CN108926720A - Tnfr1基因及其编码蛋白的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了TNFR1基因、所编码的蛋白质和TNFR1特异性拮抗剂在制备和筛选治疗自身免疫性或炎症性疾病的药物中的应用。本发明首次提出了TNFR1拮抗剂可用于治疗自身免疫性疾病；TNFα作为一种多向功能细胞因子，其受体TNFR1广泛表达于全身细胞，主要促进炎症细胞的分化、增殖及抗凋亡等作用，从而介导炎症反应，本发明所提出的TNFR1拮抗剂能有效治疗自身免疫性或炎症性疾病，如多发性硬化，类风湿关节炎等；TNFR1拮抗剂能够靶向作用于TNFR1，阻断TNFR1信号的免疫调节功能，避免了完全阻断TNFα信号所带来的严重副作用，降低了用药剂量。

Description

TNFR1基因及其编码蛋白的应用
技术领域
本发明涉及自身免疫性疾病治疗技术领域，尤其是TNFR1基因及其编码蛋白的应用；更具体地，本发明涉及TNFR1拮抗剂，其通过作用于T细胞表面TNFR1，抑制炎症T细胞的分化从而治疗自身免疫性疾病。
背景技术
众所周知，肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)α是一种非常重要的前炎症因子，参与激活并促进免疫反应以清除病原体。
与TNFR1(重组人1型肿瘤坏死因子受体)结合的TNFα激活两种不同的复杂的信号通路：1)维持细胞存活和促进炎症细胞因子的表达；2)促进细胞凋亡和坏死。TNFα与TNFR1结合，胞内结构域与相关蛋白结合，形成信号传导复合物Ⅰ。信号传导复合物Ⅰ可以激活NF-κB，MAPK3，AP-1等重要炎症信号传导蛋白。信号传导复合物I是暂时形成的，会很快从TNFR1上解离，与介导Fas相关的死亡结构域蛋白(FADD)结合形成信号传导复合物II，以激活凋亡的下游传导信号。
调节性T细胞(Tregs)作为经典的抑制性T细胞亚群，在维持自身免疫耐受的稳态和预防自身免疫方面起关键作用。如果Tregs的数量不足或者功能受损，就会导致炎症性T细胞持续性过度激活，从而导致自身免疫疾病的发生。近年来，越来越多的研究发现TNFR2在Tregs表面高表达，且TNFα能够增强Tregs的稳定性和功能。TNFR2+Tregs的抑制功能显著优于TNFR2-Tregs。
而针对于TNFα所介导的炎症反应而出现的TNFα总抑制剂，虽然在某些自身免疫病中起到了一定的作用，然而，有一些患者对其没有反应，甚至长期服用出现严重的副作用，这可能是因为TNFα总抑制剂在阻断了TNFR1介导的炎症信号的同时，阻断了TNFR2信号介导的免疫调节作用。由于TNFR1和TNFR2的胞内段没有相同的信号通路，两者传导激活不同的细胞活动。而TNFR1和TNFR2对炎症T细胞和调节性T细胞的具体作用尚不清楚。因此，TNFR1和TNFR2对炎症T细胞和调节性T细胞的作用还有待进一步研究。
发明内容
基于上述问题，本申请的发明人在研究过程中，设计了大量的试验以研究TNFR1和TNFR2对炎症T细胞和调节性T细胞的具体作用，意外地发现TNFR1基因缺陷使Th1和Th17细胞的分化明显受损，而不影响Tregs的分化，基于此发现，本申请提出了特异性TNFR1拮抗剂的应用。具体地，本发明提出的技术方案包括以下几个方面：
在第一个方面，本发明提出了TNFR1基因在制备和筛选治疗自身免疫性或炎症性疾病的药物中的应用。根据本发明的实施例，TNFR1基因缺陷能够抑制Th1和Th17细胞的分化，但不影响Tregs的分化、扩增和抑制功能，从而抑制了自身免疫病的发生。
在第二个方面，本发明提出了TNFR1基因所编码的蛋白质在制备和筛选治疗自身免疫性或炎症性疾病的药物中的应用。
在第三个方面，本发明提出了TNFR1特异性拮抗剂在制备治疗自身免疫性或炎症性疾病的药物中的应用。根据本发明的实施例，上述TNFR1拮抗剂还可以进一步具有如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，本发明提出了特异性TNFR1拮抗剂能够抑制Th1和Th17细胞的体外分化，TNFα并不影响WT的naive CD4+T细胞向Th1和Th17细胞的体外分化，但是TNFR1基因敲除后naive CD4+T细胞向Th1和Th17细胞体外分化的能力明显受损，但并不影响iTregs的分化；
本发明提出了特异性TNFR1拮抗剂不影响Tregs的分化、扩增和抑制功能。发明人发现TNFR1基因敲除不影响Tregs的体内体外分化、扩增和抑制功能，尤其是在机体发生过度自身免疫反应时。因此，特异性TNFR1拮抗剂在不影响Tregs的前提下，能够特异性抑制Th1和Th17细胞的分化，从而抑制了过度免疫的发生，从而起到治疗自身免疫性疾病的作用；
特异性TNFR1拮抗剂能够维持Tregs的数目和抑制功能，在发生自身免疫时，使得Tregs发挥正常的免疫抑制能力，起到治疗自身免疫性疾病的作用。
优选地，所述自身免疫性疾病为多发性硬化、类风湿关节炎、脑脊髓炎或结肠炎。根据本发明的实施例，TNFR1基因敲除的小鼠能够对抗自身免疫病如EAE(实验性变态反应性脑脊髓炎)的发生，延缓起病时间，改善疾病症状，减少Th1和Th17细胞的比例；TNFR1基因敲除小鼠的Tregs扩增能力和免疫抑制能力正常，而TNFR2基因敲除小鼠的Tregs扩增能力和免疫抑制能力则明显下降。
在第四个方面，本发明提出了一种用于治疗自身免疫性或炎症性疾病的药物，所述药物含有TNFR1特异性拮抗剂。
优选地，所述药物中含有能使TNFR1基因低表达的试剂。例如，可以采用TNFR1的RNA干扰试剂以沉默TNFR1的表达，或者采用能敲低TNFR1的表达的试剂，以使得TNFR1基因的表达量低于正常水平，从而治疗或缓解自身免疫性或炎症性疾病。
优选地，所述药物中含有能降低TNFR1基因所编码的蛋白活性的试剂。更优选地，药物中含有能特异性降低TNFR1基因所编码的蛋白活性的试剂，以免影响有机体内其它功能蛋白的活性。
优选地，所述自身免疫性疾病为多发性硬化、类风湿关节炎、脑脊髓炎或结肠炎。
在第五个方面，本发明提出了一种调节性T细胞表面的分子标志物，所述分子标志物为TNFR1和TNFR2，在正常人的调节性T细胞表面，TNFR2的表达水平高于TNFR1；而在自身免疫性疾病患者的调节性T细胞表面，所述TNFR2的表达水平下降，而TNFR1的表达水平上升。
本申请的发明人还发现Tregs表面低表达TNFR1而高表达TNFR2。TNFR1基因敲除后，Tregs表面TNFR2表达水平升高，TNFR2基因敲除后Tregs表面TNFR1表达水平升高；而且发明人还发现，与健康对照相比，在类风湿关节炎和多发性硬化患者的外周血中提取的Tregs表面，TNFR1表达水平升高，而TNFR2表达水平下降。因此，本申请进一步提出了TNFR1和TNFR2在Tregs表面的表达水平随着免疫微环境的变化而改变，两者存在功能上的重叠和代偿；非炎症环境下，TNFR1和TNFR2受体完整，可能两个受体的信号维持稳态平衡；炎症微环境下，Tregs表面能的TNFR1表达水平升高，这可能使Tregs趋向于凋亡，或向炎症细胞分化；而TNFR2表达水平下降，其稳定性、增殖能力及功能均可能受损。同时，本发明实施例提出的特异性TNFR1拮抗剂避免了TNFα完全性抑制剂导致的全身毒性和其他严重副作用。
优选地，所述自身免疫性疾病为多发性硬化或类风湿关节炎。
综上所述，本发明的有益效果为：
本发明首次提出了TNFR1拮抗剂可用于治疗自身免疫性疾病；TNFα作为一种多向功能细胞因子，其受体TNFR1广泛表达于全身细胞，主要促进炎症细胞的分化、增殖及抗凋亡等作用，从而介导炎症反应，本发明所提出的TNFR1拮抗剂能有效治疗自身免疫性或炎症性疾病，如多发性硬化，类风湿关节炎等；TNFR1拮抗剂能够靶向作用于TNFR1，阻断TNFR1信号的免疫调节功能，避免了完全阻断TNFα信号所带来的严重副作用，降低了用药剂量。
附图说明
图1是WT小鼠的naive CD4+T细胞在体外诱导分化为Th1和Th17细胞的结果图；
其中，a和b显示了TNFα对Th1细胞体外分化的结果；
c和d显示了TNFα对Th17细胞体外分化的结果；
e和f显示了TNFR1或者TNFR2基因敲除对Th1细胞体外分化影响的结果；
g和h显示了TNFR1或者TNFR2基因敲除对Th17细胞体外分化影响的结果。
图2是TNFR1或者TNFR2基因敲除对naive CD4+T细胞在体外诱导分化为Treg细胞影响的结果图；
图3是用TNFR1-/-和TNFR2-/-的小鼠提取naive CD4+T细胞在Rag1-/-小鼠上造肠炎模型的结果图；
其中，a显示了造模之后各组受体小鼠的体重变化；
b和c显示了造模之后各组受体小鼠的结肠病理变化；
d显示了造模之后各组受体小鼠的脾脏、肠系膜淋巴结和肠道的直观表现；
图4是图3的肠炎模型各组的脾脏、肠系膜淋巴结和肠道固有层IFNγ+和IL-17A+细胞在CD4+细胞中比例图；
图5是图3的肠炎模型在造模后第21天和第28天，各组的肠道固有层Foxp3+T细胞在CD4+T细胞中比例图；。
图6是对WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-小鼠进行EAE模型的造模的结果图；
其中，a显示了造模之后各组小鼠的疾病症状评分变化；
b显示了造模之后，各组小鼠大脑和脊髓的病理变化；
c～f显示了造模之后各组小鼠大脑的CD4+T细胞中Tregs、Th1和Th17细胞的比例；
g～j显示了造模之后各组小鼠脊髓的CD4+T细胞中Tregs、Th1和Th17细胞的比例；
图7是TNFR1和TNFR2对Tregs的体内和体外扩增的影响的结果图；
其中，a～d显示了未接受任何免疫原刺激的WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-小鼠的脾脏和淋巴结中，在CD4+T细胞中Tregs分别所占的比例；
e～h显示了在接受了MOG+PTX刺激30天的WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-小鼠的脾脏和淋巴结中，在CD4+T细胞中Tregs分别所占的比例；
i～k显示了WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-小鼠的淋巴结中提取出Tregs，进行体外扩增后，各组Tregs细胞表面Ki-67表达水平，各组细胞总数和Foxp3+细胞绝对数；
图8是TNFR1和TNFR2对iTregs体外功能的影响的结果图；其中，a、b显示了将WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-小鼠的naive CD4+T细胞诱导为iTregs后，iTregs在体外对CD8+T细胞的抑制能力；
图9是WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-小鼠来源的iTregs对EAE模型治疗的结果图；
其中，a显示了各组小鼠的疾病症状评分变化；
b显示了各组小鼠大脑和脊髓的病理变化；
c，d，e显示了各组小鼠大脑的CD4+T细胞中Th1和Th17细胞的比例；
f，g，h显示了各组小鼠脊髓的CD4+T细胞中Th1和Th17细胞的比例。
图10显示了WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-小鼠来源的naive CD4+T细胞和iTregs的TNFR1和TNFR2的表达水平；
图11显示了多发性硬化患者和类风湿关节炎患者的Tregs的TNFR1和TNFR2的表达水平。
具体实施方式
TNFR1作为T细胞的一种广泛的表面标志物，主要介导炎症反应。本申请的发明人首次发现TNFR1拮抗剂具有治疗自身免疫性或炎症性疾病的效果，包括特异性识别TNFR1，阻断TNFR1信号介导的炎症反应；TNFR1拮抗剂作为治疗自身免疫性疾病时，TNFR1信号介导炎症反应，TNFR2信号介导免疫调节作用，基于上述结果，TNFR1拮抗剂特异性阻断TNFR1信号，抑制炎症T细胞的分化。TNFR1拮抗剂特异性拮抗TNFR1信号介导的促炎作用，尤其是促进了炎症T细胞Th1和Th17细胞的分化，达到抑制过度免疫反应的目的，从而可以用来治疗自身免疫性疾病。
在自身免疫性疾病中，TNFR1拮抗剂、能够选择性阻断TNFR1信号介导的炎症反应，而不像TNFα完全性抑制剂，在抑制TNFR1信号介导的炎症作用的同时，也阻断了TNFR2信号的免疫调节作用，因此会带来严重的副作用；本申请中的特异性TNFR1阻断剂仅阻断TNFR1信号，保留了TNFR2的完整性，减少了药物毒性。进一步地，所述拮抗剂包括特异性识别TNFR1的信号。
本申请的发明人通过大量的研究实验发现，TNFR1介导炎症细胞如Th1和Th17细胞的分化和激活；而TNFR1基因敲除后并不影响Tregs的分化、增殖和抑制功能，而且正常状态下，Tregs表面表达高水平的TNFR2和低水平的TNFR1。但是，在多发性硬化和类风湿关节炎患者的外周血中，Tregs表面的TNFR2表达水平下降，而TNFR1表达水平升高。鉴于TNFα两个不同受体介导不同的信号通路，因此，特异性TNFR1拮抗剂能够靶向抑制免疫反应，而保留了TNFR2信号介导的促进Tregs的分化、增殖和抑制功能，避免了TNFα完全抑制剂带来的全身副作用，同时减少用药剂量，成为未来治疗自身免疫病新的方法。具体地，基于发明人对TNFR1在Th1和Th17细胞的分化中所起的关键作用，对Tregs的分化、增殖和抑制功能无影响。而在自身免疫疾病患者中，Tregs表面的TNFR1的表达水平升高，本发明提出了用特异性TNFR1拮抗剂能够治疗自身免疫病新的方法。
另外，特异性识别TNFR1的试剂的类型不受特别限制，只要能够特异性识别细胞表面的TNFR1即可。根据本发明的实施例可以采用的特异性识别TNFR1的试剂包括但不限于特异性识别TNFR1蛋白的抗体、特异性识别TNFR1mRNA的探针的至少之一。特异性识别TNFR1蛋白的抗体可针对TNFR1抗原特异性位点进行设计和制备，进而通过抗原抗体的特异性结合达到特异性激活细胞表面的TNFR1。本发明实施例提出的特异性靶向治疗自身免疫性疾病的方法，既特异性阻断TNFR1，其在治疗自身免疫性疾病方面的都能降低用药剂量，减轻总TNF抑制剂对机体造成的严重副作用。
根据本发明的具体实施例，发明人是探讨TNFα对于Th1和Th17细胞的分化的影响的时候，发现TNFα不影响WT naive CD4+T细胞向Th1和Th17细胞的分化。但是，TNFR1基因敲除后诱导为Th1和Th17细胞的能力受损，但不影响Tregs的分化、增殖和抑制功能。而且，TNFR1-/-iTregs表面的TNFR2表达水平升高，TNFR2-/-iTregs表面的TNFR1表达水平升高。而在自身免疫性疾病多发性硬化和类风湿关节炎患者的外周血中，发明人在实验中发现Tregs表面的TNFR2表达水平显著下降，而TNFR1表达水平升高。从而，发明人得出特异性阻断TNFR1具有治疗自身免疫性疾病的潜能。
下面将对TNFα、TNFR1和TNFR2对Th1和Th17细胞的分化的影响进行详细描述：
根据本发明的实施例，本发明实施例提取的WT naive CD4+T细胞诱导分化成Th1和Th17细胞，培养基中加或不加rmTNFα。3天后，流式细胞仪检测IFNγ和IL-17A的表达水平。发明人发现TNFα的刺激并不能增强WT naive CD4+T细胞向Th1和Th17细胞的体外分化水平。发明人还对来自WT、TNFR1-/-小鼠和TNFR2-/-小鼠的naive CD4+T细胞进行了Th1和Th17分化的诱导，流式细胞仪分析比较各组IFNγ和IL-17A的表达水平。发明人发现TNFR1基因敲除使IFNγ+细胞和IL-17A+细胞比例降低。而TNFR2-/-CD4+T细胞的分化不受影响。
根据本发明的实施例，本发明实施例提取的WT、TNFR1-/-、TNFR2-/-小鼠的naiveCD4+T细胞用包被有CD3/CD28的磁珠、IL-2和TGF-β在体外诱导为iTregs。发明人发现TNFR1-/-naive CD4+T细胞能够成功分化成iTregs。此外，rmTNFα可以促进WT和TNFR1-/-naive CD4+T细胞向iTregs方向分化。由此TNFR1及其下游信号传导通路不影响iTregs的体外分化。
根据本发明的实施例，本发明实施例通过将naive CD4+T细胞腹腔注射打入Rag1-/-小鼠体内，诱导肠炎模型，同时可以观察naive CD4+T细胞在受体小鼠体内的分化情况。将WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-小鼠的naive CD4+T细胞分别打入Rag1-/-小鼠体内，通过观察体重变化、肠壁病理表现和流式细胞仪分析Foxp3、IFNγ和IL-17A的表达水平来判断naiveCD4+T细胞的分化情况。发明人发现WT组的Rag1-/-小鼠体重逐渐减轻。H&E染色显示结肠肠壁有严重的炎性细胞浸润，溃疡，肠壁水肿增厚。TNFR1-/-组受体小鼠体重能缓步上升，肠道无明显水肿，散在分布成型粪便，病理显示有较为完整的肠壁结构，很少淋巴细胞浸润。TNFR2-/-组受体小鼠体重下降最多，而且整段肠壁严重水肿和缺乏成型的粪便，脾脏和mLNs肿大最明显，炎性细胞浸润最多，结构紊乱。在造模后第28天处死小鼠。用流式细胞仪检测各个器官中CD4+细胞里Foxp3+，IL-17+或IFNγ+T细胞的比例。发明人发现在脾脏、mLNs和肠道固有层中，WT和TNFR2-/-的供体细胞分化为Th17细胞均显着增加，TNFR2-/-组Th17细胞分化最为显著，而TNFR1-/-naive CD4+T细胞却能抵抗向Th17细胞方向分化。同时，发明人还发现在肠道固有层中，WT和TNFR1-/-小鼠的细胞分化为Foxp3+T细胞的比例无差异，而TNFR2-/-小鼠的细胞分化成Treg细胞的比例最低。并且随着疾病的进展，该现象持续存在。
根据本发明的实施例，发明人选择实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型，选取同为雌性、8周龄的WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-小鼠，进行EAE模型的诱导。观察小鼠的临床评分。处死小鼠后，观察大脑和脊髓的病理变化，流式细胞仪分析大脑和脊髓的CD4+T细胞中Foxp3+、IFNγ+或者IL-17A+细胞的比例。发明人发现，TNFR1-/-小鼠能够完全抵抗自身免疫性炎症反应，没有任何EAE症状，H&E染色结果显示脑和脊髓几乎观察不到炎性细胞，Th1和Th17细胞在CD4+T细胞中的比例最低。而TNFR2基因敲除是疾病起病时间提前，病情最严重，H&E染色结果显示大脑和脊髓中炎性单核细胞浸润最严重，Th1和Th17细胞在CD4+T细胞中的比例最高。
根据本发明的实施例，为了明确TNFR1基因敲除是否会损伤Treg细胞扩增能力，发明人评估了WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-小鼠在未诱导EAE模型之前Foxp3+细胞在CD4+T细胞中的基础比例。然后给予三种小鼠，用MOG+PTX免疫30天后，处死小鼠，流式细胞仪检测在脾脏和淋巴结中Foxp3+细胞在CD4+T细胞中的比例，并与为免疫之前进行对比。发明人还从WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-小鼠淋巴结中提取了Treg细胞，用包被CD3/CD28的磁珠(细胞：beads＝1:1)，rhIL-2(300U/ml)培养3天。通过流式细胞仪检测Ki-67表达水平和各组细胞总数及Foxp3+细胞的绝对数。发明人发现在脾脏和LN中TNFR1-/-小鼠的Tregs与WT组无差异，而TNFR2-/-小鼠的Tregs比例略低于WT和TNFR1-/-小鼠。然而，用MOG免疫30天后，在脾脏和淋巴结中，WT和TNFR1-/-小鼠中的Tregs增加2～4倍，而在TNFR2-/-小鼠中Tregs细胞几乎没有增加。体外扩增实验通过流式细胞仪检测Ki-67表达水平。我们发现TNFR1-/-Tregs的Ki-67水平与WT组无差异，TNFR2-/-Tregs的Ki-67水平最低而细胞状态最差，存活的细胞数目最少。
根据本发明的实施例，为了进一步明确TNFR1和TNFR2对iTregs体外抑制功能的作用。发明人从WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-小鼠脾脏中提取naive CD4+T细胞，诱导为iTregs，相同条件下进行了体外抑制实验，然后用CFSE标记法观察CD8+T细胞增殖情况。发明人发现72小时孵育后，TNFR1-/-iTregs与WTiTregs相比抑制功能无明显差异。TNFR2-/-iTregs与WTiTregs相比抑制功能显著下降。
根据本发明的实施例，为了明确TNFR1和TNFR2在iTregs的体内抑制能力的作用，发明人将WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-小鼠的naive CD4+T细胞诱导为iTregs，观察其对EAE小鼠模型的治疗效果。发明人发现WT iTregs能够成功地抑制EAE病情，延迟EAE起病时间发作，改善症状，TNFR1-/-iTregs抑制功能较WT iTregs稍强，大大减少了脊髓和脑中的自身免疫反应，Th17细胞和Th1细胞的增殖被抑制，病理结果显示有很少的单核细胞浸润。然而，TNFR2基因的敲除损伤了iTregs的抑制功能，不能改善EAE病情，FACS在脊髓和脑中检测到Th17+细胞显着增加，病理切片也可看到在脑和脊髓中有大量炎症细胞累积。
另外，本发明实施例中Tregs表面TNFR1和TNFR2的表达水平具有以下特征：
根据本发明的实施例，发明人检测了TNFR1和TNFR2在WT、TNFR1-/-、TNFR2-/-iTregs上的表达水平。发明人发现这三种naive CD4+T细胞均表达低水平的TNFR1和TNFR2。与naive CD4+T细胞相比，在诱导成为iTregs后，TNFR1的表达水平变化不明显，而TNFR2的表达水平升高。而且，在TNFR1-/-iTregs表面上，TNFR2表达水平更高，而TNFR2-/-iTregs的TNFR1的表达水平升高。
根据本发明的实施例，为了明确在多发性硬化患者和类风湿关节炎患者的CD4+Tregs的TNFR1和TNFR2水平与健康人相比是否有所不同。发明人收集健康人和MS患者的外周血，分离出外周血单核细胞。流式细胞仪检测Tregs上TNFR1和TNFR2的表达。发明人发现健康人的Foxp3+T细胞表达低水平的TNFR1和高水平的TNFR2。而在多发性硬化患者和类风湿关节炎患者的Tregs表面，TNFR1水平显着升高，TNFR2水平下降超过一半。这进一步证实了TNFR1对于引发或促进自身免疫性疾病中的炎症前反应是必需的；而TNFR2可能被Tregs以sTNFR2形式脱落以中和过量的TNFα，而Tregs表面的TNFR2水平显著下降。但是TNFR2水平低的Tregs不能够有效地增殖和抑制Teffs。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 从小鼠脾脏提取naive CD4+T细胞
采用autoMACS仪磁珠分选的方法提取naive CD4+T细胞。先将小鼠的脾脏细胞用尼龙毛柱进行T细胞富集，然后加入biotin小鼠anti-CD8抗体6ul，biotin小鼠anti-B220抗体8ul，biotin小鼠anti-CD11b抗体1.5ul，biotin小鼠anti-CD11c抗体1.5ul，biotin小鼠anti-CD49b 1ul，混匀，4℃孵育20分钟。再加入anti-biotinbeads 8ul，混匀，4度孵育15分钟。autoMACS仪进行第一步阴选，去除非CD4+细胞。加入小鼠CD62L-beads 8ul，4度孵育15分钟。autoMACS仪进行第二步阳选。阳选管既为naive CD4+T细胞。流式细胞仪检测naiveCD4+T细胞纯度(>90％)。
实施例2 naive CD4+T细胞体外诱导为Th1和Th17细胞
将提取的WT naive CD4+T细胞种在96孔板中，培养体系中加入CD3(1ug/ml)，CD28(1ug/ml)和抗IL-4单克隆抗体(5μg/ml),加或不加rmTNFα。对于Th1细胞分化，再加入rmIL-12(10ng/ml，R&D Systems)；对于Th17细胞，再加入rmIL-6(10ng/ml)和rhTGF-β(2ng/ml),抗IFN-γ(5μg/ml),将naive CD4+T细胞在上述体系中培养三天。收集细胞并使用流式细胞仪检测IL-17A+，IFNγ+的表达。
结果如图1a～d所示，TNFα的刺激并不能增强WT naive CD4+T细胞向Th1和Th17细胞的体外分化水平。
将从WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-小鼠提取的naive CD4+T细胞种在96孔板或者48孔板中，培养体系中加入CD3(1ug/ml)，CD28(1ug/ml)和抗IL-4单克隆抗体(5μg/ml)。对于Th1细胞分化，再加入rmIL-12(10ng/ml，R&D Systems)；对于Th17细胞，再加入rmIL-6(10ng/ml)和rhTGF-β(2ng/ml),抗IFN-γ(5μg/ml),将naive CD4+T细胞在上述体系中培养三天。收集细胞并使用流式细胞仪检测IL-17A+，IFNγ+的表达。TNFR1基因敲除使IFNγ+细胞和IL-17A+细胞比例降低。而TNFR2-/-CD4+T细胞不受影响，结果如图1e～h所示。
实施例3 将naive CD4+T细胞体外诱导为iTregs
将从WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-小鼠提取的naive CD4+T细胞种在96孔板或者96孔板中，培养体系中加入抗CD3/CD28包被的beads(5个细胞对应一个珠子)，rhIL-2(50U/ml)和rhTGF-β(2ng/ml)，同时加或不加rmTNFα(100ng/ml)。同一时间点收集细胞，通过流式细胞术测定Foxp3表达。
结果如图2所示，TNFR1-/-naive CD4+T细胞能够成功分化成iTregs，而当失去TNFR2基因时，naive CD4+T细胞分化为iTregs的比例明显下降。此外，rmTNFα不能促进WT和TNFR1-/-naive CD4+T细胞向iTregs分化，对TNFR2-/-细胞无作用。
实施例4 naive CD4+T细胞诱导Rag1-/-小鼠为结肠炎模型
选取同周龄的健康Rag1-/-小鼠，随机分3组。提取WT、TNFR1-/-或TNFR2-/-小鼠的naive CD4+T细胞，调整细胞浓度为3million/ml，腹腔注射给Rag1-/-小鼠，每只小鼠0.6million(200ul)。每天记录每只小鼠的体重。在注射细胞后的第三周和第四周，处死小鼠，取出每只小鼠的1mm结肠在10％缓冲的福尔马林固定，石蜡包埋，封闭，切片，H&E染色。从受体小鼠收集来自脾，mLNs和cLP的单核细胞，进行计数和荧光染色。通过流式细胞仪确定Foxp3+，IL-17A+或IFNγ+细胞在CD4+T细胞中的比例。
结果如图3～5所示，TNFR1-/-组受体小鼠体重能缓步上升，结肠炎病理表现最轻，脾脏和mLNs无明显肿大，炎性细胞浸润最少，无溃疡和肠壁增厚，组织结构较为完整，Th17细胞比例最低而Tregs细胞比例与WT组无差异。而TNFR2-/-组受体小鼠体重下降最严重最快，脾脏和mLNs肿大最明显，炎性细胞浸润最多，多发溃疡，肠壁增厚最明显，结构组织紊乱，Th17细胞比例最高而Tregs细胞比例最低。
实施例5 以WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-小鼠为受试对象诱导EAE模型
实验方法：选取同为8周龄的健康雌性WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-小鼠作为受试对象。对于每只小鼠，在不完全弗氏佐剂150ul中加1.2mg灭活的结核杆菌干粉制成含结核杆菌素8mg/ml的完全弗氏佐剂150ul，将其与MOG(2mg/ml)150ul在三通管中进行乳化。取百日咳毒素用无血清无菌PBS稀释至1.25ug/ml。
在小鼠背部三个位点进行皮下注射，每个位点100ul，PTX腹腔注射200ul(250ng/小鼠)。第二天每只小鼠腹腔注射250ng百日咳毒素。第七天重复第一天操作，皮下注射300ug MOG，腹腔注射250ng PTX。第九天重复第二天操作。
第一次免疫之后第5天开始，每天记录临床评分，每个组每天计算平均分数。EAE评分为0，1，2，3，4，5级。
实验结果：结果如图6所示，TNFR1-/-小鼠能够完全抵抗EAE疾病的发生，而TNFR2基因敲除是疾病起病时间提前，病情最严重。
实施例6 Tregs体外扩增
实验方法：从WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-中提取了nTregs，并用抗CD3/CD28包被的beads(细胞：beads＝1:1)，rhIL-2(300U/ml)培养3天。通过FACS检测Ki-67表达水平。
实验结果：结果如图7所示，TNFR2-/-Tregs表达的Ki-67水平最低，细胞状态最差，存活的细胞数目最少，而WT和TNFR1-/-Tregs能维持较好的细胞状态和细胞数目，表达高水平的Ki-67。
实施例7 iTregs体外抑制功能检测
实验方法：将用尼龙毛柱富集的T细胞20million用200ul CFSE(10uM)进行标记。
抗原提成细胞(antigen presenting cell，APC)来自于富集T细胞后尼龙毛柱里的细胞，用Co60γ射线30Gy处理使其灭活。收集诱导的iTregs，磁力架去除抗CD3/CD28包被的beads，洗两次去除培养基中的细胞因子。将CFSE标记的T细胞(Teffs，0.3×106个细胞/孔)，照光的APC(0.3×106个细胞/孔)，可溶性抗CD3抗体(0.025ug/ml)接种在平底96孔板中。Tregs抑制组加入与Teffs不同比例的iTregs。三天后通过使用流式细胞仪检测CD8+T细胞的增殖情况。
从WT、TNFR1-/-和TNFR2-/-小鼠脾脏中提取naive CD4+T细胞，诱导为iTregs，相同条件下进行了体外抑制实验。
实验结果：结果如图8所示，TNFR1-/-iTregs与WT iTregs相比抑制功能无显著差异，TNFR2-/-iTregs与WT iTregs相比抑制功能显著下降。
实施例8 iTregs体内抑制功能检测
实验方法：选取同为8周龄的健康雌性WT小鼠作为受试对象，随机分为4组，每组。在第一次免疫后第9天给每只小鼠通过腹腔注射诱导的WT,TNFR1-/-或者TNFR2-/-iTregs2million细胞(10million/ml,200ul)。空白对照组注射等体积的无菌PBS。收集来自脾，MLN，脑，脊髓的细胞。通过FACS确定Foxp3+、IL-17A+或IFNγ+T细胞的比例。部分脑和脊髓进行H&E染色。
实验结果：结果如图9所示，WT iTregs能够成功地抑制EAE病情，延迟EAE起病时间发作，改善症状，TNFR1-/-iTregs抑制功能较WT iTregs稍强，能够更好地抑制EAE病情，延迟EAE起病时间发作，改善症状，病理切片看到脊髓和脑中几乎没有炎症细胞累积。而TNFR2基因的敲除损伤了iTregs的抑制功能，流式细胞仪在脊髓和脑中检测到Th17+细胞显着增加，病理切片也可看到在脑和脊髓中有大量炎症细胞累积。
实施例9 TNFR1或TNFR2基因敲除对iTregs的TNFR1或TNFR2表达的影响
实验方法：接着发明人用流式细胞仪分别检测了TNFR1和TNFR2在WT、TNFR1-/-、TNFR2-/-iTregs上的表达水平。
实验结果：结果如图10所示，三种naive CD4+T细胞均表达低水平的TNFR1和TNFR2。在诱导成为iTregs后，TNFR1的表达水平变化不明显，而TNFR2的表达水平升高。而且，在TNFR1-/-iTregs表面上，TNFR2表达水平更高，而TNFR2-/-iTregs的TNFR1的表达水平升高。
实施例10 自身免疫病患者Tregs细胞表面的TNFR1和TNFR2的表达水平的变化
为了明确在多发性硬化患者和类风湿关节炎患者的CD4+Tregs的TNFR1和TNFR2水平与健康人相比是否有所不同。发明人收集健康人和MS患者的外周血，分离出外周血单核细胞。流式细胞仪检测Tregs上TNFR1和TNFR2的表达。
实验结果：结果如图11所示，发明人发现自健康人的Foxp3+T细胞表达低水平的TNFR1和高水平的TNFR2。而在多发性硬化患者和类风湿关节炎患者的Tregs表面，TNFR1水平显着升高，TNFR2水平下降超过一半。
这进一步证实了TNFR1对于引发或促进自身免疫性疾病中的炎症前反应是必需的；而在炎症状态下，Tregs表面的TNFR1表达水平升高，这可能导致其向炎症细胞分化或者趋于凋亡，使Tregs不能够维持足够的数目和功能有效地抑制自身免疫反应。
TNFR1主要介导炎症反应，而对Tregs的激活、扩增和抑制功能无影响，使得所述特异性TNFR1拮抗剂能够特异性阻断TNFR1信号介导的炎症反应，保留了TNFR2信号对Tregs的分化、扩增和抑制功能，更加适合用于治疗自身免疫性疾病，其的准确度和特异度进一步提高，避免了TNFα总抑制剂对机体造成的严重副作用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.TNFR1基因在制备和筛选治疗自身免疫性或炎症性疾病的药物中的应用。
2.TNFR1基因所编码的蛋白质在制备和筛选治疗自身免疫性或炎症性疾病的药物中的应用。
3.TNFR1特异性拮抗剂在制备治疗自身免疫性或炎症性疾病的药物中的应用。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为多发性硬化、类风湿关节炎、脑脊髓炎或结肠炎。
5.一种用于治疗自身免疫性或炎症性疾病的药物，其特征在于，所述药物含有TNFR1特异性拮抗剂。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物中含有能使TNFR1基因低表达的试剂。
7.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物中含有能降低TNFR1基因所编码的蛋白活性的试剂。
8.根据权利要求5～7任一项所述的药物，其特征在于，所述自身免疫性疾病为多发性硬化、类风湿关节炎、脑脊髓炎或结肠炎。
9.一种调节性T细胞表面的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物为TNFR1和TNFR2，在正常人的调节性T细胞表面，TNFR2的表达水平高于TNFR1；而在自身免疫性疾病患者的调节性T细胞表面，所述TNFR2的表达水平下降，而TNFR1的表达水平上升。
10.根据权利要求9所述的分子标志物，其特征在于，所述自身免疫性疾病为多发性硬化或类风湿关节炎。
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