CN114836426B

CN114836426B - 一种结合dkk1蛋白的核酸适配体及其应用

Info

Publication number: CN114836426B
Application number: CN202210375121.9A
Authority: CN
Inventors: 罗昭锋; 张峥; 方晓娜; 何嘉轩; 贾浩然; 陈敏
Original assignee: Institute Of Basic Medicine And Oncology Chinese Academy Of Sciences Preparatory
Current assignee: Institute Of Basic Medicine And Oncology Chinese Academy Of Sciences Preparatory
Priority date: 2022-04-11
Filing date: 2022-04-11
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2042-04-11
Also published as: CN114836426A

Abstract

本发明提供一种结合DKK1蛋白的核酸适配体及其应用，通过改进筛选条件，筛选获得一种分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够以高亲和力结合DKK1蛋白的核酸适配体，并能阻断kermen与DKK1蛋白结合，该核酸适配体与DKK1蛋白结合的具体结构域位于CRD2片段，经截短至17个核苷酸长度后，依然能保持与DKK1蛋白的CRD2片段的高亲和力和高特异性结合，可用于检测、诊断、成像以及治疗等方面，应用前景广阔。

Description

一种结合DKK1蛋白的核酸适配体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种结合DKK1蛋白的核酸适配体及其应用，尤其涉及一种结合DKK1蛋白的CRD2片段的核酸适配体及其应用。

背景技术

Dickkopf相关蛋白家族的成员(DKK-1、-2、-3和-4)是分泌蛋白，具有两个由连接区隔开的富含半胱氨酸的结构域。DKK1通过抑制WNT信号通路参与胚胎发育，并与LRP6高亲和力结合，阻止卷曲WNT-LRP6复合体的形成，以响应Wnts。当DKK1与细胞表面受体Kremen形成三元复合物时，它促进LRP6的内化和降解。DKK1不仅在发育过程中作为头部诱导剂，还调控关节重塑和骨形成，提示DKK1在类风湿关节炎和多发性骨髓瘤发病机制中发挥作用。最近的研究报道，DKK1从一个确定的发育时间点开始影响眼睛的发育，并且通过β-catenin介导的Pdgfrα和E-cadherin表达，对晶镜从外胚层表面分离至关重要。

Dkk1可以特异地与Wnt的受体之一LRP5/6结合，从而干扰LRP5/6与Wnt-Frizzled复合物的结合，抑制下游信号的传导。Dkk1的另一个高亲和性受体是Kremen(Krm)，进一步的研究发现在Krm2存在的情况下，Dkk1可以与LRP6和Krm2形成三元复合物，并且这个三元复合物可以迅速地发生内吞。因此人们认为由于这种内吞现象的存在，膜表面的LRP6可以被清除，从而进一步抑制Wnt/β-catenin信号。目前对于Dkk1能够抑制Wnt/β-catenin信号的解释主要有两种模型。第一种模型是Dkk可以与Wnt竞争受体LRP6，使得LRP6无法与Wnt和Frizzled形成三元复合物，从而阻断了下游信号的传导。第二种模型是Dkk1，Kremen和LRP6能够重新形成另一个三元复合物，这个复合物可以迅速地发生内吞，从而将LRP6从细胞膜表面清除，进一步抑制Wnt信号。实际上这两种模型并不相互矛盾。第一种模型可以看成是一个短期的抑制效应，主要是Dkk1通过与配体Wnt竞争受体LRP6来抑制信号；而第二种模型则是较为长期的抑制效应，即在竞争受体的基础上通过进一步减少受体LRP6的量更彻底长期地抑制Wnt信号。所以，人体内的DKK1蛋白含量过高异常表达，会影响很多下游信号通路。目前已发现在多种癌症(如肝癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌、子宫内膜癌、子宫肿瘤、癌肉瘤等)中均异常过高表达。

相对应的针对DKK1靶点研发的多种小分子药物正在研发当中，且这类药物一般靶向性不高，副作用或毒性也多。

核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面展示广阔的前景。核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。

CN107760686B公开了一种DKK1蛋白的核酸适配体，但其不能明确与DKK1蛋白结合的具体结构域，难以进一步深入开发研究；其序列是RNA、较长且无法截短，直接影响到核酸适配体后续的生产、保藏和应用的便利性。

因此，急需找到一种针对DKK1蛋白的结合亲和力高，特异性好，并能明确结合的具体结构域，精确截短后依然保持高结合亲和力，易于修饰和人工合成，稳定性好，使用便利的核酸适配体。

发明内容

为弥补已有技术的缺陷，本发明提供一种结合DKK1蛋白的核酸适配体，通过改进筛选条件，筛选获得一种分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够以高亲和力结合DKK1蛋白的核酸适配体，并能阻断kermen蛋白与DKK1蛋白结合，DKK1蛋白与筛选得到的核酸适配体结合的具体结构域位于CRD2片段，并且经截短至17个核苷酸长度后，依然能保持与DKK1蛋白的CRD2片段的高亲和力和高特异性结合，可用于检测、诊断、成像以及治疗等方面，应用前景广阔。

一方面，本发明提供了一种结合DKK1蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或与SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3具有至少30％同源性且结合DKK1蛋白的核苷酸序列；或由如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列转录的RNA序列。

本发明人基于SELEX技术，设计并合成了一个随机单链DNA文库和相应的引物，用来筛选具有分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够以高亲和力结合DKK1蛋白的核酸适配体，由此筛选得到一些高亲和力结合DKK1蛋白的核酸适配体，分别为ZZK1-1(SEQID NO.1)、ZZK1-29(SEQ ID NO.2)和ZZK1-17(SEQ ID NO.3)，该核酸适配体与DKK1蛋白具有更高的亲和力，并且具有更高的特异性。

其中，ZZK1-17为从ZZK1-1中截短至仅含有17个核苷酸的核酸适配体而获得，截短后的ZZK1-17与ZZK1-1相比与DKK1蛋白或DKK1-CRD2蛋白的亲和力并未下降，反而上升。

可以理解的是，与本发明提供的核酸适配体具有至少30％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％的同源性且结合DKK1蛋白的核苷酸序列，例如可将上述核酸适配体的任一个所示的核苷酸序列删除部分序列或增加部分序列，依然具有与DKK1蛋白的高亲和力，依然在本发明的保护范围内。

在一些方式中，作为对上述技术方案的改进，可对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行修饰，例如，磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合DKK1蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。

所以，在一些实施方案中，所述核酸适配体的核苷酸序列被修饰且修饰后的核酸适配体特异性结合DKK1蛋白，所述修饰选自磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的至少一种，依然在本发明的保护范围内。

进一步地，所述核酸适配体能与DKK1蛋白的CRD2片段结合片段，所述CRD2片段具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

本发明所述的DKK1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

CRD2片段为DKK1蛋白上的具体结构域，研究证明，本发明提供的核酸适配体能与DKK1蛋白的结构域CRD2结合。

进一步地，所述具有如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的核酸适配体，是从如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列中截短而获得。

如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的核酸适配体仅仅具有17个核苷酸碱基，是由SEQID NO.1所示的核苷酸序列的核酸适配体中截取而获得，采用该截取的分子量更小的核酸适配体，依然能与DKK1蛋白的结构域CRD2具有非常高的亲和力，且具有非常高的特异性，性能稳定，易于修饰和人工合成，易于保存和标记，具有更高的临床应用价值。

另一方面，本发明提供了一种结合DKK1蛋白的CRD2片段的核酸适配体，所述核酸适配体具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或与SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3具有至少30％同源性且结合DKK1蛋白的核苷酸序列；或由如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列转录的RNA序列。

进一步地，所述CRD2片段具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

再一方面，本发明提供了一种核酸适配体的缀合物或衍生物，所述核酸适配体具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述核酸适配体的缀合物包括荧光标记物；所述核酸适配体的衍生物包括由核酸适配体或核酸适配体的缀合物的核苷酸序列骨架改造成的结合DKK1蛋白的硫代磷酸酯骨架或肽核酸。

本发明所述的核酸适配体的缀合物，是指在核酸适配体上连接其他基团，比如可以连接具有标志作用的荧光标记物，例如FAM、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA或酶标记等，使修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合DKK1蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。

换言之，以上不论是经部分取代或经过修饰后的核酸适配体，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于与DKK1蛋白的结合。

此外，本发明还提供核酸适配体衍生物，所述衍生物是由上述核酸适配体的核苷酸序列的骨架改造成结合DKK1蛋白的硫代磷酸酯骨架而得，或者是前述任一项技术方案中所述核酸适配体或核酸适配体的缀合物改造成的结合DKK1蛋白的肽核酸。条件是所述衍生物都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，且都与DKK1蛋白结合。

本发明所使用的术语“硫代磷酸酯骨架”具有本领域普通技术人员一般理解的含义，其是指RNA和DNA核酸适配体的磷酸二酯骨架的非桥键氧原子可以被一个或两个硫原子取代，分别产生具有硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键的硫代磷酸酯骨架。已知这样的硫代磷酸酯骨架具有增加的对其靶标的结合亲和力，以及对核酸酶降解的增强的抗性。

本发明所使用的术语“肽核酸”具有本领域普通技术人员一般理解的含义，其是指一种人工合成DNA分子类似物，于1991年由Nielsen等首次报道。用N-2-(氨乙基)-甘氨酸(N-(2-aminoethyl)-glycine)单位代替糖-磷酸酯骨架作为重复结构单元，合成了以肽键连接的寡核苷酸模拟物，称为肽核酸。由于肽核酸(PNA)没有如DNA或RNA上的磷酸基团，因此PNA与DNA之间缺乏电性相斥的现象，使两者之间的结合强度大于DNA与DNA之间的结合强度。

再一方面，本发明提供了一种纯化或检测DKK1蛋白或DKK1蛋白的CRD2片段的产品，所述产品中包括如上所述的核酸适配体或如上所述的核酸适配体的缀合物或衍生物；所述产品包括试剂盒、检测芯片、层析检测装置。

再一方面，本发明提供了一种结合DKK1蛋白的核酸适配体的筛选方法，所述方法包括以下步骤：

(1)合成随机单链DNA文库和引物；

(2)磁珠法筛选：进行至少8轮的反筛与筛选，并在第6轮开始添加血清。

进一步地，步骤(2)所述的在第六轮以后添加血清，具体过程为：第6轮添加10％血清，第7轮添加25％血清，第8轮添加50％血清；所述血清为人血清(正常人血清，购买自北京索莱宝科技有限公司，货号：SL010)。

本发明通过在磁珠法筛选过程中添加血清，筛选获得的核酸适配体具有更高的亲和力和更好的特异性，只结合DKK1蛋白，不与其他蛋白结合，能够阻断kermen蛋白与DKK1蛋白结合，并能用于DKK1蛋白的检测。

在本发明的提供的筛选结合DKK1蛋白的核酸适配体的方法是在SELEX筛选方法的基础上，在磁珠法筛选的步骤中，从第6轮开始增加血清进行封闭并逐轮提高血清浓度进一步提高核酸适配体的特异性与稳定性。

核酸适配体筛选常规条件是在离子缓冲液中进行，而在筛选条件下逐步添加一定浓度的血清，一方面因为血清中含有丰富的蛋白，可以与磁珠表面的蛋白竞争性的与文库结合，从而去除那些与靶标DKK1蛋白结合能力很弱或者只是吸附上的序列。另一方面，适配体在血清环境中结合靶标，可以更好的满足后期基于核酸适配体开发的应用的实际检测环境。

研究证明，在筛选的最后几轮中，采用更高浓度的血清，能够筛选获得亲和力更高，特异性更好的核酸适配体。

再一方面，本发明提供了一种核酸适配体或核酸适配体的缀合物或衍生物用于制备结合DKK1的CRD2片段从而阻断kermen与DKK1蛋白结合的制剂的用途。

Wnt信号通路是一条非常保守的信号转导途径，在许多生理过程中都发挥了重要的作用。Dickkopf是Wnt信号通路中重要的拮抗分子之一，能够特异性的抑制经典Wnt信号通路。Dickkopf抑制经典Wnt信号的分子机制主要有两种：一、DKK1主要通过在细胞外与配体Wnt竞争受体LRP6蛋白从而抑制Wnt信号；二、在Kremen蛋白存在的情况下，DKK1通过诱导形成DKK1-LRP6-Kremen三元复合物，并迅速诱导这个三元复合物的内吞从而发挥抑制功能。

经研究证明，本发明提供的核酸适配体能够结合DKK1的CRD2片段从而阻断kermen蛋白与DKK1蛋白结合，从而能够抑制Dickkopf对Wnt信号通路的拮抗作用。

再一方面，本发明提供了上述核酸适配体、其缀合物或其衍生物在由以下各项组成的组中的任意一项中的用途：

1)定量或定性检测DKK1蛋白或DKK1-CRD2蛋白；

2)纯化DKK1蛋白、或DKK1-CRD2蛋白；

3)DKK1蛋白或DKK1-CRD2蛋白的成像；

4)作为DKK1蛋白或DKK1-CRD2蛋白的抑制剂；

5)制备阻断DKK1蛋白或DKK1-CRD2蛋白与Kremen蛋白结合的抑制剂；

6)制备靶向到DKK1蛋白或DKK1-CRD2蛋白的药物；

7)制备用于诊断和治疗DKK1或DKK1-CRD2表达异常的试剂或药物。

本发明提供的结合DKK1蛋白的核酸适配体的有益效果为：

1、通过改进筛选条件，筛选获得一种分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够以高亲和力和高特异性结合DKK1蛋白的核酸适配体；

2、明确了该核酸适配体与DKK1蛋白结合的具体结构域CRD2；

3、核酸适配体经截短至17个核苷酸长度后，依然能保持与DKK1蛋白以及与DKK1的CRD2片段的高亲和力和高特异性结合；

4、能阻断kermen或LRP6蛋白与DKK1蛋白结合，从而能够抑制Dickkopf对Wnt信号通路的拮抗作用；

5、结构相对稳定、简单、易于修饰以及短期内可以人工合成、化学性质稳定、易于保存和标记；

6、可用于检测、诊断、成像以及治疗等方面，如可用于纯化或高灵敏度检测DKK1蛋白或DKK1-CRD2蛋白；可用于制备靶向DKK1蛋白或DKK1-CRD2蛋白的药物；可用于诊断和治疗DKK1或DKK1-CRD2表达异常的试剂或药物等等，应用前景广阔。

附图说明

图1为实施例1中利用SPR检测第零、三、八轮筛选得到的富集文库与靶标蛋白的结合能力情况示意图；

图2为实施例4中核酸适配体ZZK1-1、ZZK1-29和ZZK1-17与DKK1蛋白的亲和力检测结果示意图；

图3为实施例5中核酸适配体ZZK1-1、ZZK1-29和ZZK1-17与DKK1蛋白的亲和力检测结果示意图；

图4为实施例6中核酸适配体ZZK1-17的特异性研究结果示意图；

图5为实施例6中核酸适配体ZZK1-29的特异性研究结果示意图；

图6为实施例7中Kremen蛋白与DKK1-CRD2蛋白的亲和力检测结果示意图；

图7为实施例7中核酸适配体ZZK1-29阻断DKK1-CRD2蛋白与其天然配体蛋白Kremen结合的结果示意图；

图8为实施例7中核酸适配体ZZK1-17阻断DKK1-CRD2蛋白与其天然配体蛋白Kremen结合的结果示意图；

图9为实施例8中核酸适配体ZZK1-17与ZZK1-29的斑点杂交实验检测DKK1蛋白和DKK1-CRD2蛋白的结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本实施例中未特别指出的试剂均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1：结合DKK1蛋白的ssDNA核酸适配体的筛选

本实施例筛选结合DKK1蛋白的ssDNA核酸适配体的方法包括以下步骤：

1、合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：

随机单链DNA文库：

5’-CTACGGTGCCTTGAAGTGAC-36N-CATAGCAGGTCACTTCCAGG-3’(SEQ ID NO.5)；

其中，“36N”表示36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

引物信息如表1，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1、引物及其序列

其中，引物名称中的S代表正向引物，引物名称中A代表反向引物，序列中的19个A表示由19个腺苷酸(A)组成的polyA尾，“Spacer 18”表示18原子的六乙二醇间臂。在上述lib25-ployA-A2中所用的“Spacer 18”结构式如下式所示。

引物分别用DPBS缓冲液(氯化钙0.1g/L，氯化钾0.2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，六水氯化镁0.1g/L，氯化钠8g/L，十二水磷酸氢二钠2.8915g/L；PH7.4，25℃)配制成100μM的贮存液，于-20℃保存备用。

2、磁珠法筛选

采用磁珠法筛选，共计筛选8轮，每一轮的筛选流程见表2。

表2、DKK1蛋白核酸适配体筛选流程

轮数	反筛	缓冲溶液
			第一轮	偶联His磁珠	DPBS缓冲液
第二轮	偶联His磁珠	DPBS缓冲液
			第三轮	偶联His磁珠	DPBS缓冲液
第四轮	偶联His磁珠	DPBS缓冲液
			第五轮	偶联His磁珠	DPBS缓冲液
第六轮	偶联His磁珠	DPBS缓冲液含10％血清
			第七轮	偶联His磁珠	DPBS缓冲液含25％血清
第八轮	偶联His磁珠	DPBS缓冲液含50％血清

具体筛选过程如下：

1)羧基磁珠固定DKK1蛋白

取50μl羧基磁珠(江苏泽成生物技术有限公司，货号：FM2221)，用200μl超纯水清洗4遍，磁铁垂钓磁珠，去上清。取配置好的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺；0.1M水溶液)和EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4M水溶液)各100μL，等体积混合，加入到磁珠中，25℃孵育20分钟活化磁珠表面的羧基，磁珠用DPBS缓冲液清洗2遍后备用。

取10μl的DKK1蛋白(购自义翘神州，10170-H08H，浓度为1mg/ml)，加入pH3.6的10mM醋酸钠80μl混匀，加入到上述的活化磁珠中。25℃置于垂直混合仪上孵育60分钟，DKK1蛋白通过蛋白表面的氨基偶联到磁珠表面。

偶联结束，将偶联管置于磁力架上，吸弃上清，取100μl 1M乙醇胺pH8.5加入到磁珠中，25℃垂直混合仪上孵育10分钟，封闭磁珠表面未反应的活化位点。置于磁力架上，吸弃封闭液。磁珠用200μlDPBS清洗4遍，标记为MB-DKK1。

2)反筛与筛选

反筛磁珠制备：将his小肽与磁珠偶联，his小肽由金斯瑞生物科技有限公司合成，为9个连续的组氨酸，偶联his蛋白的步骤与偶联DKK1蛋白相同。His小肽的浓度为1mg/ml，用pH4.0的10mM NaAC溶液稀释，具体的，取20μl his小肽，加入80μl pH4.0的10mM NaAC溶液混匀。其余步骤一样。偶联完的磁珠标记为MB-his。

文库溶解与变复性处理：取1OD随机单链核苷酸文库，14000rpm离心5分钟，将文库离心到管底，用DPBS缓冲液溶解至10μM，混匀后分装到PCR管进行变复性处理。处理过程如下：PCR仪设定程序95℃保持10分钟，此步骤目的是使折叠的链解开，然后4℃保持5分钟，然后平衡至室温。将处理后的文库加入到50μl的MB-his磁珠，混匀后在垂直混合仪上室温孵育一段时间。置于磁力架上，收集上清，标记为pool-，上清作为单链核酸文库与MB-DKK1磁珠进行正筛。每一轮磁珠筛选，在进行以DKK1蛋白为靶标的正筛之前都先用MB-his进行反筛，反筛上清作为单链核苷酸文库与MB-DKK1磁珠进行正筛。具体的为：将反筛后的文库pool-加入到50μl MB-DKK1磁珠中，在垂直混合仪上25℃孵育40分钟。置于磁力架上，吸弃上清，保留磁珠，用200μl DPBS清洗磁珠4次。最后在清洗后的磁珠中加入200μlDPBS，沸水浴10分钟，收集上清，标记为elution-DKK1。

以elution-DKK1中的核酸分子为模板，用普通PCR进行扩增。方法如下：将全部模板elution-DKK1加入2ml PCR mix中混匀，将模板与PCR mix混合物分成100μl/管加入到PCR管中，扩增条件如下：95℃预变性2分钟，95℃变性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，共25个循环，4℃保存。PCR mix购自安徽省昂普拓迈(Aptamy)生物科技有限公司，货号为ESE2018。

扩增产物用正丁醇纯化：收集所有的PCR产物于15ml尖底离心管中，加入5倍体积的正丁醇，在旋涡混合器上震荡以充分混匀；台式离心机，9000rpm(转/分钟)于25℃离心10分钟；移弃上相(正丁醇)，得到浓缩的PCR扩增产物，按体积比1：1加入TBE/尿素变性缓冲液，煮沸变性10分钟使DNA变性，随后冰浴1分钟，将所有的样品进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，400V电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部，使带荧光的FAM标记的正义链与反向的加长的链分开，7M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶配方如下表3。

表3、变性聚丙烯酰胺凝胶配方

成分	用量
		尿素	3.78g
40％聚丙烯酰胺	1.8ml
		5*TBE	1.8ml
ddH2O	2.25ml
		10％APS	60μl
TEMED	15μl

切胶回收FAM标记的链：将凝胶取出放在塑料膜上，Ex(nm)：495，Em(nm)：517，检测我们需要的带有FAM标记的ssDNA；用干净的刀片将目的条带直接切下，将胶条转移至1.5mlEP管中并捣碎，加入1ml ddH2O后沸水浴10分钟将胶中的ssDNA转移至溶液中，离心去除胶的碎片，留上清。上清用正丁醇纯化，得到DNA单链用3KD的透析袋透析过夜，即可作为下一轮筛选的文库。

磁珠法重复筛选8轮，每次操作均以前一次操作中得到的次级文库为起始核酸文库，文库进行变复性处理之后，与MB-DKK1磁珠进行孵育。筛选过程中用SPR检测DNA单链文库对DKK1蛋白识别能力的变化，当DNA单链文库对DKK1蛋白的识别能力满足要求，即筛选后的DNA单链文库与靶标蛋白的结合能力高于筛选起始投入的文库(图1)，图1中p0，p3，p8分别表示初始文库、第3轮和第8轮筛选得到的文库，可以看出第8轮得到的文库比第3轮与靶标的亲和力高，且p3比p0高很多，满足测序要求，将所得文库经高通量测序分析。

3、分析和鉴定筛选后得到的核酸适配体：将得到的富集文库产物经高通量测序分析后，挑选若干条序列由金唯智生物(江苏)科技有限公司合成，并检测亲和力。

在后续检测中，确定了2条序列具有很强的结合能力，分别为具有如SEQ ID NO:1或2所示的核苷酸序列的核酸适配体，将它们分别命名为ZZK1-1和ZZK1-29。

实施例2：ZZK1-1截短后与截短前的比较

将ZZK1-1进行截短之后得到了SEQ ID NO.3所示的核酸适配体，且验证后具有理想的结合DKK1的亲和力，将其命名为ZZK1-17。用SPR检测ZZK1-17对DKK1蛋白识别能力的变化，验证截短后仅含有17个核苷酸的核酸适配体与截短前对结合DKK1或DKK1-CRD2的亲和力的比较。

实验结果证明，截短后仅含有17个核苷酸的核酸适配体(SEQ ID NO.3)，与DKK1、DKK1-CRD2的亲和力分别达到了6.7nM与8.3nM，与截短前对比核酸适配体的亲和力虽然没有明显改变，但是明显提升了核酸适配体的特异性，并大大降低了合成难度，说明证ZZK1这一条核酸适配体的关键结构域的核心区就在ZZK1-17中，且经过截短核酸适配体的亲和力没有受到任何影响。

实施例3：不同筛选方法对筛选核酸适配体的影响

本实施例采用实施例1提供的方法进行核酸适配体的筛选，其中在磁珠筛选过程中，分别采用以下四种方法进行筛选，1、不添加血清；2、在第3轮开始各添加50％血清；3、在第六轮开始各添加50％血清；4、在第8轮开始添加50％血清；5、第3轮添加10％血清，第4轮添加25％血清，第5轮添加50％血清；6、第6轮添加10％血清，第7轮添加25％血清，第8轮添加50％血清；其中的血清购自购买自北京索莱宝科技有限公司，货号：SL010；考察筛选结果如表4所示。

表4、不同筛选方法对筛选核酸适配体的影响

组别	筛选结果
		1	筛选得多条亲和力不高的核酸适配体
2	未筛选到合适的核酸适配体
		3	未筛选到合适的核酸适配体
4	筛选得1条亲和力不高的核酸适配体
		5	未筛选到合适的核酸适配体
6	筛选得2条高亲和力高特异性的核酸适配体(ZZK1-1和ZZK1-29)

由表4可以看出，不同的筛选方法对筛选核酸适配体的结果会有不同，当在筛选第3轮或第6轮就开始添加50％血清时，可能由于血清浓度较高，未能筛到合适的核酸适配体；而当在第8轮直接添加50％血清时，也难以筛得高亲和力高特异性的核酸适配体；当第3轮添加10％血清，第4轮添加25％血清，第5轮添加50％血清，同样未能筛到合适的核酸适配体；而当采用从第6轮开始10％血清，第7轮添加25％血清，第8轮添加50％血清，顺利筛选到两条具有高亲和力高特异性的核酸适配体，可见从第6轮开始添加血清，并且之后几轮筛选时，血清含量逐渐增加过程中，才更有利于筛得合适的核酸适配体。

实施例4：表面等离子共振(SPR)检测DKK1蛋白核酸适配体ZZK1-1、ZZK1-17和ZZK1-29与DKK1蛋白的亲和力

委托苏州金唯智生物科技有限责任公司合成核酸适配体ZZK1-1、ZZK1-17和ZZK1-29，将其分别用DPBS缓冲液稀释成500nM。

1、将DKK1蛋白偶联到CM5芯片表面的第2通道，具体方法如下：先用50mM NaOH清洗芯片，进样20μl，流速10μl/分钟，然后用将等体积的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4M水溶液)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺；0.1M水溶液)两个试剂混合后进样50μl活化芯片，流速5μl/分钟。将DKK1蛋白用pH3.6的10mM醋酸钠稀释至终浓度为50μg/mL后进样，进样体积50μL，流速5μL/分钟，DKK1蛋白偶联量为4500Ru。进样完成后，进乙醇胺封闭芯片，流速5μL/分钟，进样50μL。第1通道按照上述处理，偶联his小肽的步骤，活化和封闭的步骤完全一样，作为对照通道。

2、检测：使用表面等离子共振仪(GE Healthcare，型号：Biacore 8K)设定检测参数，稀释好的3种适配体样品依次流过1、2、通道，每一个适配体的程序如下：进样30μL/分钟，时间3分钟，解离30μL/分钟，时间3分钟，再生1M NaCl 30μL/分钟，时间30秒，将稀释好的3种核酸适配体依次进样。

核酸适配体ZZK1-1、ZZK1-29和ZZK1-17与DKK1蛋白的亲和力检测数据见图2，KD值分别如下表5所示，说明了对应的核酸适配体与靶标蛋白DKK1蛋白的结合能力。这些数据说明核酸适配体ZZK1-1、ZZK1-29和ZZK1-17用SPR仪均检测到与DKK1蛋白有很强的结合。

表5、核酸适配体与DKK1蛋白的亲和力

核酸适配体	与DKK1蛋白的亲和力KD(nM)
		SEQ ID NO.1(ZZK1-1):	4.5
SEQ ID NO.2(ZZK1-29):	3.6
		SEQ ID NO.3(ZZK1-17):	6.7

由表5可见，ZZK1-1、ZZK1-17和ZZK1-29与DKK1蛋白都具有非常高的亲和力，尤其是ZZK1-17，虽然截短至只有17个核酸碱基，但是与DKK1的亲和力依旧非常高。

实施例5：表面等离子共振(SPR)检测核酸适配体ZZK1-1、ZZK1-17和ZZK1-29与DKK1-CRD2蛋白的亲和力

采用实施例4中将DKK1蛋白固定到SPR芯片进行测试的方法，将DKK1-CRD2蛋白(实验室通过大肠杆菌质粒重组基因表达纯化得到，具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列)偶联到芯片表面的2通道，偶联量为2400RU；将his小肽(南京金斯瑞生物科技有限公司)偶联到第1通道，偶联量为500RU。使用表面等离子共振仪(GE Healthcare，型号：Biacore 8K)设定检测参数，将实施例4步骤1中稀释好的3种适配体样品依次进样，每种依次流过1、2通道，每一个适配体的程序如下：进样30μL/分钟，时间3分钟，解离30μL/分钟，时间3分钟，再生1MNaCl 30μL/分钟，时间30秒。

核酸适配体ZZK1-1、ZZK1-29和ZZK1-17与DKK1-CRD2蛋白结合的亲和力检测数据见图3，KD值分别如表6所示，这些数据说明核酸适配体ZZK1-1、ZZK1-29和ZZK1-17用SPR仪均检测到与DKK1-CRD2蛋白有很强的结合，而与对照蛋白his没有结合。说明实施例1和实施例2筛选所得的3种核酸适配体，既能和DKK蛋白结合，也能和DKK1-CRD2结合。

表6、核酸适配体与DKK1-CRD2蛋白的亲和力

核酸适配体	与DKK1-CRD2蛋白亲和力KD(nM)
		SEQ ID NO.1(ZZK1-1):	4.8
SEQ ID NO:2(ZZK1-29):	3.9
		SEQ ID NO:3(ZZK1-17):	8.3

由表5可见，ZZK1-1、ZZK1-29和ZZK1-17都与DKK1-CRD2具有非常好的亲和力，且三种核酸适配体与DKK1或DKK1-CRD2的亲和力相当，同时也说明ZZK1-1、ZZK1-29和ZZK1-17具体是通过与DKK1上的CRD2片段结合，从而实现结合DKK1蛋白。其中，尤其是ZZK1-17，与DKK1上的CRD2片段的亲和力特别高。

实施例6：核酸适配体ZZK1-17和ZZK1-29的特异性研究

本实施例分别采用MED26蛋白、CD262蛋白、BSA蛋白、BRD4蛋白代替DKK1或DKK1-CRD2蛋白，与实施例4中将DKK1蛋白固定到SPR芯片进行测试的方法相同，分别将MED26蛋白、CD262蛋白、BSA蛋白、BRD4蛋白偶联到CM5芯片表面四个Channal的第2通道，偶联量分别为2600RU、3500RU、4000RU、2750RU。将稀释好的ZZK1-17和ZZK1-29核酸适配体依次进样。

核酸适配体ZZK1-17与MED26蛋白、CD262蛋白、BSA蛋白、BRD4蛋白的亲和力检测数据见图4，可见核酸适配体ZZK1-29与MED26蛋白、CD262蛋白、BSA蛋白、BRD4蛋白的亲和力检测数据见图5。由图4和图5可以看出，核酸适配体ZZK1-17和ZZK1-29都无法与MED26蛋白、CD262蛋白、BSA蛋白、BRD4蛋白结合，可见其具有非常好的特异性。

实施例7：基于核酸适配体ZZK1-17和ZZK1-29阻断和DKK1-CRD2蛋白与其天然配体蛋白Kremen的结合实验

与实施例4中将DKK1蛋白固定到SPR芯片进行测试的方法相同。将DKK1-CRD2蛋白(实验室通过大肠杆菌质粒重组基因表达纯化得到，具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列)偶联到芯片表面的2通道，偶联量为2400RU；将his小肽(南京金斯瑞生物科技有限公司)偶联到第1通道，偶联量为500RU。使用表面等离子共振仪(GE Healthcare，型号：Biacore8K)设定检测参数，采用按照实施例4的方法稀释好核酸适配体样品与kermen蛋白样品，第一个循环直接进样天然配体Kremen蛋白得到曲线1(图6)，再生后使用单循环进样法先进样核酸适配体ZZK1-29，然后再进样DKK1-CRD2蛋白的天然配体Kremen，得到的曲线2(图7)。然后再用相同的方法检测ZZK1-17，得到曲线3(图8)。

曲线1(图6)测试流程为进样Kremen，测试流程如下：进样30μL/分钟，时间3分钟，解离30μL/分钟，时间3分钟，再生使用pH2.5甘氨酸盐酸再生，30μL/分钟，时间30秒。

曲线2(图7)测试的流程为ZZK1-29进样30uL/分钟，进样2.5分钟，继续进样Kremen30uL/分钟，进样2.5分钟。结合之后使用pH2.5甘氨酸盐酸再生30μL/分钟，时间30秒。

曲线3(图8)测试的流程为ZZK1-17进样30uL/分钟，进样2.5分钟，继续进样Kremen30uL/分钟，进样2.5分钟。结合之后使用pH2.5甘氨酸盐酸再生30μL/分钟，时间30秒。

对比图6和图7可以看出，在没有ZZK1-29的情况下(图6)，Kremen与DKK1蛋白具有非常好的亲和力，而当通入ZZK1-29后(图7)，在210秒至360秒之间出现水平直线，无法检测到Kremen与DKK1蛋白检测的响应值，说明ZZK1-29能够顺利阻止Kremen与DKK1蛋白的结合。

同样，对比图6和图8可以看出，在没有ZZK1-17的情况下(图6)，Kremen与DKK1蛋白具有非常好的亲和力，而当通入ZZK1-17后(图8)，在210秒至360秒之间出现水平直线，无法检测到Kremen与DKK1蛋白检测的响应值，说明ZZK1-17能够顺利阻止Kremen与DKK1蛋白的结合。

可见，ZZK1-17和ZZK1-29都能够顺利阻断DKK1-CRD2蛋白与Kremen的结合。

实施例8：基于核酸适配体ZZK1-17和ZZK1-29的斑点杂交实验检测DKK1蛋白和DKK1-CRD2蛋白

本实施例进行的斑点杂交实验步骤如下：

1.取2块8cm×2cm的硝酸纤维素膜(购自Millipore)，将DKK1蛋白和DKK1-CRD2蛋白分别用DPBS稀释成0.125mg/ml，将对照蛋白His小肽和对照蛋白fc蛋白也分别稀释成0.125mg/ml。点样4ul到硝酸纤维素膜上，自然风干40分钟。

2.待干燥后，用10％小牛血清在室温封闭3小时，封闭结束后用DPBST(DPBS含万分之0.5tween20)清洗3次，吸净。

3.用生物素修饰实施例4中金唯智生物合成的核酸适配体ZZK1-17稀释到0.5uM然后将稀释后的核酸适配体与硝酸纤维素膜上的蛋白在摇床室温孵育2小时。

5.孵育结束后用DPBST洗三次，清洗时放置在摇床上，每次10分钟。

6.加入用DPBST按照1:10000稀释的HRP-标记的链霉抗生物素蛋白(购自碧云天，货号A0303)，室温摇床孵育30分钟。

7.DPBST洗3次，清洗时放置在摇床上，每次10分钟。

8.以A液：B液＝1:1(v/v)的比例加入显色液(BeyoECL Star特超敏ECL化学发光试剂盒，购自碧云天，货号P0018A，A液和B液为试剂盒自带溶液)，在室温显色2分钟。

9.成像系统观察拍照：使用仪器为GE医疗生命科学部的ImageQuant^TMLAS 4000数字成像系统。

核酸适配体ZZK1-29的检测方法同上ZZK1-17，步骤1的蛋白浓度分别为：将DKK1蛋白和DKK1-CRD2分别用DPBS稀释成0.125mg/ml，同时将对照蛋白His小肽和对照蛋白fc蛋白分别稀释成0.125mg/ml。点样2ul到硝酸纤维素膜上，自然风干40分钟。其余步骤均一样。

结果如图9所示，其中1为DKK1蛋白，2为HIS小肽，3为DKK1-CRD2蛋白，4为fc蛋白；图9上图为核酸适配体ZZK1-29的斑点杂交实验结果，图9下图为核酸适配体ZZK1-17的斑点杂交实验结果。由图9可以看出，与对照蛋白HIS小肽、fc蛋白的斑点相比，DKK1蛋白和DKK1-CRD2蛋白显色明显，这说明生物素修饰的ZZK1-17和ZZK1-29均可以用于膜杂交DKK1蛋白和DKK1-CRD2蛋白的检测，并且不结合对照蛋白HIS小肽、fc蛋白。

从图9还可以看出，本发明提供的ZZK1-17和ZZK1-29只能结合DKK1蛋白和DKK1-CRD2蛋白，并不能与其他蛋白如HIS小肽、fc蛋白结合，具有很高的特异性。

同时还可以证明，ZZK1-17和ZZK1-29能用于准确检测125ng/ml的DKK1蛋白或DKK1-CRD2蛋白。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

SEQ ID NO.1

ZZK1-1

CTACGGTGCCTTGAAGTGACTCGGGGCAACCTGCGCACCTTCCCCCCCGGAACATTCATAGCAGG

TCACTTCCAGG

SEQ ID NO.2

ZZK1-29

CTACGGTGCCTTGAAGTGACGCCTCGCAACGCGCCAGACGTATCTGTTTGGGTTTACATAGCAGG

TCACTTCCAGG

SEQ ID NO.3

ZZK1-17

GGGGCAACCTGCGCACC

SEQ ID NO.4

DKK1-CRD2

GPGSGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSC

RIQKDHHQASNSSRLHTCQRH

SEQ ID NO.5

DKK1

MMALGAAGATRVFVAMVAAALGGHPLLGVSATLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGI

LYPGGNKYQTIDNYQPYPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNY

CKNGICVSSDQNHFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCC

ARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQRH

SEQ ID NO.6

lib25S1

CTACGGTGCCTTGAAGTGAC

SEQ ID NO.7

lib25-FAM-S1

FAM-CTACGGTGCCTTGAAGTGAC

SEQ ID NO.8

lib25-ployA-A2

AAAAAAAAAAAAAAAAAAA/Spacer18/CCTGGAAGTGACCTGCTATG

SEQ ID NO.9

lib25A2

CCTGGAAGTGACCTGCTATG

序列表

<110> 中国科学院基础医学与肿瘤研究所（筹）

<120> 一种结合DKK1蛋白的核酸适配体及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctacggtgcc ttgaagtgac tcggggcaac ctgcgcacct tcccccccgg aacattcata 60

gcaggtcact tccagg 76

<210> 2

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctacggtgcc ttgaagtgac gcctcgcaac gcgccagacg tatctgtttg ggtttacata 60

gcaggtcact tccagg 76

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggggcaacct gcgcacc 17

<210> 4

<211> 88

<212> PRT

<213> 天然序列(Natural sequence)

<400> 4

Gly Pro Gly Ser Gly Gln Glu Gly Ser Val Cys Leu Arg Ser Ser Asp

1 5 10 15

Cys Ala Ser Gly Leu Cys Cys Ala Arg His Phe Trp Ser Lys Ile Cys

20 25 30

Lys Pro Val Leu Lys Glu Gly Gln Val Cys Thr Lys His Arg Arg Lys

35 40 45

Gly Ser His Gly Leu Glu Ile Phe Gln Arg Cys Tyr Cys Gly Glu Gly

50 55 60

Leu Ser Cys Arg Ile Gln Lys Asp His His Gln Ala Ser Asn Ser Ser

65 70 75 80

Arg Leu His Thr Cys Gln Arg His

85

<210> 5

<211> 266

<212> PRT

<213> 天然序列(Natural sequence)

<400> 5

Met Met Ala Leu Gly Ala Ala Gly Ala Thr Arg Val Phe Val Ala Met

1 5 10 15

Val Ala Ala Ala Leu Gly Gly His Pro Leu Leu Gly Val Ser Ala Thr

20 25 30

Leu Asn Ser Val Leu Asn Ser Asn Ala Ile Lys Asn Leu Pro Pro Pro

35 40 45

Leu Gly Gly Ala Ala Gly His Pro Gly Ser Ala Val Ser Ala Ala Pro

50 55 60

Gly Ile Leu Tyr Pro Gly Gly Asn Lys Tyr Gln Thr Ile Asp Asn Tyr

65 70 75 80

Gln Pro Tyr Pro Cys Ala Glu Asp Glu Glu Cys Gly Thr Asp Glu Tyr

85 90 95

Cys Ala Ser Pro Thr Arg Gly Gly Asp Ala Gly Val Gln Ile Cys Leu

100 105 110

Ala Cys Arg Lys Arg Arg Lys Arg Cys Met Arg His Ala Met Cys Cys

115 120 125

Pro Gly Asn Tyr Cys Lys Asn Gly Ile Cys Val Ser Ser Asp Gln Asn

130 135 140

His Phe Arg Gly Glu Ile Glu Glu Thr Ile Thr Glu Ser Phe Gly Asn

145 150 155 160

Asp His Ser Thr Leu Asp Gly Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Leu Ser Ser

165 170 175

Lys Met Tyr His Thr Lys Gly Gln Glu Gly Ser Val Cys Leu Arg Ser

180 185 190

Ser Asp Cys Ala Ser Gly Leu Cys Cys Ala Arg His Phe Trp Ser Lys

195 200 205

Ile Cys Lys Pro Val Leu Lys Glu Gly Gln Val Cys Thr Lys His Arg

210 215 220

Arg Lys Gly Ser His Gly Leu Glu Ile Phe Gln Arg Cys Tyr Cys Gly

225 230 235 240

Glu Gly Leu Ser Cys Arg Ile Gln Lys Asp His His Gln Ala Ser Asn

245 250 255

Ser Ser Arg Leu His Thr Cys Gln Arg His

260 265

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctacggtgcc ttgaagtgac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctacggtgcc ttgaagtgac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cctggaagtg acctgctatg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctggaagtg acctgctatg 20

Claims

1.一种结合DKK1蛋白的核酸适配体，其特征在于，为如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体能与DKK1蛋白的CRD2片段结合，所述CRD2片段为如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的核酸适配体，其特征在于，所述如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的核酸适配体，是从如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中截短而获得。

4.一种核酸适配体的缀合物或衍生物，其特征在于，所述核酸适配体为如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述核酸适配体的缀合物包括荧光标记物；所述核酸适配体的衍生物包括由核酸适配体或核酸适配体的缀合物的核苷酸序列骨架改造成的结合DKK1蛋白的硫代磷酸酯骨架或肽核酸。

5.一种纯化或检测DKK1蛋白或DKK1蛋白的CRD2片段的产品，其特征在于，包括如权利要求1~3任一项所述的核酸适配体或权利要求4所述的核酸适配体的缀合物或衍生物；所述产品包括试剂盒、检测芯片、层析检测装置。

6.如权利要求1~3任一项所述的核酸适配体或如权利要求4所述的核酸适配体的缀合物或衍生物用于制备纯化或高灵敏度检测DKK1蛋白或DKK1-CRD2蛋白、或阻断DKK1蛋白与Kremen蛋白结合的抑制剂、或靶向DKK1蛋白或DKK1-CRD2蛋白的药物、或诊断和治疗DKK1或DKK1-CRD2表达异常的试剂或药物的用途。