CN107090023A - 一种选择性tnfr1拮抗肽sn10及其在类风湿性关节炎中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体是提供一种青环海蛇蛇毒来源的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin‑SN10，具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明还提供一种基于mPEG2000修饰的选择性TNFR1拮抗肽PEG‑SN10，通过mPEG2000的羧基与Hydrostatin‑SN10肽链N‑端天冬氨酸的游离氨基共价连接实现选择性修饰。同时，本发明提供选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin‑SN10和PEG‑SN10在预防和治疗类风湿性关节炎中的应用。

Description

一种选择性TNFR1拮抗肽SN10及其在类风湿性关节炎中的 应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种青环海蛇蛇毒来源的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10及其在类风湿性关节炎中的应用。
背景技术
类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎为特征的的慢性自身免疫性疾病。主要临床表现为小关节滑膜所致的关节肿痛，滑膜炎症和增生导致软骨和骨的侵蚀，关节间隙变窄，晚期因严重骨质破坏、吸收导致关节僵直、畸形、功能障碍。在美国，RA被认为是影响人类健康的五大疾病(心血管疾病，阿尔兹海默症，癌症，艾滋病，类风湿性关节炎)之一。RA在任何年龄均可发病，以20-50岁最多。全球大约有0.24％的人在遭受RA的折磨，有极高的致残率，预后不良(Cross,M.,Smith,E.,Hoy,D.,Carmona,L.,Wolfe,F.,Vos,T.,Williams,B.,Gabriel,S.,Lassere,M.,Johns,N.,Buchbinder,R.,Woolf,A.,March,L.,2014.The global burden of rheumatoid arthritis:estimatesfrom the global burden of disease 2010study.Ann.Rheum.Dis.73,1316–132.)。到目前为止，RA的发病机制并不明确，但遗传因素，环境因素都与疾病的发生发展密切相关。研究表明类风湿性关节炎的严重程度受炎性介质的影响较大，主要的炎性介质有肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-17(IL-17)以及白细胞介素-1(IL-1)等，其中TNF-α在RA的发病机制中起着非常重要的作用。当前，在类风湿性关节炎临床治疗中，针对TNF-α的药物如阿达木单抗，英夫利昔单抗等取得了很好的临床效果，不仅能够改善症状，还能够抑制关节的破坏。然而，这类抗TNF-α单抗药物因完全封闭了TNF-α的生物学功能，导致机体的免疫自稳、免疫监视功能受到影响，给患者带来了易发生结核病感染、产生新的自身免疫疾病甚至诱发肿瘤的风险。
TNF-α在机体内的过量表达及TNF-α/TNFRs信号通路的异常激活与类风湿关节炎等自身免疫性疾病的发生发展有着密切关系。随着对RA发病机制的研究深入，当前更多的研究是把治疗的靶点转向TNFRs。然而，相对于TNF-α单抗等生物制剂，TNFRs的小分子拮抗剂的基础和应用研究进展缓慢。总体上从抗炎角度来说，TNFR1主要传递促炎、凋亡信号，通过选择性地阻断TNFR1传递的信号通路来封闭TNF-α的生物学功能，已成为该类药物研发的热点。目前尚无一种具有高度选择性的TNFR1拮抗药物上市应用于临床。本课题组在前期工作基础中，生物淘选青环海蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库，获得了一种抗炎活性肽Hydrostatin-SN1(中国专利文献CN103030687A)。通过结构优化，获得候选肽Hydrostatin-SN10，采用BIAcore(基于表面等离子共振技术的生物大分子相互作用分析技术)和MST(微量热泳动)技术分析Hydrostatin-SN10与TNF-α、TNFR1、TNFR2之间的相互作用，证明Hydrostatin-SN10可直接与TNFR1结合，并且与TNF-α和TNFR2不结合，靶点特异，是一种选择性TNFR1拮抗肽。在专利文献CN103030687A中，公开了Hydrostatin-SN1能够治疗与TNF-α相关的疾病，并公开了TNF-α相关的疾病是类风湿性关节炎，根据在先申请公开的机理，并不能显而易见的推导出本发明Hydrostatin-SN10能够具有治疗类风湿性关节炎的用途。
然而，单纯的小分子多肽，其相对分子质量较小，在体内极易被肾小球快速滤过以及被相关蛋白酶降解，稳定性差，血浆半衰期很短，无法正常发挥其生物功能，难以达到有效治疗效果，这在一定程度上制约了它的发展和应用。为了解决这一问题，对多肽药物进行改造修饰或与其他材料融合来提高其稳定性已经成为生物医药领域的研究热点。目前用作多肽和蛋白质的化学修饰剂很多，而单甲氧基聚乙二醇(mPEG)及其衍生物是应用最广泛的修饰剂之一。采用PEG修饰的优势主要有：1、改善药代动力学特性，延长血浆半衰期；2、增加溶解度和稳定性(热稳定性、抗酸碱能力、抗变性剂能力及抗蛋白酶水解能力)；3、降低免疫原性和毒性；4、提高体内的生物活性。目前已有多种PEG化的蛋白质和多肽类药物被批准进入临床应用，如PEG-TNF-α抗体Fab片段、PEG-促红细胞生成多肽等。因此，我们在前期工作的基础上，对Hydrostatin-SN10进行结构修饰，获得本发明产物PEG-SN10，本发明着重研究PEG-SN10在类风湿性关节炎中的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种青环海蛇蛇毒来源的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10及其在类风湿性关节炎中的应用，本发明的另一目的在于提供一种基于mPEG2000(单甲氧基聚乙二醇2000)修饰的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10，即PEG-SN10在类风湿性关节炎中的应用。
本发明人所在课题组(江海龙，中国人民解放军第二军医大学2015年硕士学位论文，海蛇蛇毒抗炎活性肽Hydrostatin-SN1的结构优化和抗炎机制研究)通过将Hydrostatin-SN1(22AA)截短，得到Hydrostatin-SN10(10AA)，利用表面等离子共振技术(SPR)发现其能与TNFR1结合，结合能力约为KD＝2.8μM，高于Hydrostatin-SN1与TNFR1的结合能力(KD＝32μM)，然而，是否选择性拮抗TNFR1不清楚；动物模型结果表明其具有一定的抗炎活性。
本发明的主要技术方案是：通过建立牛Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎(CIA)动物模型，证明Hydrostatin-SN10及PEG-SN10具有治疗类风湿性关节炎的用途。
本发明的第一方面，提供一种选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10，所述的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
所述的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10，其合成方法为：利用固相合成技术合成Hydrostatin-SN10，并以HPLC及MS分析其纯度和分子量，分子量为1250.29道尔顿，等电点为4.39。
本发明的第二方面，提供一种选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第三方面，提供上述的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10在制备预防和治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
优选的，所述的预防或治疗类风湿性关节炎的药物为：以选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10为唯一的活性成分，或包含选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10的药物组合物。
本发明的第四方面，提供一种基于mPEG2000(单甲氧基聚乙二醇2000)修饰的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10，即PEG-SN10，所述的mPEG2000的羧基共价连接至Hydrostatin-SN10肽链N-端天冬氨酸的游离氨基上。用平均分子量约2000道尔顿的mPEG(单甲氧基聚乙二醇)修饰Hydrostatin-SN10能增加Hydrostatin-SN10的半衰期和稳定性。所述的mPEG2000的结构简式可表示为：CH3O-(CH2CH2O)n-COOH，其中所述n为聚合度，n＝35～45，其平均分子量为2000道尔顿。
本发明的第五方面，提供上述的基于mPEG2000修饰的选择性TNFR1拮抗肽PEG-SN10在制备预防和治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
优选的，所述的预防和治疗类风湿性关节炎的药物为：以PEG-SN10为唯一的活性成分，或包含PEG-SN10的药物组合物。
优选的，所述的药物组合物和药剂学上的常规药用辅料制成药物制剂。
优选的，所述的药物制剂是片剂、颗粒剂、分散剂、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、注射剂、粉针剂或气雾剂等。
优选的，上述的预防和治疗类风湿性关节炎的药物选择性拮抗TNFR1。
本发明采用BIAcore(基于表面等离子共振技术的生物大分子相互作用分析技术)和MST(微量热泳动)技术分析Hydrostatin-SN10与TNF-α、TNFR1、TNFR2之间的相互作用，证明Hydrostatin-SN10可直接与TNFR1结合，并且与TNF-α和TNFR2不结合。本发明采用牛Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎动物模型，观察本发明提供的多肽的治疗作用。结果显示Hydrostatin-SN10及PEG-SN10腹腔注射给药后，Hydrostatin-SN10及PEG-SN10能够有效降低CIA小鼠的关节炎指数；显著降低CIA小鼠血清中胶原特异性抗体IgG及促炎因子IL-17、TNF-α、IL-6、IFN-γ的水平且显著提高抑炎因子IL-10的水平，通过炎症因子的作用发挥抗炎作用；通过micro-CT扫描，可显著改善小鼠骨小梁骨质破坏程度，从骨质破坏角度观察Hydrostatin-SN10及PEG-SN10具有显著的抗炎效果；可显著改善CIA小鼠的关节损伤，滑膜增生和炎性细胞浸润且能够显著减少关节中TNF-α的表达量，显著减少破骨细胞的数量，从关节病理角度观察具有显著的抗炎效果；Hydrostatin-SN10及PEG-SN10能够调节Th1/Th2及Th17/Treg比例失衡，即Hydrostatin-SN10及PEG-SN10可以通过免疫调节发挥抗类风湿性关节炎的作用。
上述研究结果表明，选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10及PEG-SN10均具有良好的抗类风湿性关节炎的作用。本发明寻找到了有效防治类风湿性关节炎的药物。
附图说明
图1 Hydrostatin-SN10的HPLC分析结果。
图2 Hydrostatin-SN10的MS分析结果。
图3采用BIAcore(SPR技术)分析Hydrostatin-SN10与TNFR1的结合能力；其中，A、SN10与TNFR1的相互作用，结合解离常数KD值约为2.8μM；B、SN10与TNF-α的相互作用，不结合；C、SN10对TNF-α-TNFR1结合的竞争性抑制作用(TNFR1在芯片上)；D、SN10对TNF-α-TNFR1结合的竞争性抑制作用(TNF-α在芯片上)；E、SN10对TNF-α-TNFR2结合的竞争性抑制作用。
图4是采用MST技术分析Hydrostatin-SN10与TNFR1的结合能力；其中，A、SN10与TNFR1的相互作用，结合解离常数KD值约为2.8μM；B、SN10与TNF-α的相互作用，不结合；C、SN10与TNFR2的相互作用，不结合；D、SN10对TNFR1-TNF-α结合的竞争性抑制作用，(TNFR1荧光标记)；E、SN10对TNFR1-TNF-α结合的竞争性抑制作用，(TNF-α荧光标记)；F、SN10对TNFR2-TNF-α结合的竞争性抑制作用，(TNFR2荧光标记)。
图5.Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对CIA小鼠脚掌肿胀的改善情况。
图6.Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对CIA小鼠临床评分的改善情况。
图7.Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对CIA小鼠胶原特异性抗体IgG及血清中炎症因子的影响(n＝6)。
图8.Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对CIA小鼠后肢关节的影响(n＝12)。
图9.Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对CIA小鼠骨小梁的影响(n＝12)。
图10.Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对CIA小鼠骨小梁参数的影响(n＝12)。
图11.Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对CIA小鼠踝关节病变的影响，组织切片HE染色光镜图，其中A为正常组，B为模型组，C为Hydrostatin-SN10，D为PEG-SN10，E为英夫利昔单抗组。
图12.Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对CIA小鼠TNF-α表达量的影响，其中A为正常组，B为模型组，C为Hydrostatin-SN10，D为PEG-SN10，E为英夫利昔单抗组。
图13.Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对CIA小鼠TRAP表达量的影响，其中A为正常组，B为模型组，C为Hydrostatin-SN10，D PEG-SN10，E为英夫利昔单抗组。
图14.Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对CIA小鼠Treg细胞中Foxp3表达量的影响(n＝6)。
图15.Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对CIA小鼠Treg细胞中Foxp3表达量的影响(n＝6)。
图16.Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对CIA小鼠T细胞中Th1，Th2，Th17的百分比的影响(n＝6)。
图17.Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对CIA小鼠T细胞中Th1，Th2，Th17的百分比的影响(n＝6)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
用实施例1制得的Hydrostatin-SN10进行实施例2-5的实验。以下实施例中所用PEG-SN10，由强耀生物科技有限公司合成，经HPLC检测纯度≥98％。
实施例1：青环海蛇选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10的合成
以固相多肽合成技术合成Hydrostatin-SN10，并以HPLC(图1)和MS(图2)分析其纯度及分子量，结果可知其纯度>97％，分子量为1250.29g/mol。
实施例2：BIAcore分析Hydrostatin-SN10与TNFR1的结合能力。
1、running buffer以10μl/min的流速流过CM-5传感芯片中设定的通道，直至达到基线水平。
2、用仪器推荐的buffer活化芯片各通道的表面反应基团。
3、用EP buffer溶解TNFR1和TNFR2冻干粉，按一定的浓度进样，使之包被于芯片表面，再用1mol/L乙醇胺封闭芯片。测定动力学曲线前要对再生条件进行测试，以选择合适的再生条件。
4、当running buffer跑至基线稳定后，将系列浓度的多肽进样，中间浓度的多肽重复进样一次，记录每个浓度的响应值。
如图3所示，Hydrostatin-SN10能与TNFR1直接相互作用，与TNFR1的结合能力约为2.8μM；Hydrostatin-SN10与TNF-α不结合，并能够竞争性抑制TNFR1与TNF-α的相互作用。
实施例3：MST分析Hydrostatin-SN10与TNFR1的结合能力。
1、Hydrostatin-SN10与TNF-α、TNFR1、TNFR2的相互作用：
以1:1稀释比例配制系列梯度浓度的Hydrostatin-SN10，将等体积的荧光标记TNF-α/TNFR1/TNFR2 200nM与Hydrostatin-SN10均匀混合后避光孵育30min，用毛细吸管吸取适量的样品上机检测，观察相对荧光值的时间轨迹和热泳动Thermophoresis的剂量-响应曲线，并通过软件NTAffinityAnalysis v2.0.2拟合计算亲和力KD值，判断是否有特异性结合趋势。
2、Hydrostatin-SN10对TNF-α与TNFR1/TNFR2结合的竞争性抑制作用：
以1:1稀释比例配制系列梯度浓度的TNF-α，将等体积的荧光标记TNFR1/TNFR2200nM与TNF-α均匀混合后避光孵育30min，用毛细吸管吸取适量的样品上机检测，软件拟合求出阳性对照TNFR1/TNFR2与TNF-α的KD值；将400nM TNFR1和400μM Hydrostatin-SN10等体积混合后，再与系列浓度的TNF-α等体积混合孵育30min，用毛细吸管吸取适量的样品上机检测，软件拟合求出KD值。比较加入Hydrostatin-SN10前后TNF-α饱和浓度、响应值amplitude及亲和力常数KD值的变化。
3、Hydrostatin-SN10对TNF-α与TNFR1/TNFR2结合的竞争性抑制作用(方法同2)。
如图4所示，MST实验结果表明，Hydrostatin-SN10靶点特异，能与TNFR1直接相互作用，与TNFR1的结合能力约为2.8μM；且只与TNFR1结合，具有选择性，而不与TNF-α、TNFR2结合，能竞争性抑制TNFR1和TNF-α的相互作用。
实施例4：Hydrostatin-SN10和PEG-SN10在SD大鼠体内的血浆半衰期检测。
采用购自Genzyme公司的ELISA试剂盒，根据产品说明书进行测定。血清样品用肝素化的50μL毛细管从后眶内采集，在处理后的1min、2min、3min、5min、10min、15min、20min、30min、45min、1h、2h、4h、6h、8h收集血液样品。静置2h后，将样品离心，把得到的上清液贮存在-20℃以备检测。
表1
如表1所示，结果表明，PEG修饰后PEG-SN10比Hydrostatin-SN10的血浆半衰期延长。
实施例5：Hydrostatin-SN10及PEG-SN10对类风湿性关节炎的治疗作用
一、实验动物
DBA/1小鼠，雄性，8～10周，体重18～20g，30只。
二、主要试剂
牛Ⅱ型胶原(Bovine TypeⅡCollagen，Chondrex)、完全弗氏佐剂(CompleteFreund's Adjuvant，Chondrex)、不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund's Adjuvant，Chondrex)、辣根过氧化物酶标记的IgG抗体，(Ebioscience)、小鼠IL-17ELISA检测试剂盒(Ebioscience)、小鼠LEGENDplexTM多因子(TNF-α，IL-6，IL-10，IFN-γ)流式检测试剂盒(Biolegend，美国)、True-NuclearTM Mouse Treg FlowTM Kit(FOXP3Alexa488/CD4APC/CD25PE)(Biolegend，美国)、FITC anti-mouse CD3(Biolegend，美国)、PE/Cy7anti-mouse CD4(Biolegend，美国)、PerCP/Cy5.5anti-mouse IFN-γ(Biolegend，美国)、PE/DazzleTM 594 anti-mouse IL-4(Biolegend，美国)、Alexa647anti-mouseIL-17A(Biolegend，美国)、FOXP3Fix/Perm Buffer(4x)(Biolegend，美国)。
三、实验方法
DBA/1小鼠适应3天后，编号称重，开始造模。随机取6只作为正常组，其余为实验组。
第0天：取牛Ⅱ型胶原(4mg/ml)与等体积CFA(4mg/ml)涡旋混合，至滴于水上不分散为较好，小鼠尾根部皮内注射100ul/只。
第21天：取牛Ⅱ型胶原(4mg/ml)与等体积IFA(4mg/ml)涡旋混合至滴于水上不分散为较好，小鼠尾根部皮内注射100ul/只。第30天观察造模成功，模型组(PBS)，给药组-SN10(1600ug/kg)，给药组PEG-SN10(1600ug/kg)，英夫利昔单抗(4mg/kg)当天开始腹腔注射给药，每日1次，连续给药18天。
四、试验结果
采用Graphpad Prism 5对数据进行One-Way ANOVA统计学分析P<0.05时认为差异有统计学意义。“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001。
1.Hydrostatin-SN10、PEG-SN10对小鼠关节炎指数评分的影响。
如图5，图6所示，初次免疫29天，各组小鼠关节炎指数逐渐增高即炎症逐渐加重，随着时间的延长，小鼠后肢肿胀程度逐渐消退，但关节出现强直或畸形，达到最高评分。与模型组相比，给药组Hydrostatin-SN10及PEG-SN10关节炎指数均有所减轻，同时病情发展减缓。
2.Hydrostatin-SN10、PEG-SN10对CIA小鼠血清中胶原特异性抗体及炎症因子的影响
用ELISA试剂盒及多因子试剂盒测定各组小鼠血清中的胶原特异性抗体IgG及促炎因子IL-17，TNF-α，IL-6，IFN-γ及抑炎因子IL-10的含量，各组含量如图7所示：与正常对照组相比，模型组小鼠血清中胶原特异性抗体IgG及促炎因子IL-17，TNF-α，IL-6，IFN-γ的含量显著高于正常组，而抑炎因子IL-10的含量与正常组无差异。与模型组相比，给药组Hydrostatin-SN10、PEG-SN10均能显著降低血清中胶原特异性抗体IgG及促炎因子IL-17，TNF-α，IL-6，IFN-γ的含量且显著升高抑炎因子IL-10的含量。
3.Micro-CT检测Hydrostatin-SN10、PEG-SN10对CIA小鼠骨质破坏的影响
如图8所示：小鼠后肢Micro-CT检查结果表明，正常组关节面光滑，关节结构清晰可见；CIA模型组关节面粗糙，骨质破坏严重；而给药组Hydrostatin-SN10、PEG-SN10及阳性药英夫利昔单抗骨质破坏程度显著减轻。
如图9所示：小鼠骨小梁Micro-CT结果显示正常组骨小梁结构完整，而CIA模型组与正常组相比骨质破坏严重，有明显空洞；与模型组相比，Hydrostatin-SN10、PEG-SN10及阳性药英夫利昔单抗骨质破坏程度明显减轻。
图10所示，骨小梁的测定结果显示：通过分析骨密度(BMD)、骨体积/组织体积(BV/TV)、骨面积/组织体积(BS/TV)、小梁的数量(Th.N)、小梁厚度(Tb.Th)、骨表面积/骨体积(BS/BV)、骨小梁的模式因子(Tb.pf)、小梁的分离度(Tb.sp)等骨参数，分析Hydrostatin-SN10、PEG-SN10对骨质破坏的缓解情况。结果表明与正常组相比，模型组骨密度(BMD)、骨体积/组织体积(BV/TV)、骨面积/组织体积(BS/TV)、小梁的数量(Th.N)、小梁厚度(Tb.Th)等参数显著下调，骨表面积/骨体积(BS/BV)、骨小梁的模式因子(Tb.pf)、小梁的分离度(Tb.sp)等参数显著上调；与模型组相比，Hydrostatin-SN10及PEG-SN10组骨密度(BMD)、骨体积/组织体积(BV/TV)、骨面积/组织体积(BS/TV)、小梁的数量(Th.N)、小梁厚度(Tb.Th)等参数显著上调，骨表面积/骨体积(BS/BV)、骨小梁的模式因子(Tb.pf)、小梁的分离度(Tb.sp)等参数显著下调。
4.HE染色观察Hydrostatin-SN10、PEG-SN10对CIA小鼠关节破坏的影响
如图11所示，小鼠关节HE染色结果表明，正常组小鼠关节囊滑膜组织完整，纤维膜清晰可见，囊腔内未见渗出，滑膜、滑膜下组织未见明显炎症细胞浸润；CIA模型组可见关节结构破坏严重，滑膜增生，软骨损伤严重，严重的炎性细胞浸润；而给药组Hydrostatin-SN10可见关节结构完整，滑膜增生严重且较严重的炎性细胞浸润。而PEG-SN10及英夫利昔单抗可见关节结构完整及微弱的炎性细胞浸润，关节损伤显著减弱。
5.免疫组化观察Hydrostatin-SN10、PEG-SN10对CIA小鼠TNF-α表达量的影响
前期结果显示，Hydrostatin-SN10靶点特异，能够与TNFR1特异性结合，而不与TNF-α、TNFR2结合，且Hydrostatin-SN10能够竞争性抑制TNF-α与TNFR1的结合。从而减少TNF-α的表达量，如图12所示，与正常组相比，模型组TNF-α的表达量增加；与模型组相比，Hydrostatin-SN10、PEG-SN10关节中TNF-α的表达量减少。
6.TRAP染色观察Hydrostatin-SN10、PEG-SN10的对关节中破骨细胞的影响
破骨细胞是骨组织成分的一种，行使骨吸收的功能。破骨细胞与成骨细胞在功能上相对应。抗酒石酸磷酸酶即TRAP为破骨细胞的特异性标志酶，其表达和分泌与破骨细胞的分化及功能具有重要的关系。如图13所示，与正常组相比，CIA模型组小鼠抗酒石酸磷酸酶明显增多；与模型组相比，Hydrostatin-SN10、PEG-SN10能够减少抗酒石酸磷酸酶的含量，减少破骨细胞的数量，从而减少对骨组织的侵蚀。
7.Hydrostatin-SN10、PEG-SN10对CIA小鼠Treg细胞中Foxp3表达量的影响
Treg细胞是一种特殊的免疫调节细胞，具有免疫无反应性和免疫抑制性两大功能特征。可通过细胞间直接接触和分泌抑制性细胞因子等抑制B细胞、T细胞等免疫细胞的活性和功能，对于防止自身免疫性疾病具有极其重要的作用。
证据表明，RA患者体内存在Treg细胞数量的改变，提示Treg细胞的异常与RA的发生发展密切相关。Foxp3在Treg细胞中特异性表达，对Treg的增殖和功能起重要作用，故Foxp3可以作为Treg的生物标志物。如图14和图15所示：与模型组相比，Hydrostatin-SN10、PEG-SN10及英夫利昔单抗组Fxop3的表达量均显著提高，即Treg细胞的数量提高，免疫抑制作用明显加强，从而抑制类风湿性关节炎的发生发展。
8.Hydrostatin-SN10、PEG-SN10对CIA小鼠脾脏中Th1，Th2，Th17的表达量的影响
Th1：主要分泌IFN-γ，主要介导细胞免疫应答，诱导炎性因子的产生，巨噬细胞活化等，主要诱导自身免疫疾病的产生；Th2：主要分泌IL-4，主要介导体液免疫，抑制单核细胞，促进炎性细胞因子的释放。且Th1/Th2比例失衡在RA发病机制中起着重要的作用。
研究表明：Th17细胞高分泌IL-17，通过刺激FLS分泌基质金属蛋白酶-1，IL-1β，TNF-α等协调诱导NF-κB受体激活因子配体等参与RA的骨质破坏和组织的炎性损伤。通过测定脾细胞中辅助性T细胞的表达，观察其作用。如图16和图17所示，与模型组相比，Hydrostatin-SN10、PEG-SN10及英夫利昔单抗组IFN-γ，IL-17的表达量显著下调，IL-4的表达量上调，即Hydrostatin-SN10、PEG-SN10可能是通过调节Th1，Th2，Th17的变化，抑制炎症因子的表达和释放，减少对骨质的破坏。
以上结果表明，Hydrostatin-SN10和PEG-SN10能够有效治疗Ⅱ型胶原诱导的小鼠类风湿性关节炎动物模型。
以上已对本发明创造的实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 陆一鸣
<120> 一种选择性TNFR1拮抗肽SN10及其在类风湿性关节炎中的应用
<130> /
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gacgaacaac acctagagac cgaactacac 30
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Asp Glu Gln His Leu Glu Thr Glu Leu His
1 5 10

Claims (9)

1.一种选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10在制备预防和治疗类风湿性关节炎的药物中的应用，所述的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示；所述的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10的分子量为1250.29道尔顿。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的预防和治疗类风湿性关节炎的药物选择性拮抗TNFR1。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的预防或治疗类风湿性关节炎的药物为：以选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10为唯一的活性成分，或包含选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10的药物组合物。
5.一种基于mPEG2000修饰的选择性TNFR1拮抗肽PEG-SN10在制备预防或治疗类风湿性关节炎的药物中的应用，其特征在于，所述的mPEG2000的羧基共价连接至Hydrostatin-SN10肽链N-端天冬氨酸的游离氨基上，所述的Hydrostatin-SN10的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的mPEG2000的平均分子量为2000道尔顿。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的预防和治疗类风湿性关节炎的药物为：以PEG-SN10为唯一的活性成分，或包含PEG-SN10的药物组合物。
8.根据权利要求4或7所述的应用，其特征在于，所述的药物组合物和药剂学上的常规药用辅料制成药物制剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的药物制剂是片剂、颗粒剂、分散剂、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、注射剂、粉针剂或气雾剂。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018171405A1 (zh) * 2017-03-23 2018-09-27 桂林八加一药业股份有限公司 一种选择性tnfr1拮抗肽sn10及其在炎症性肠病中的应用
WO2018171406A1 (zh) * 2017-03-23 2018-09-27 桂林八加一药业股份有限公司 选择性tnfr1拮抗肽在制备预防和治疗类风湿性关节炎的药物中的应用
CN108926720A (zh) * 2018-07-16 2018-12-04 中山大学附属第三医院（中山大学肝脏病医院） Tnfr1基因及其编码蛋白的应用
CN111763244A (zh) * 2020-06-24 2020-10-13 上海大学 青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN61及其编码基因和在制药中的应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6683608B2 (ja) 2013-12-19 2020-04-22 イルミナ インコーポレイテッド ナノパターン化表面を含む基材およびその調製方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10316570A (ja) * 1997-05-13 1998-12-02 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd ＴＮＦ−α誘導効果阻害剤
EP1222925A2 (en) * 2000-12-18 2002-07-17 Meiji Dairies Corporation Kavalactone as TNF-alpha production inhibitor
CN102229654A (zh) * 2009-10-23 2011-11-02 山东省医药生物技术研究中心 抗类风湿性关节炎的多肽及其在制药中的应用
CN103030687B (zh) * 2013-01-10 2014-02-12 中国人民解放军第二军医大学 青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN1及其编码基因和在制药中的应用
CN105031608A (zh) * 2015-06-23 2015-11-11 丁兆明 一种txndc5短肽在制备抗类风湿性关节炎药物中的应用
US9399061B2 (en) * 2006-04-10 2016-07-26 Abbvie Biotechnology Ltd Methods for determining efficacy of TNF-α inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2010237046B2 (en) * 2009-04-17 2015-06-04 New York University Peptides targeting TNF family receptors and antagonizing TNF action, compositions, methods and uses thereof
WO2015104322A1 (en) * 2014-01-09 2015-07-16 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Treatment of inflammatory diseases with non-competitive tnfr1 antagonists
CN107090023B (zh) * 2017-03-23 2020-06-05 桂林八加一药业股份有限公司 一种选择性tnfr1拮抗肽sn10及其在类风湿性关节炎中的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10316570A (ja) * 1997-05-13 1998-12-02 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd ＴＮＦ−α誘導効果阻害剤
EP1222925A2 (en) * 2000-12-18 2002-07-17 Meiji Dairies Corporation Kavalactone as TNF-alpha production inhibitor
US9399061B2 (en) * 2006-04-10 2016-07-26 Abbvie Biotechnology Ltd Methods for determining efficacy of TNF-α inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis
CN102229654A (zh) * 2009-10-23 2011-11-02 山东省医药生物技术研究中心 抗类风湿性关节炎的多肽及其在制药中的应用
CN103030687B (zh) * 2013-01-10 2014-02-12 中国人民解放军第二军医大学 青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN1及其编码基因和在制药中的应用
CN105031608A (zh) * 2015-06-23 2015-11-11 丁兆明 一种txndc5短肽在制备抗类风湿性关节炎药物中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZENGJIE Z. ET AL.: "Screening of an anti-infammatory peptide from Hydrophis cyanocinctus and analysis of its activities and mechanism in DSS-induced acute colitis", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
陈如平等: "类风湿性关节炎中肿瘤坏死因子α的表达及意义", 《医学综述》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018171405A1 (zh) * 2017-03-23 2018-09-27 桂林八加一药业股份有限公司 一种选择性tnfr1拮抗肽sn10及其在炎症性肠病中的应用
WO2018171406A1 (zh) * 2017-03-23 2018-09-27 桂林八加一药业股份有限公司 选择性tnfr1拮抗肽在制备预防和治疗类风湿性关节炎的药物中的应用
CN108926720A (zh) * 2018-07-16 2018-12-04 中山大学附属第三医院（中山大学肝脏病医院） Tnfr1基因及其编码蛋白的应用
CN111763244A (zh) * 2020-06-24 2020-10-13 上海大学 青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN61及其编码基因和在制药中的应用
CN111763244B (zh) * 2020-06-24 2022-04-05 上海大学 青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN61及其编码基因和在制药中的应用

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