CN110938632A - 一种特异结合tnf-r1的适配体及其筛选方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及特异结合TNF‑R1的适配体，特别是指一种特异结合TNF‑R1的适配体及其筛选方法和应用。包括如SEQ ID No.1‑7所示的序列及若干截短后的活性序列。本发明还涉及上述适配体的筛选方法及用途，利用指数富集的配体系统进化技术，筛选分离获得7条可以特异结合人源或鼠源TNF受体蛋白1的DNA适配体；并通过分析序列结构进行进一步截短，得到保持其结合能力的长度最短DNA片段，经斑点杂交表征和SPR测定，这7条DNA活性序列都能与鼠/人TNFR1蛋白结合，结合能力强，且特异性好，灵敏度高，与BSA蛋白没有结合。

Description

一种特异结合TNF-R1的适配体及其筛选方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及特异结合TNF-R1的适配体，特别是指一种特异结合TNF-R1的适配体及其筛选方法和应用。
背景技术
类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种免疫紊乱疾病，发病者的关节滑膜保持慢性炎症状态，并随病情恶化逐渐丧失行动能力。迄今为止，RA还无法完全治愈，临床治疗目标是降低RA造成的关节损伤以及延缓病情发展。RA的发病机制较为复杂，目前研究较多的病理因素是细胞因子，其中肿瘤坏死因子TNF-α和其受体TNFR的研究最为成熟。
TNF-α是由活化的的单核细胞、巨噬细胞和T细胞产生的蛋白，在感染者或炎症患者的发病组织中高表达。TNF-α的受体蛋白有TNF受体1（TNFR1）和TNF受体2（TNFR2）。其中，TNFR1是一个55 kDa的 I型跨膜蛋白。人TNFR1含455个氨基酸（aa），包含21 aa的信号序列和四个CRD (半胱氨酸丰富结构域)组成的190 aa 的胞外域（ECD），随后是23 aa的跨膜域，最后是221 aa的胞内域，包含能募集下游信号分子的死亡域(DD)。鼠TNFR1与人TNFR1的ECD有70%同源性。TNFR2缺乏DD，不会直接引起程序性细胞凋亡，主要介导局部自稳效应，如细胞存活和组织再生。目前的生物抗RA药物大多阻断或抑制TNF-α，从而阻断TNF-α与TNFR1结合，抑制下游炎症信号产生。但是，由于单一抑制TNF-α也会阻断TNF-α与TNFR2的结合，临床上存在上呼吸道感染及头痛等不良反应。若能单一阻断TNF-α与TNFR1的结合，而不影响TNF-α与TNFR2的相互作用，就能避免这些副作用。因此，特异性抑制TNFR1成为我们RA治疗的新思路和新策略。
适配体 (Aptamer) 是一种经体外筛选技术得到的寡核苷酸序列 (RNA或 DNA)，与相应的配体有严格的识别能力和高度的亲和力，大小一般约6-40 kDa。单链寡核苷酸，特别是RNA的一些二级结构，如发夹、茎环、假节、凸环、G-四聚体等，可使核酸分子形成多种三维结构，成为适配体与靶物质特定区域结合的基础，二者之间的结合主要通过“假碱基对”的堆积作用、氢键作用、静电作用和形状匹配等产生高特异性的结合力。与抗体相比较，适配体对目标分子的灵敏度（~ 10-9 M）和特异性（>3 个数量级的区分度）与之相当，然而适配体的核酸本质决定了其更易于合成、修饰、操作、储备、集成等。适配体具有高特异性、靶分子广、易于体外合成和修饰等优点，已经在基础研究、临床诊断和治疗中显示了广阔的应用前景。
适配体的体外筛选过程称为指数富集配体系统进化技术 (Selective expansionof ligends by exponential enrichment，SELEX)，主要是模拟自然进化人工筛选技术。首先体外化学合成一个随机碱基数为n的单链寡核苷酸文库，该文库则含4n个不同的寡核苷酸序列，常用的寡核苷酸随机序列含30个碱基，库容量高达430 (1018)。随机序列的两端是随后PCR循环时结合引物所必需的固定序列，由于这种随机序列，而决定了库中每条链自然形成的空间构象，即二级结构的多样性，决定了库中潜在地存在能与各种蛋白和低分子靶物质有亲和力的核酸配体。
中国专利文献CN201710178435.9公开了一种青环海蛇蛇毒来源的选择性TNFR1拮抗 肽Hydrostatin-SN10，具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，以及一种基于mPEG2000修饰的选择性TNFR1拮抗肽PEG-SN10，通过mPEG2000的羧基与Hydrostatin-SN10肽链N-端天冬氨酸的游离氨基共价连接实现选择性修饰。同时，该发明提供选择性TNF-R1拮抗 肽Hydrostatin-SN10和PEG-SN10在预防和治疗类风湿性关节炎中的应用。中国专利文献CN201680090346.2公开了一种如序列编号1或序列编号2所示的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)结合RNA适配体及其治疗用途。但该专利文献公开的是识别TNF-α的适配体，对于可以特异结合TNF-α的受体蛋白—人源或鼠源TNFR1的DNA适配体，目前还未见报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种特异结合TNF-R1的适配体及其筛选方法和应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明的第一个目的是，提供一种特异结合TNF-R1的适配体。
一种特异结合TNF-R1的适配体，所述适配体序列如SEQ ID No.1、SEQ ID N o.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7中任一项所示或前述序列截短后的活性序列。
优选的，所述SEQ ID No.1序列截短后的活性序列如SEQ ID No.8或SEQ ID N o.9所示。
优选的，所述SEQ ID N o.2序列截短后的活性序列如SEQ ID No.10所示。
优选的，所述适配体序列中部分或全部碱基的脱氧核糖的2'-位置被甲氧基、氟原子或氨基修饰；适配体序列中部分或全部的磷酸基被修饰为硫代磷酸酯；所述适配体的一端或两端被聚乙二醇（分子量1~50kDa）或胆固醇修饰。
优选的，所述TNF-R1来源于人源或鼠源的TNF-R1蛋白胞外段。
本发明的第二个目的是，提供一种特异结合TNF-R1的适配体的筛选方法，步骤如下：
（1）构建随机DNA文库：DNA文库序列如SEQ ID No.11所示；
（2）筛选靶标的构建：由磁珠分别连接人源与鼠源的TNF-R1蛋白胞外段，并用Tris溶液封闭，作为筛选靶标；
（3）体外筛选：采用指数富集的配基系统进化技术，利用步骤（2）的筛选靶标筛，在体外通过预筛、筛选、洗涤、PCR扩增四步对步骤（1）的随机DNA文库进行筛选，经18轮筛选循环后，进行克隆测序；
（4）DNA结合能力鉴定：对步骤（3）筛选得到的DNA进行斑点杂交实验，筛选到与目标蛋白有结合能力的适配体；
（5）适配体的结合力测定：通过表面等离子体共振法对步骤（4）筛选到的适配体进行结合能力测试；
（6）DNA适配体优化及检测：将经步骤（5）测试得到的适配体序列预测二级结构，并根据二级结构进行合理截短。
优选的，所述步骤（3）中18轮筛选循环中，第1轮体外筛选不经过预筛，从第2轮开始预筛，筛选的混合时间从第1轮的120 min逐步降低，每轮缩短15 min，到第9轮的筛选时间降低到5 min，并保持5 min筛选时间到最后，洗涤次数也随筛选轮数逐渐增加，第1轮到第12轮中，洗涤次数从5次增加到30次，每过两轮洗涤次数增加5次，并在之后的筛选保持每轮30次洗涤。
本发明的第三个目的是，提供一种上述适配体的用途。
上述任一项所述的适配体在制备阻断TNF-α与TNF-R1结合的试剂和/或药物中的应用。
上述任一项所述的适配体在制备由TNF-α与TNF-R1结合介导的疾病的治疗或预防用药物中的应用。
优选的，所述由TNF-α与TNF-R1结合介导的疾病包括类风湿性关节炎。
本发明的第四个目的是，提供一种预防和/或治疗由TNF-α与TNFR1结合介导的疾病的药物。
优选的，所述药物包含如上任一所述的适配体及药学上可接受的载体。
在适用本发明的药剂学组合物中，适用本发明的适配体作为其有效成分能够在对由TNF-α与TNFR1结合介导的疾病呈现出有效的预防治疗效果的前提下，根据所适用的疾病、剂型、给药途径等以适当的任意含量(有效量)包含，通常有效量是在以组合物的整理重量为基准的0.001重量%至20.0重量%范围内进行确定。其中，“有效量”是指当按照医疗专家等的意见在给药期间内将适用本发明的组合物向其适用对象即哺乳动物较佳地向人进行给药时能够呈现出如由TNF-α与TNFR1结合介导的疾病的改善效果等所预期的医疗、药理学效果的适用本发明的组合物中所包含的有效成分的量。如上所述的有效量能够在相关从业人员的一般的能力范围内通过实验进行确定。
“载体”也被称为“赋形剂”的物质包括药剂学中的任何常用赋形剂，并应基于相容性和希望的剂型的释放分布性质来选择。示例性载体物质包括，例如，粘合剂、助悬剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、湿润剂、稀释剂等。“药学上接受的载体”可包括，例如，阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、糊精-麦芽糖复合剂、甘油、硅酸镁、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明筛选得到了七条可以在体外精准、快速、牢固结合TNF-R1的DNA适配体。靶向TNF-R1的DNA适配体是通过一段DNA序列将 中间一部分碱基随机化，构建一个随机DNA文库。然后利用指数富集的配体系统进化技术，筛选得到七条可以特异结合TNF-R1的适配体DNA。在筛选过程中，通过逐步减少结合反应时间，增加洗涤次数，筛选得到灵敏度高，专一性强的DNA。然后对得到的DNA进行二级结构分析和合理截短，找到保持其结合力的最短DNA链。截短后两条DNA链与TNF-R1的结合力（KD）较强。
2、本发明是靶向TNF-R1蛋白的DNA适配体，蛋白结合序列号为SEQ ID No.1与人TNFR1的KD值可以达到100 nmol/L左右，结合序列号为SEQ ID No.2与人TNFR1的KD值可以达到60 nmol/L左右，并且可以很好的区分其他非特异性蛋白或非特异性DNA序列，具有很高的结合能力和特异性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为TNF-α与TNF受体结合机理和下游信号通路。
图2为mfold预测的SEQ ID No.1 (1)和SEQ ID No.2 (2) 的二级结构图和分别经过2次和1次截短，得到SEQ ID No.1 和SEQ ID No.2的最短活性序列。
图3为用7条修饰了5’-FAM的DNA链（序列号分别为：SEQ ID No.5, SEQ ID No.6,SEQ ID No. 7, SEQ ID No.4, SEQ ID No.3, SEQ ID No.9, SEQ ID No.10）与BSA、mTNFR1、hTNFR1做DOT BLOT实验的结果图。
图4为L3通道与不同DNA互作的动力学图（mTNFR1与序列号分别为：SEQ ID No.1，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.2），作为阳性结果。
图5为L4通道与不同DNA互作的动力学图（hTNFR1与序列号分别为：SEQ ID No.1，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.2），作为阳性结果。
图6为连接mTNFR1与hTNFR1的通道与没有结合力的DNA的动力学图像，作为阴性对照。
图7为没有连接蛋白的空白通道信号图，作为阴性对照。
图8为本发明的筛选策略。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例能特异结合TNF-R1的适配体的筛选
1 构建随机DNA文库
由IDT（Integrated DNA Technologies）公司合成全长为76nt，两端各18 碱基作为每轮筛选的引物互补区，中间随机区由40个碱基（用N表示）构成的DNA文库，经过10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）纯化后，用荧光成像仪和割胶仪回收目标序列。
DNA文库序列如SEQ ID No.11所示；
2 筛选靶标的构建
由苏州海狸公司（BEAVER）购买BeaverBeads™ Mag NHS 磁珠，分别连接人源与鼠源的TNF-R1蛋白胞外段，并用Tris溶液封闭，作为筛选靶标。具体步骤如下：
2.1 蛋白溶液配制
取500 pmol TNF-R1胞外段蛋白，用偶联缓冲液稀释到500 μL。
2.2 磁珠清洗
取50 μL BeaverBeads™ Mag NHS磁珠于1.5 mL EP管中，将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液，加1 mL 冰上预冷的1 mM HCl于1.5 mL EP管中，涡旋15s，使磁珠混合均匀，将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。
2.3 偶联
加500 μL蛋白溶液于EP管中，吹打使其混合均匀。置于垂直混合仪上，室温混合1~2h。采用磁性分离架富集磁珠。
2.4 封闭
加1mL 封闭缓冲液于EP管中，吹打均匀，将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。重复4次后加1 mL 封闭缓冲液于EP管中，吹打均匀后将EP管置于垂直混合仪中室温反应2h。
2.5 储存
用磁力架富集磁珠，弃上清液。加1 mL 储存缓冲液于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。重复该操作2次。加入500 μL 储存缓冲液于EP管中，充分混合，4℃保存备用。
将不连接蛋白的磁珠同样用100 mM Tris溶液封闭处理，作为预筛选的靶标。
表1 各缓冲液的配方
Figure DEST_PATH_IMAGE001
3 体外筛选
本发明采用指数富集的配基系统进化技术，在体外分为预筛，筛选，洗涤，PCR扩增等步骤进行。在进行18轮循环后，进行克隆测序。具体步骤如下：
3.1 预筛
将空白磁珠吹打均匀，取100 μL 磁珠于EP管中，将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。加500 μL筛选缓冲液重悬，用磁性分离架富集磁珠，弃上清液，并重复3次。将DNA用筛选缓冲液（1×PBS，5 mM MgCl2）稀释到500 μL，在80℃退火5 min 后常温冷却10 min。将冷却后的DNA溶液与磁珠混合，吹打均匀后置于垂直混合仪上，室温混合30 min。随后用磁性分离架富集磁珠，收集上清液。
3.2筛选
将偶联蛋白的磁珠吹打均匀，取100 μL 磁珠于EP管中，将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。加500 μL筛选缓冲液重悬，用磁性分离架富集磁珠，弃上清液，并重复3次。然后用预筛收集的上清液重悬磁珠，吹打均匀后置于垂直混合仪上，室温混合2 h。
3.3 洗涤
用磁性分离架富集筛选体系的磁珠，弃去上清液。加筛选缓冲液于EP管中，吹打均匀，将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。重复5次。用100 μL 去离子水重悬磁珠。
3.4 PCR扩增
以筛选并洗涤后的磁珠为模板进行PCR，可以将结合磁珠上蛋白的DNA进行富集，得到下一轮筛选的DNA。
使用Takara Premix Taq™ 酶进行PCR反应。
其中，Primer A的序列如SEQ ID No.12所示。
Primer B的序列如SEQ ID No.13所示，其中第15位于第16位碱基之间设有SpacerC9 ，其目的是为了让PCR产物为两条不等长的单链互补形成的双链DNA，这个双链DNA能在变性PAGE胶下分离为2个不同位置的条带，通过切割下方的条带，过夜洗脱和乙醇沉降后即得到纯净的单链DNA。
PCR反应体系：
Figure 407644DEST_PATH_IMAGE002
PCR反应条件：
98℃预变性2 min，98℃变性20 s，44℃退火30 s，72℃延伸30 s，扩增30个循环；最后72℃终延伸5 min。
PCR产物经乙醇沉降去除体系中的盐离子后，用10 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。由于Primer B比Primer A多15个腺嘌呤，PCR产物在琼脂胶上会分为两个条带，其中目的片段的电泳迁移率更高。由此可以用荧光成像仪和割胶仪回收目标序列，作为下一轮筛选的DNA库。
在筛选过程中为得到灵敏度更高，特异性更好的适配体，需要不断的施加筛选压力。第1轮筛选不做预筛，从第2轮开始预筛；筛选时间从第1轮的2 h逐步降低，到第13轮的筛选时间降低到5 min，并保持5 min筛选时间到最后；洗涤次数也随筛选轮数逐渐增加，第1轮到第12轮中，洗涤次数从5次增加到30次，并在之后的筛选保持每轮30次洗涤。
最终在第18轮筛选中，预筛30 min，筛选5 min，洗涤30次后做将洗涤后的磁珠进行PCR并回收纯化，将产物克隆测序。得到多条重复序列，分别对其进行结合力鉴定。
4. DNA结合能力鉴定
对筛选得到的DNA进行斑点杂交实验（DOT BLOT），找到7条与目标蛋白有结合能力的适配体SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
方法如下：在生工生物工程（上海）股份有限公司合成5’端修饰FAM基团的待测DNA序列。
4.1 将待测蛋白（TNFR1与各对照蛋白）用PBS稀释到10 μM，每个蛋白用移液枪取1μL，点样在NC膜上。常温放置1h，将蛋白固定在膜上。
4.2 用含镁离子的PBST（1×PBS，5 mM MgCl2, 0.02% Tween20）做为blot buffer洗膜3次，每次3分钟。洗去膜上未固定的蛋白。
4.3 用blot buffer配5%的BSA封闭液，将NC膜用封闭液在摇床上常温封闭1h。
4.4 将DNA用blot buffer稀释到终浓度为400 nM，80℃退火5 min，移至室温10min，然后弃去膜上的封闭液，将DNA滴在膜上，常温静置孵育1h。
4.5 用blot buffer 洗膜3次，每次5min，然后用Typhoon FLA 9500 荧光扫描成像系统的488 nm FAM通道扫描湿润的NC膜，得到斑点杂交图像。可见的斑点表明DNA与这个蛋白有结合，斑点越显著说明结合能力越强。
将能观察到荧光斑点的DNA链做进一步分析。
5. 适配体的结合力测定
用表面等离子体共振（SPR）法对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2进行结合能力测试。将人源和鼠源的TNF-R1蛋白固定在传感器，用不同浓度的DNA孵育，再用溶液冲洗。通过实时监测10分钟内蛋白捕获与解离的DNA的量，可以定量测量DNA与人、鼠源TNF-R1蛋白胞外段的结合常数（ka）与解离常数（kd），二者的比就是适配体与人源和鼠源蛋白的结合能力KD。
经SPR测定，如图3所示，SEQ ID No.1与人TNF-R1胞外段KD = 71 nM，与鼠TNF-R1胞外段KD = 130 nM；SEQ ID No.2 与人TNF-R1胞外段KD = 52 nM，与鼠TNF-R1胞外段KD =180 nM，图中显示这7条DNA都能与鼠/人 TNFR1蛋白有结合，而与BSA蛋白没有结合。
6. DNA适配体优化及检测
将得到的适配体序列用mfold在线软件预测二级结构，并根据二级结构进行合理截短。如图2.使用斑点杂交实验（dot blot）验证截短链与目标蛋白的结合能力，并与其他未截短的DNA进行对比，如图3。
其中图2中，SEQ ID No.1的预测二级结构有2个发夹结构。通过2次截短，分别截去SEQ ID No.1的3’引物区、5’引物区。经SPR测定，截短后的SEQ ID No.1与人TNF-R1胞外段结合力KD由71 nM分别降为106 nM和325 nM，与鼠TNF-R1胞外段结合力KD由130nM分别降为266 nM和343 nM，降低的结合力保持在同一数量级。而在此基础上再向5’端截短3个碱基，截短后的SEQ ID No.1与TNF-R1胞外段的KD降低1个数量级。说明两次截短的SEQ ID No.1就是保持其活性的最短序列。
SEQ ID No.2的预测二级结构同样有2个发夹结构，与人、鼠TNF-R1的KD分别为52和180 nM。第一次截短选择截去SEQ ID No.2的两端引物区，截短后的SEQ ID No.2与目标蛋白的结合力变化很小，与人、鼠TNF-R1的KD分别变为60和200 nM。第二次选择将剩下的两个发夹结构分开，分别测定两个发夹结构与目标蛋白的结合力。5’端发夹结构显示与人和鼠TNF-R1胞外段均不结合，而3’端发夹结构与人TNF-R1胞外段结合力KD降低了10倍。因此SEQ ID No.2的结合活性是由两个发夹结构共同提供的，第一次去掉两端引物区的SEQ IDNo.2就是最短活性结构。
用SPR法定量测定各截短链与TNF-R1蛋白胞外段的结合力，如图4-7。
其中图4是L3通道与不同DNA互作的动力学图（mTNFR1与各DNA），作为阳性结果。图5是L4通道与不同DNA互作的动力学图（hTNFR1与各DNA），作为阳性结果。图6是连接mTNFR1与hTNFR1的通道与没有结合力的DNA的动力学图像，作为阴性对照。图7是没有连接蛋白的空白通道信号图，作为阴性对照。
结合图8说明筛选策略采用正向和负向筛选相结合的方式：首先通过两次负向筛选，将可以结合磁珠和可以结合TNF-R2的DNA序列丢弃。然后通过不断增加筛选压力的正向筛选，筛选出对TNF-R1有结合并结合力较强的DNA序列。最后通过PCR扩增和回收，将产物投入下一轮筛选，通过18轮的筛选后将PCR产物测序并检测结合能力。
此外，由于核酸适配体在体内易被核酸酶降解、被肾脏快速过滤等特点限制了其在临床上的使用，因此，通过制定不同的修饰方法对适配体进行改造，来提高其治疗和诊断效率。常用的化学修饰包括两大类：对核糖2'位的化学修饰，以及对核苷酸磷酸骨架的修饰。在（脱氧）核糖单位的2'-位置修饰，包括用氟原子（2'-F）、甲氧基（2'-OMe）、氨基（2'-NH2）等，在核苷酸磷酸骨架进行修饰，主要是使用硫原子对磷酸酯单元中氧原子进行取代，可以显着提高适配体对核酸酶降解的抗性及延长在血清中的稳定性。然而，由于核酸适配体体积较小，很容易被肾脏过滤消除，上述的修饰方法不足以减轻适配体易被肾脏清除的缺陷。
因此，可以将适配体与大分子结合来延长其在体内的循环时间。例如，PEG是一种两亲性无毒聚合物，在适配体的3'或5'末端引入高分子量PEG单元（1-50kDa）可显著增加在体内的循环时间。胆固醇可以通过与血浆脂蛋白结合来增加其在血浆中的半衰期，并可以通过受体介导的内吞作用来增加细胞的摄取效率，在适配体末端引入胆固醇可以提高在体内的生物利用度。
本筛选的策略具有几个优势。首先，通过加入两层负向筛选，最终筛选得到的产物理论上对空白磁珠和TNF-R2应该没有结合力。其次，通过每轮增加的筛选压力（如增加正向筛选时洗涤次数、减少正向筛选的结合时间等），结合力较弱的适配体会在较大的筛选压力下丢失，因此筛选得到的TNF-R1适配体的结合力较强，在制备预防和/或治疗由TNF-α与TNFR1结合介导的疾病的药物时具有更强的特异性和可控性。再者，筛选时间较短，每轮筛选大约只需要1天。这个策略的缺点有以下几点：第一，由于筛选过程没有标示物，筛选成功与否完全依赖于筛选结束并测序后对序列的测试结果。因此在筛选结束前我们无法得知具体的DNA富集情况。第二，对非特异蛋白和磁珠的负筛效果可能受实验操作手法的影响，震动和枪头带起的磁珠可能将本应被丢弃的非特异结合DNA被带入到正筛体系中去，从而影响最终富集到的DNA的特异性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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Claims (10)

1.一种特异结合TNF-R1的适配体，其特征在于：所述适配体序列如SEQ ID No.1、SEQID N o.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7中任一项所示或前述序列截短后的活性序列。
2.根据权利要求1所述的特异结合TNF-R1的适配体，其特征在于：所述SEQ ID No.1序列截短后的活性序列如SEQ ID No.8或SEQ ID No.9所示。
3.根据权利要求1所述的特异结合TNF-R1的适配体，其特征在于：所述SEQ ID No.2序列截短后的活性序列如SEQ ID No.10所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的特异结合TNF-R1的适配体，其特征在于：所述适配体序列中部分或全部碱基的脱氧核糖的2'-位置被甲氧基、氟原子或氨基修饰；适配体序列中部分或全部的磷酸基被修饰为硫代磷酸酯；所述适配体的一端或两端被聚乙二醇或胆固醇修饰。
5.根据权利要求4所述的特异结合TNF-R1的适配体，其特征在于：所述TNF-R1来源于人源或鼠源的TNF-R1蛋白胞外段。
6.权利要求5所述的适配体的筛选方法，其特征在于，步骤如下：
（1）构建随机DNA文库：DNA文库序列如SEQ ID No.11所示；
（2）筛选靶标的构建：由磁珠分别连接人源与鼠源的TNF-R1蛋白胞外段，并用Tris溶液封闭，作为筛选靶标；
（3）体外筛选：采用指数富集的配基系统进化技术，利用步骤（2）的筛选靶标筛，在体外通过预筛、筛选、洗涤、PCR扩增四步对步骤（1）的随机DNA文库进行筛选，经18轮筛选循环后，进行克隆测序；
（4）DNA结合能力鉴定：对步骤（3）筛选得到的DNA进行斑点杂交实验，筛选到与目标蛋白有结合能力的适配体；
（5）适配体的结合力测定：通过表面等离子体共振法对步骤（4）筛选到的适配体进行结合能力测试；
（6）DNA适配体优化及检测：将经步骤（5）测试得到的适配体序列预测二级结构，并根据二级结构进行合理截短。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤（3）中18轮筛选循环中，第1轮体外筛选不经过预筛，从第2轮开始预筛，筛选的混合时间从第1轮的120 min逐步降低，每轮缩短15 min，到第9轮的筛选时间降低到5 min，并保持5 min筛选时间到最后，洗涤次数也随筛选轮数逐渐增加，第1轮到第12轮中，洗涤次数从5次增加到30次，每过两轮洗涤次数增加5次，并在之后的筛选保持每轮30次洗涤。
8.权利要求4所述的适配体在制备阻断TNF-α与TNF-R1结合的试剂和/或药物、制备由TNF-α与TNF-R1结合介导的疾病的治疗或预防用药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述由TNF-α与TNF-R1结合介导的疾病包括类风湿性关节炎。
10.一种预防和或治疗由TNF-α与TNF-R1结合介导的疾病的药物，其特征在于：所述药物包括权利要求5所述的适配体及药学上可接受的载体。
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