压将II抗体阳性细胞冲洗至离心管中；
S38、将收集得到的抗体阳性细胞于1300-1350r/min离心5-6min，向其中加入相应的荧光标记抗体，混匀，2～8℃孵育10-12min，并于1h内上流式细胞仪进行流式检测；流式检测结果为阳性后，用SFMD培养液扩大培养分选获得的II抗体阳性细胞，即得肿瘤干细胞。
7.根据权利要求2-6任一项所述的方法，其特征在于，所述SFMD培养液的配方如下：DMEM-F12 50mL、50×B27 1mL、100ng/mL表皮生长因子10μL、100ng/mL人碱性成纤维生长因子10μL、20％BSA 1mL、1mg/mL胰岛素20μL、青链霉素500μL、100mM左旋谷氨酰胺1mL；其中，所述青链霉素为10000U/mL青霉素和10mg/mL链霉素的混合液。
8.用于成球培养富集肿瘤干细胞的培养液，其特征在于，所述培养液的配方如下：DMEM-F12 50mL、50×B27 1mL、100ng/mL表皮生长因子10μL、100ng/mL人碱性成纤维生长因子10μL、20％BSA1mL、1mg/mL胰岛素20μL、青链霉素500μL、100mM左旋谷氨酰胺1mL；其中，所述青链霉素为10000U/mL青霉素和10mg/mL链霉素的混合液。
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