CN109576272A - 一种dkk-1核酸适配体及其应用 - Google Patents

一种dkk-1核酸适配体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种DKK‑1核酸适配体及其应用，属于基因工程、免疫学和肿瘤学技术领域。所述的适配体为SEQ ID NO：1~5中所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列。本发明核酸适配体利用蛋白SELEX技术筛选而得，分子量较小，易于合成与修饰，能够高特异性识别并且高亲和力结合DKK‑1，与其它蛋白不发生特性结合，无免疫原性，稳定易修饰，便于合成和保存。用所述适配体制备的DKK‑1检测试剂盒和试剂纸对DKK‑1检测灵敏度高，且易于优化。在肝癌诊断、肝癌预后与监测的评估，肝癌诊断中应用。

Description

一种DKK-1核酸适配体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程、免疫学和肿瘤学技术领域，特别涉及一种DKK-1核酸适配体。
背景技术
肝癌是一个全球性问题，是世界癌症相关死亡的第二大常见原因。其发病隐匿，恶性程度高，病死率高，大多数患者就诊时已属于晚期，从而错失了最佳的治疗时机。因此，对肝癌进行早期诊断和筛查具有极其重要的意义。甲胎蛋白（AFP）是目前肝癌临床诊断使用的“金标准”，特异性可达76％至96％，但灵敏度却不到70％，在临床上约30%-40%的肝癌患者的AFP呈阴性，因此迫切需要找到具有较高敏感度和特异性的用于检测肝癌早期或更早期的新型的血清生物标志物。近年来，有研究表明，DKK-1可以作为肝癌早期的生物标记物，在肝癌患者的血清中高表达，感受性曲线（receiver operating characteristic curve,ROC曲线）提示最佳诊断值可达到2.153ng/mL。检测敏感性为69.1%，特异性为90.6%。对AFP阴性样本，DKK-1检测的敏感性和特异性分别为70.4%和90.5%，可以弥补AFP诊断能力的不足。
核酸适配体是经过筛选的得到的用于结合特定靶标的短的单链DNA‍（single-stranded DNA, ssDNA）或RNA分子，具有易于合成，免疫原性较低，分子量小（10-15kDa）等优势。因为具有与抗体类似的作用，因此又被称为“化学抗体”。核酸适配体的出现为化学生物学界和生物医学界提供了一种新的识别工具，尤其在肝癌早期诊断方面展示了良好的应用前景。目前尚未有DKK-1适配体筛选的报道，若能够筛选出能够特异性结合DKK-1的适配体，无疑为DKK-1的检测提供更宽广的平台。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种DKK-1核酸适配体及其应用。
为实现本发明目的所使用的技术方案为：
本发明的DKK-1核酸适配体，所述的适配体为SEQ ID NO：1~5中所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列。
优选的，所述的适配体具有与SEQ ID NO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列的同源性为60%以上的序列。
优选的，所述的适配体具有与SEQ ID NO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行杂交的序列。
优选的，所述的适配体具有与SEQ ID NO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行转录的序列。
优选的，所述的适配体序列上的若干个位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。
优选的，所述的适配体序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸或酶标记。
优选的，所述的DKK-1核酸适配体具有与SEQ ID NO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列改造成的相应的肽核酸。
本发明还提供一种DKK-1核酸适配体在制备DKK-1检测试剂盒或检测试剂纸的应用。
本发明突出的实质性特点和显著的进步是：
本发明核酸适配体利用蛋白SELEX技术筛选而得，分子量较小，易于合成与修饰，能够高特异性识别并且高亲和力结合DKK-1，与其它细菌不发生特性结合，无免疫原性，稳定易修饰，便于合成和保存，可用于检测DKK-1，并且有效地预防及控制DKK-1具有重要意义。用所述适配体制备的DKK-1检测试剂盒和试剂纸对DKK-1检测灵敏度高，且易于优化。
附图说明
图1是DKK-1-beads偶联物SDS-PAGE凝胶电泳。
图2是第1轮至11轮筛选中PCR热循环数优化结果。
图3是流式细胞术用于监测与DKK-1蛋白或空白镍磁珠结合的筛选文库的富集进程结果。
图4是五条候选核酸适配体与靶蛋白结合的平衡解离常数。
图5流式细胞术用于考察各适配体截短序列对不同蛋白的特异性。
图6是序列优化前后各核酸适配体的Kd值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例
偶联
本实验筛选的靶标是蛋白，为使结合靶蛋白的文库与未结合靶蛋白的文库分离，需要将靶蛋白固定在磁珠表面。在筛选开始之前，需要摸索 DKK-1蛋白与镍磁珠的偶联条件。图1的SDS-PAGE凝胶电泳结果显示DKK-1分子量正确（45 kD），并且DKK-1蛋白能够成功偶联到磁珠表面。另外，从泳道2-6可以看出，随着磁珠量的增加，磁珠表面结合上的蛋白量增加，当磁珠增加到15μg和17.5μg时，磁珠表面偶联的蛋白量达到饱和，考虑到过多的磁珠加入会增加文库与镍磁珠的结合机率从而降低文库的特异性，故选取0.5μg和15μg蛋白的偶联条件为最佳条件。
筛选条件的选择
各轮的筛选条件见下表：
表1 筛选压力的调控
筛选轮数 文库用量（pmol） 正筛孵育时间（min） 反筛Ni-beads用量（μL） 反筛孵育时间（min） 正筛洗涤次数 洗涤缓冲液体积（μL）
1 5000 40 - - 2 200
2 200 40 - - 2 200
3 200 30 5 10 2 200
4 200 30 5 10 2 200
5 200 30 5 10 2 200
6 200 30 5 10 2 200
7 200 20 7 20 4 400
8 200 20 7 20 4 400
9 200 20 7 20 4 400
10 200 20 7 20 4 400
11 200 20 7 20 4 400
3 PCR热循环数优化
每一轮筛选的产物进行PCR扩增时，需要优化PCR扩增的循环数，以保证在获得扩增最高产量的DNA目的片段的前提下，产生的非特异性条带最少，这样可以减少下轮筛选的次级库的非特异性，提高富集效果。每轮筛选的PCR环节，取不同热循环数之下的扩增产物进行3%琼脂糖凝胶电泳，然后对比条带的亮度与集中程度。结果如图2所示，每轮筛选均选取位置正确、亮度最高、条带单一且集中的循环数作为最佳循环数进行第二次PCR扩增。
筛选文库富集程度判定
为监测筛选过程中与DKK-1-beads结合的各ssDNA次级文库的富集程度，选择带FAM荧光标记的第5轮、第9轮、第10轮、第11轮ssDNA次级文库，以FAM标记的0轮文库（初始文库）作为阴性对照，利用流式细胞仪测定DKK-1-beads与上述次级文库孵育后的荧光强度。同时使用反筛选Ni-beads作为阴性对照。流式细胞实验结果如图3所示。从图3 B可以看出，随着筛选轮数的不断增加，筛选文库与DKK-1蛋白的结合荧光曲线逐渐向右偏移，表明结合到DKK-1蛋白表面的荧光强度逐渐增强，筛选文库得到有效富集。产生这种现象的原因是随着筛选的进行，与DKK-1蛋白结合力较弱的群体逐渐被洗脱去除，而与DKK-1蛋白结合力较强的ssDNA群体逐渐被保留并且在文库中占有的比例不断增加。当筛选达到第11轮，荧光强度不再增加，提示筛选文库与DKK-1蛋白的结合达到饱和。同时考察了FAM标记的第0轮、第5轮、第9轮、第10轮、第11轮ssDNA次级文库与反筛选Ni-beads的结合情况。从图3 A可以看出，随着筛选轮数的不断增加，筛选文库与DKK-1蛋白的结合荧光强度并未发生明显变化，且与DKK-1蛋白结合随机文库的荧光强度相当，说明Ni-beads对筛选文库的非特异性吸附不多，所引入的反筛选起到良好效果。本实验结果证明，筛选文库得到很好的富集且趋于饱和，筛选达到终点。
测序结果及分析
通过上述流式细胞术监测结果可知，经过11轮的筛选，文库得到很好的富集，且富集达到饱和。因此，将第11轮得到的ssDNA使用无标记引物进行PCR扩增，然后送至上海生工生物工程有限公司进行TA克隆测序。随机挑选100个克隆子进行测序分析。与原始文库相比较，100条适配体序列的寡核苷酸长度大致相同，共78 nt，两端为结合引物的固定序列区，中间包括40个核苷酸随机序列区。将测序返回的100条序列通过Clustal 1.81软件进行分析汇总，100条测序序列中，有几条序列重复出现，其频率分别为25%、46%、15%、7%及7%，这也部分证明筛选文库得到了有效的富集。
表2 第11轮产物测序序列统计`
名称 序列（5’-3’） K<sub>d </sub>（nM）
D-apt1 AGCGTCGAATACCACTACAGGCTCTTAGCAACTTGAGGGGGTGGTTAACAGGAAATTGTCTAATGGAGCTCGTGGTCA 38.56±31.24
D-apt2 AGCGTCGAATACCACTACAGCGAGTTTGTCATCGGAGGGGGTGGTTAACAGGAGGATTGTCTAATGGAGCTCGTGGTCA 14.96±12.77
D-apt3 AGCGTCGAATACCACTACAGCTATTTGGAAACGAGGGGGTGGTTAACAGGAGTTTGCTCACTAATGGAGCTCGTGGTCA 37.54±16.48
D-apt4 AGCGTCGAATACCACTACAGGCGCTAATTTGGTAATGAGGGGGTGGTTAACAGGAATTCCCTAATGGAGCTCGTGGTCA 80.57±65.70
D-apt5 AGCGTCGAATACCACTACAGTTCCCGCGGAGGAAGTTGACCCCCTTTTGCTTTGACGACCCTAATGGAGCTCGTGGTCA 3.92±11.40
6 平衡解离常数的测定
为考察各候选适配体与DKK-1蛋白的亲和力，将一系列浓度梯度（0、10、25、50、100、200nM）带有FAM荧光标记的各候选适配体（D-apt1、D-apt2、D-apt3、D-apt4、D-apt5）与DKK-1-beads进行孵育，使用流式细胞术检测DKK-1-beads表面荧光强度。然后使用SIGMAPLOT软件的单点吸附模型对荧光强度与适配体浓度进行拟合，从而获得各候选适配体的平衡解离常数（Kd）。图4，5条候选适配体的Kd值处于纳摩尔级别，其中D-apt2的Kd值最低，仅为14.96±12.77 nM。提示各候选适配体与DKK-1靶蛋白均具有很强的亲和力，而D-apt2与DKK-1的亲和力最强。
的特异性分析
从上述结果可见，D-apt2适配体在克隆测序序列中出现的频率最高，在结合力验证中，与DKK-1蛋白的结合率最高，而亲和力鉴定中，具有最小的Kd值，即与DKK-1蛋白的亲和力最强。鉴于D-apt2适配体具有良好的性能，因此，在接下来的实验中，选择D-apt2进行深入研究。本实验选择另外两种肝癌生物标记物——带his标签的重组人GP73蛋白与重组人AFP蛋白，对D-apt2的特异性进行考察。将带有FAM荧光标记的D-apt2适配体分别与DKK-1-beads、GP73-beads和AFP-beads的偶联物孵育，使用流式细胞术检测DKK-1-beads、GP73-beads和AFP-beads表面的荧光强度。结果如图5所示，D-apt2适配体与靶蛋白DKK-1能够很好的结合（图5 C），而与其他两组不结合或结合较微弱（图5 A, B）。表明D-apt2的靶向性良好，能够为肝癌早期诊断与治疗的相关研究提供良好基础。
优化序列设计
可从第一部分研究得出，D-apt2适配体在克隆测序序列中出现的频率最高，在结合力验证中，与DKK-1蛋白的结合率最高，而亲和力鉴定中，具有最小的Kd值，即与DKK-1蛋白的亲和力最强，并且具有很好的特异性。鉴于D-apt2适配体具有良好的性能，因此，在接下来的实验中，选择D-apt2进行深入研究。在各类功能研究当中，DNA的长度越长，稳定性相应变差。另外，适配体中有部分碱基序列并不具有结合靶蛋白的作用，这些多余的碱基序列可能会产生空间位阻，反而不利于适配体结合靶蛋白。D-apt2适配体的长度为78 nt，长度偏长，因此，本研究对D-apt2序列进行进一步优化，优化方法主要采用引物端序列截短的方式，即将原序列的两端引物结合区进行全部或部分去除。优化截短后的各适配体序列如表3所示。
表3 D-apt2优化截短序列
名称 序列（5’-3’） 碱基数
D-apt2 <u>AGCGTCGAATACCACTACAG</u>CGAGTTTGTCATCGGAGGGGGTGGTTAACAGGAGGATTGT<u>CTAATGGAGCTCGTG</u><u>GTCA</u> 79 nt
D-apt2a CGAGTTTGTCATCGGAGGGGGTGGTTAACAGGAGGATTGT<u>CTAATGGAGCTCGTGGTCA</u> 59 nt
D-apt2b <u>AGCGTCGAATACCACTACAG</u>CGAGTTTGTCATCGGAGGGGGTGGTTAACAGGAGGATTGT 60 nt
D-apt2c CGAGTTTGTCATCGGAGGGGGTGGTTAACAGGAGGATTGT 40 nt
在D-apt2适配体的基础上，设计得到了三条截短序列。其中，D-apt2a主要是去除D-apt2的正向引物结合区，截短后的序列长度为59 nt；D-apt2b主要是去除D-apt2的反向引物结合区，截短后的序列长度为60nt；而D-apt2c是主要是去除D-apt2的两端引物结合区，截短后的仅剩下随机序列区，序列长度为40 nt。
优化序列的亲和力考察
将D-apt2核酸适配体序列进行截断优化，得到D-apt2a、D-apt2b及D-apt2c。然后使用流式细胞术测定其Kd值，对其亲和力进行考察。图6为序列优化前后各核酸适配体的Kd值。可以看出，D-apt2a、D-apt2b及D-apt2c核酸适配体的Kd值分别为 20.60±7.08 nM，69.87±26.63 nM 和 9.7±4.13 nM，结合第一部分的结果，原始的适配体D-apt2的Kd值为14.96±12.77 nM，可以看出，和原始序列D-apt2相比，D-apt2c的Kd值进一步降低，而D-apt2a、D-apt2b的Kd值有不同程度的升高。分析结果可知，优化后的D-apt2a和D-apt2b核酸适配体的Kd值有不同程度的增大，而具有最短的核酸适配体序列D-apt2c的Kd值却变小，提示两端的引物结合区可能在不利于核酸适配体的最优二级结构的形成，从而在某种程度阻碍了与靶蛋白结合的亲和力。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的包含范围之内。
序列表
<110> 广西医科大学
<120> 一种DKK-1核酸适配体及其应用
<141> 2018-07-02
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 1
agcgtcgaat accactacag gctcttagca acttgagggg gtggttaaca ggaaattgtc 60
taatggagct cgtggtca 78
<210> 2
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 2
agcgtcgaat accactacag cgagtttgtc atcggagggg gtggttaaca ggaggattgt 60
ctaatggagc tcgtggtca 79
<210> 3
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 3
agcgtcgaat accactacag ctatttggaa acgagggggt ggttaacagg agtttgctca 60
ctaatggagc tcgtggtca 79
<210> 4
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 4
agcgtcgaat accactacag gcgctaattt ggtaatgagg gggtggttaa caggaattcc 60
ctaatggagc tcgtggtca 79
<210> 5
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)
<400> 5
agcgtcgaat accactacag ttcccgcgga ggaagttgac ccccttttgc tttgacgacc 60
ctaatggagc tcgtggtca 79

Claims (9)

1.一种DKK-1核酸适配体，其特征在于，所述的适配体为SEQ ID NO：1~5中所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列。
2.根据权利要求1所述的DKK-1核酸适配体，其特征在于，所述的适配体具有与SEQ IDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列的同源性为60%以上的序列。
3.根据权利要求1所述的DKK-1核酸适配体，其特征在于，所述的适配体具有与SEQ IDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行杂交的序列。
4.根据权利要求1所述的DKK-1核酸适配体，其特征在于，所述的适配体具有与SEQ IDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行转录的序列。
5.根据权利要求1所述的DKK-1核酸适配体，其特征在于，所述的适配体具有与SEQ IDNO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列进行优化截短的序列。
6.根据权利要求1所述的DKK-1核酸适配体，其特征在于，所述的适配体序列上的若干个位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。
7.根据权利要求1所述的DKK-1核酸适配体，其特征在于，所述的适配体序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸或酶标记。
8.根据权利要求1所述的DKK-1核酸适配体，其特征在于，所述的DKK-1核酸适配体具有与SEQ ID NO：1~5所示的核苷酸序列中的任意一条或几条序列改造成的相应的肽核酸。
9.权利要求1-7任意一项所述DKK-1核酸适配体在制备DKK-1检测试剂盒或检测试剂纸的应用。
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